于兆進(jìn)，何苗，孫明立，趙海山，魏敏杰，趙琳

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽 110122）

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌中Ezrin相關(guān)的上皮鈣黏蛋白表達(dá)亞細(xì)胞定位的臨床意義

于兆進(jìn)，何苗，孫明立，趙海山，魏敏杰，趙琳

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽 110122）

目的探討Ezrin與上皮鈣黏蛋白（E?cad）表達(dá)部位的相關(guān)性及其對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征的影響。方法收集淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌組織樣本94例，采用免疫組化方法檢測Ezrin和E?cad的表達(dá)情況。結(jié)果E?cad和Ezrin陽性表達(dá)率分別為45.7%和58.5%；E?cad表達(dá)于細(xì)胞膜者（E?cadm）20例，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)者（E?cadc）23例；與Ezrin陰性組織相比，Ezrin陽性組織中E?cadc表達(dá)頻率顯著增高（P=0.025）；在TNM分期較高（Ⅱ～Ⅲ）的組織中E?cad表達(dá)水平顯著降低（P=0.001）；在較大的腫瘤組織中，Ezrin表達(dá)水平顯著增高（P=0.036），E?cadc表達(dá)頻率顯著高于E?cadm（P=0.013）；與E?cad（+）、Ezrin（-）、E?cadm組織相比，E?cad（-）、Ezrin（+）、E?cadc組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著增多（P＜0.05）；乳腺癌組織特征按照E?cad（+）/Ezrin（-）、E?cad（-）/ Ezrin（-）、E?cad（+）/Ezrin（+）、E?cad（-）/Ezrin（+）的順序（P＜0.001），或者E?cadm/Ezrin（-）、E?cadc/Ezrin（-）、E?cadm/Ezrin（+）、E?cadc/Ezrin（+）的順序（P=0.007），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目均依次增多。結(jié)論在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，Ezrin可能調(diào)節(jié)E?cad的亞細(xì)胞定位，從而協(xié)同影響乳腺癌病程，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

Ezrin；上皮鈣黏蛋白；亞細(xì)胞定位；乳腺癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

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乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢。近年來，雖然乳腺癌的治療取得了較大進(jìn)展，但乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移依然嚴(yán)重影響其治療效果及預(yù)后。因此對(duì)影響乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移因素的研究具有重要意義。

上皮鈣黏蛋白（E?cadherin，E?cad）是維持上皮細(xì)胞間鏈接的鈣黏素家族成員，其表達(dá)下調(diào)參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［1?2］。Ezrin是ERM蛋白家族成員之一［3］，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，因此被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［4?5］。PUJUGUET等［6］研究認(rèn)為，Ezrin可以促使E?cad從細(xì)胞膜募集到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制E?cad的作用，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。目前，在乳腺癌組織中，關(guān)于Ezrin與E?cad表達(dá)部位和乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究采用免疫組化法檢測了94例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的散發(fā)性乳腺癌組織中Ezrin和E?cad的表達(dá)情況，并分析二者表達(dá)水平的相關(guān)性，以及二者表達(dá)水平與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床資料的相關(guān)性，以探討Ezrin與E?cad表達(dá)部位的相關(guān)性，及對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征的影響。

1　　材料與方法

1.1研究對(duì)象

在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科病房2006年至2007年收治的女性乳腺癌患者中，選取病理檢查為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者，收集組織樣本共94例，-80℃冰凍保存?；颊咝g(shù)前均未接受放療或化療，以WHO標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行組織學(xué)判定。

本研究94例女性乳腺癌患者中，導(dǎo)管癌75例，小葉癌13例，其他類型癌（黏液癌、髓樣癌、篩狀癌）6例；患者年齡32～79歲，平均年齡（51.2±9.2）歲，其中≤50歲者44例（46.8%），＞50歲者50例（53.2%）；有44例（49.4%）已絕經(jīng)；腫瘤組織塊最大徑＞2.0 cm 者37例（47.4%），≤2.0 cm者41例（52.6%）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目1～27個(gè)；患者采用TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ期1例（1.5%），Ⅱ期40例（59.7%），Ⅲ期26例（38.8%）；腫瘤組織分級(jí)Ⅰ級(jí)者43例（47.8%），Ⅱ～Ⅲ級(jí)者47例（52.2%）。上述乳腺癌患者臨床資料在部分病例中存在缺失。

1.2免疫組化檢測

冰凍組織經(jīng)室溫解凍后，以4%多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟包埋組織塊，切4 μm厚組織切片，固定在防脫載玻片上。然后依次經(jīng)二甲苯脫蠟，降梯度乙醇脫苯、水化。將組織切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），80 kPa高壓修復(fù)10 min。組織切片經(jīng)3%過氧化氫或甲醇及10%非免疫性正常山羊血清處理后，滴加鼠抗人E?cad、Ezrin單克隆抗體（E?cad，ab1416，1∶100稀釋；Ezrin，ab4069，1∶100稀釋；Abcam，UK）4℃孵育過夜。次日組織切片先后經(jīng)生物素標(biāo)記的二抗（1∶200稀釋）和鏈霉菌抗生物素蛋白-辣根過氧化酶復(fù)合物（LSAB kit；Dako，Glostrup，Denmark）孵育，然后滴加新鮮配制的DAB （3，3?diaminobenzidine）溶液顯色。最后，切片經(jīng)蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后觀察。同步操作陰性對(duì)照，采用PBS液代替E?cad、Ez?rin等抗體，其他步驟不變。

免疫組化染色結(jié)果的評(píng)判：組織切片組化染色結(jié)果由2位有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)生進(jìn)行盲法評(píng)價(jià)。E?cad表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，Ezrin表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。參照GILLETT等［7］的方法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。對(duì)細(xì)胞膜染色強(qiáng)度計(jì)分，無染色計(jì)為0分，稀疏散在的染色計(jì)為1分，中度至重度染色且易于辨認(rèn)未染色細(xì)胞計(jì)為2分，重度染色且各細(xì)胞連成一體計(jì)為3分；細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度計(jì)分為：無染色計(jì)為0分，弱陽性計(jì)為1分，中等強(qiáng)度計(jì)為2分，強(qiáng)陽性計(jì)為3分。為便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，染色強(qiáng)度0～1分定義為陰性表達(dá)，染色強(qiáng)度2～3分定義為陽性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，Ezrin、E?cad表達(dá)水平及其與乳腺癌臨床資料相關(guān)性采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行分析，應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析Ezrin與E?cad的相關(guān)性，應(yīng)用Wilcox?on秩和檢驗(yàn)及Kruskal?WallisHtest法分析不同組別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌組織中Ezrin和E?cad的表達(dá)和相關(guān)性

應(yīng)用免疫組化法檢測了Ezrin和E?cad的表達(dá)情況，2種蛋白在乳腺癌組織中的陽性染色見圖1。94例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌組織中，Ezrin陽性表達(dá)率為58.5%（55/94）；E?cad陽性表達(dá)率為45.7%（43/ 94），其中表達(dá)于細(xì)胞膜者（E?cadm）20例（46.5%），表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)者（E?cadc）23例（53.5%）。

應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析E?cad，Ezrin表達(dá)水平之間的相關(guān)性，結(jié)果提示無顯著相關(guān)性。進(jìn)一步分析Ezrin表達(dá)與E?cad表達(dá)部位的相關(guān)性（圖2），發(fā)現(xiàn)在Ezrin陰性表達(dá)的組織中E?cadm表達(dá)12例（66.7%），E?cadc表達(dá)6例（33.3%），在Ezrin陽性表達(dá)的組織中E?cadm表達(dá)8例（32.0%），E?cadc表達(dá)17例（68.0%）。應(yīng)用Pearson χ2檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與Ezrin陰性的組織相比，Ezrin陽性的組織中E?cadc表達(dá)頻率顯著增高（P=0.025）。

圖1　　淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌組織中Ezrin和E?cad免疫組化染色 ×400Fig.1　Immunohistochemical staining of Ezrin and E?cad in nodes positive breast cancer tissues×400

2.2Ezrin和E?cad表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌臨床資料的相關(guān)性

采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析E?cad和Ezrin表達(dá)與乳腺癌患者臨床資料的相關(guān)性（表1），發(fā)現(xiàn)與TNMⅠ期的乳腺癌相比，在TNM分期較高（Ⅱ～Ⅲ）的乳腺癌組織中E?cad表達(dá)水平顯著降低（P=0.001）；在最大徑＞2.0 cm的腫瘤組織中，Ezrin表達(dá)水平顯著增高（P=0.036），E?cadc表達(dá)頻率顯著高于E?cadm（P=0.013）。E?cad和Ezrin表達(dá)與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤類型、組織學(xué)分級(jí)等其他臨床資料均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

2.3Ezrin和E?cad表達(dá)對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的影響

應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)及Kruskal?WallisHtest法，本研究分析了Ezrin和E?cad表達(dá)對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的影響（圖3）。發(fā)現(xiàn)與E?cad陽性組織相比，E?cad陰性組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著增多（P=0.011，圖3A）；與Ezrin陰性組織相比，Ezrin陽性組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著增多（P=0.002，圖3B），與E?cadm的組織相比，E?cadc的組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著增多（P=0.020，圖3C）；此外，乳腺癌組織按照E?cad（+）/Ezrin（-）、E?cad（-）/Ezrin（-）、E?cad（+）/Ezrin（+）、E?cad（-）/Ezrin（+）4個(gè)分組的順序，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目依次增多且差異顯著（P＜ 0.001，圖3D）；與之類似，按照E?cadm/Ezrin（-）、E?cadc/Ezrin（-）、E?cadm/Ezrin（+）、E?cadc/Ezrin（+）組織的順序，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目依次增多且差異顯著（P=0.007，圖3E）。

圖2　　不同Ezrin表達(dá)水平的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌組織中E?cadherin表達(dá)部位的比較Fig.2　Comparison of E?cadherin localization in nodes positive breast cancer tissues with different Ezrin expression level

3　　討論

相對(duì)于已有的研究［8-9］，本研究選擇了94例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性散發(fā)性乳腺癌進(jìn)行E?cad和Ezrin表達(dá)水平的檢測，并深入分析了Ezrin與E?cad表達(dá)亞細(xì)胞定位的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)E?cad表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，Ezrin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。此外，與Ezrin陰性的組織相比，Ezrin陽性的組織中E?cadc表達(dá)頻率顯著增高，提示乳腺癌中Ezrin可促使E?cad由胞膜表達(dá)轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)表達(dá)，這與ELLIOTT等［10］和PUJUGUET等［6］的報(bào)道一致。因此，在乳腺癌中Ezrin可能參與E?cad的表達(dá)調(diào)節(jié)。

本研究分析了E?cad和Ezrin的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌患者臨床資料的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)隨著TNM分期增加，E?cad表達(dá)顯著降低；Ezrin陽性表達(dá)或者E?cadc表達(dá)的腫瘤組織具有更大的直徑。結(jié)果提示E?cad表達(dá)減少或者異位表達(dá)于細(xì)胞漿，以及Ezrin表達(dá)增加，可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

表1　E?cad和Ezrin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌患者臨床資料的相關(guān)性Tab.1　Association of E?cad and Ezrin expression with clinicopathological features of nodes positive breast cancer

圖3　Ezrin和E?cad表達(dá)對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的影響Fig.3　Influence of E?cad and Ezrin expression to the number of nodes metastasis

本研究重點(diǎn)分析了E?cad和Ezrin對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的影響，結(jié)果提示E?cad可抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而Ezrin則促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與已有的研究結(jié)果一致［10-13］。并且發(fā)現(xiàn)E?cad（+）/Ezrin（-）組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目減少，而E?cad（-）/Ezrin（+）組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目則增加，這表明E?cad和Ezrin二者調(diào)節(jié)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作用具有協(xié)同性。研究［14］發(fā)現(xiàn)，E?cad表達(dá)在細(xì)胞膜時(shí)，可發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞連接、抑制細(xì)胞遷徙的功能，但表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)的E?cad則無此功能，相反可促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，本研究進(jìn)一步分析了E?cad表達(dá)部位對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的影響，結(jié)果表明E?cadm可抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而E?cadc則促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與LAPYCKYJ等［15］的研究結(jié)果一致。并且E?cadm/Ezrin（-）組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目減少，E?cadc/Ezrin（+）組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目則增加，這表明E?cadc和Ezrin二者調(diào)節(jié)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作用具有協(xié)同性。

綜上所述，本研究對(duì)94例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的乳腺癌組織檢測發(fā)現(xiàn)，E?cad表達(dá)減少促進(jìn)了乳腺癌的病程進(jìn)展，Ezrin表達(dá)增加或者E?cadc表達(dá)有助于乳腺癌腫瘤組織生長；E?cad可抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而Ez?rin則促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且二者作用具有協(xié)同性；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Ezrin表達(dá)可促使E?cad由胞膜表達(dá)轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)表達(dá)，E?cadc表達(dá)可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且Ezrin和E?cadc可協(xié)同促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，Ezrin可能調(diào)節(jié)E?cad的亞細(xì)胞定位，從而協(xié)同影響乳腺癌病程，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，以E?cad和Ezrin作為靶點(diǎn)，有可能實(shí)現(xiàn)有效治療。

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（編輯于溪）

Clinical Significance of Ezrin Associated Subcellular Localization of E?cadherin Expression
in Lymph Nodes Positive Breast Cancer

YU Zhaojin，HE Miao，SUN Mingli，ZHAO Haishan，WEI Minjie，ZHAO Lin

（Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between Ezrin expression and subcellular localization of E?cadherin（E?cad），and explore the clinical significance of this relationship to pathological features such as lymph nodes metastasis in breast cancer.MethodsNinety four cases of breast cancer tissue samples with lymph node metastasis were collected.The expression of Ezrin and E?cad was detected by immunohistochemi?cal method.ResultsThe positive rates of and E?cad and Ezrin were respectively 45.7%and 58.5%in 94 nodes positive breast cancer，containing membranal expression of E?cad（E?cadm）in 20 cases and cytoplasmic expression of E?cad（E?cadc）in 23 cases；the frequency of E?cadc positive staining was significantly higher in Ezrin（+）tissues than that in Ezrin（-）tissues（P=0.025）；E?cad expression level was significantly lower in TNMⅡ?Ⅲstage cases（P=0.001），and Ezrin expression（P=0.036）and E?cadc（P=0.013）was significantly increased in bigger cases；com?pared with E?cad（+），Ezrin（-），E?cadmtissues，the number of lymph node metastasis in E?cad（-）（P=0.011），Ezrin（+）（P=0.002），E?cadc（P=0.020）tissues were increased significantly；in the order of E?cad（+）/Ezrin（-），E?cad（-）/Ezrin（-），E?cad（+）/Ezrin（+），and E?cad（-）/ Ezrin（+），the number of lymph node metastasis was increased significantly（P＜0.001）；similarly，in the order of E?cadm/Ezrin（-），E?cadc/ Ezrin（-），E?cadm/Ezrin（+），and E?cadc/Ezrin（+），the number of lymph node metastasis was increased significantly（P=0.007）.Conclusion Ezrin may regulate the subcellular localization of E?cad in metastatic breast cancer，which may affect the course of breast cancer and promote the metastasis of lymph nodes.

Ezrin；E?cadherin；subcellular localization；breast cancer；lymph nodes metastasis

R733.7

A

0258-4646（2016）08-0695-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.006

遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（LT2014016）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（F14?232?6?05）

于兆進(jìn)（1983-），男，講師，博士研究生.

趙琳，E-mail：zl_cmu@163.com

2015-11-19
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