姜紅堃，田紅宇，郭燕平，王妍，張宇曦，姜紅

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.兒科；2.病理科；3.泌尿外科，沈陽 110001）

TBX1基因在透明細(xì)胞型腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

姜紅堃1，田紅宇1，郭燕平1，王妍2，張宇曦3，姜紅1

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.兒科；2.病理科；3.泌尿外科，沈陽 110001）

目的通過檢測(cè)TBX1基因在透明細(xì)胞型腎細(xì)胞癌（ccRCC）癌組織中的表達(dá)，探討該基因在ccRCC發(fā)病中的分子遺傳學(xué)機(jī)制。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT?PCR）法檢測(cè)12例ccRCC癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常腎組織中TBX1mRNA表達(dá)；Western blot法檢測(cè)腎組織TBX1蛋白表達(dá)。結(jié)果與癌旁正常腎組織比較，TBX1mRNA及蛋白表達(dá)水平在ccRCC癌組織中均明顯增強(qiáng)（均P＜0.05）。結(jié)論TBX1基因過度表達(dá)可能為ccRCC發(fā)生的一種潛在致病機(jī)制。

TBX1基因；透明細(xì)胞型腎細(xì)胞癌；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)；Western blot

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KeywordsTBX1；clear cell renal cell carcinoma；RT?PCR；Western blot

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）起源于腎小管上皮細(xì)胞［1?2］，是腎臟最常見的實(shí)體瘤，約占全部腎臟惡性腫瘤的90%。很多RCC直至疾病晚期才出現(xiàn)癥狀，而放療、化療及生物學(xué)治療效果均不理想，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)［3］顯示RCC術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%。因此早期診斷和治療對(duì)于改善患者的預(yù)后非常重要。RCC包括幾種不同的具有特定組織病理學(xué)和基因特征的亞型，透明細(xì)胞型腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）為RCC最常見的病理類型，占75%～85%［3］。其具體病因尚不明確，有研究［4］證實(shí)遺傳因素為高危因素之一。人類TBX1基因定位于22q 11.21，是染色體22q11.2微缺失綜合征（主要為DiGeorge綜合征及腭心面綜合征）中的重要基因［5］。研究［6］表明TBX1基因在小鼠胚胎腎臟發(fā)育過程中的表達(dá)水平呈波動(dòng)趨勢(shì)，在腎臟發(fā)育成熟后僅微量表達(dá)，該基因可能通過Smad通路參與腎臟發(fā)育。本研究利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real?time quantitative polymerase chain reac?tion，qRT?PCR）法、Western blot法檢測(cè)ccRCC癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常腎組織中TBX1基因的表達(dá)，以明確該基因在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中的分子遺傳學(xué)機(jī)制，為ccRCC的早期診斷提供理論依據(jù)。

1　　材料與方法

1.1臨床資料及標(biāo)本留取

本研究的標(biāo)本來源及使用受試對(duì)象均知情并簽字同意，并經(jīng)由學(xué)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)所留取的12例ccRCC腫瘤組織及癌旁正常腎組織（距腫瘤邊緣≥3 cm）標(biāo)本來源于本院及中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科2011年10月至2012年9月期間行根治性腎癌切除術(shù)的患者，男8例，女4例，年齡23～78歲，平均（53.1±15.2）歲。按所留取標(biāo)本經(jīng)病理診斷確定腫瘤病理類型為ccRCC。按照Fuhrman核分級(jí)系統(tǒng)分級(jí)［7］，高分化7例，中分化2例，低分化3例。依據(jù)2010年AJCC腎癌的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期2例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例，Ⅳ期2例。將切除的新鮮組織置于經(jīng)焦炭酸二乙醋（pyro carbonic acid diethyl ester，DEPC）處理過的EP管中后，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待檢。

1.2qRT?PCR檢測(cè)TBX1mRNA表達(dá)

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成：使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)TBX1基因及β?actin基因序列特異性引物由上海生工生物工程公司合成。TBX1引物，上游5′TAGC GAGAAATATGCCGAGGA 3′，下游5′CGTGATCC GATGGTTCTGGT 3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度94 bp。β?actin引物，上游5′CTCCATCCTGGCCTCGCTGT3′，下游5′GCTG TC ACCTTCACCGTTCC 3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度268 bp。

1.2.2提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照Trizol RNA抽提試劑盒（美國Invitrogen公司）使用說明書提取總RNA。檢測(cè)260 nm和280 nm波長(zhǎng)的光密度，紫外分光光度儀掃描后，根據(jù)A260/280比值檢測(cè)RNA濃度。立即將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒄誘aKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物有限責(zé)任公司）使用說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：42℃60 min，99℃5 min，4℃5 min，總體積為20 μL。所得cDNA于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR：依據(jù)SYBR Green PCR Master mix染料法說明書（美國Applied Biosystems公司），以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為，2× SYBR Green PCR Master mix 12.5 μL；cDNA 0.5 μL；引物各1.0 μL；ddH2O 11.0 μL。置于熒光定量實(shí)時(shí)PCR儀（美國Applied Biosystems公司，7900型）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件，60°C 2 min→93°C 10 min→90° C 15 s→53°C 1 min，循環(huán)40次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線具良好的線性關(guān)系，熔解曲線均具單一特異峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物具特異性。以β?actin為內(nèi)參，校正所得擴(kuò)增樣本Ct值。將腎細(xì)胞癌組織基因值與癌旁正常腎組織基因值進(jìn)行比值計(jì)算。

1.3Western blot檢測(cè)

1.3.1腫瘤組織及癌旁組織總蛋白的提取：切取約100 mg腫瘤組織和癌旁組織，研磨至粉末狀，加入蛋白裂解液1 mL，將組織置于干冰上，在超聲波粉碎機(jī)下粉碎，電動(dòng)勻漿，于4°C下12 000g離心15 min，吸取上清液為樣品；蛋白抽提試劑盒購自美國Active Motif公司。利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2電泳、轉(zhuǎn)膜：制備出十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺（SDS?PAGE）電泳凝膠，并將其加樣于40 μg抽提的蛋白溶解物中電泳4 h，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（美國Amersham公司）。

1.3.3雜交及顯色：取下硝酸纖維素膜，TBS浸泡10 min，50 g/L脫脂奶封閉1 h，TBS洗2次，5 min/次，加入一抗（山羊源性TBX1或β?actin抗體，稀釋度為1∶300，美國Abcam公司），室溫孵育2 h。TBST洗滌2次，5 min/次，加入二抗（兔抗羊IgG抗體，稀釋度為1∶2 000，美國Abcam公司），室溫孵育1 h。TBST洗滌2次，每次5 min。利用ECL顯色試劑（美國Amersham公司）顯影曝光，凝膠圖像掃描儀（美國Gene公司）定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)均以±s表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1qRT?PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與癌旁正常腎組織（1.00±0.01）比較，ccRCC癌組織（1.825±0.216）TBX1mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2Western blot檢測(cè)結(jié)果

各條帶灰度值分析結(jié)果表明，ccRCC癌組織（2.27±0.26）TBX1蛋白表達(dá)較癌旁正常腎組織（1.00±0.27）增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1　Western blot法檢測(cè)ccRCC癌組織及癌旁正常腎組織TBX1蛋白的表達(dá)Fig.1　Detection of TBXl protein expression in renal cell carcino?ma tissues and normal kidney tissues adjacent to carci?noma by Western blot

3　　討論

T?box家族各成員共享一個(gè)獨(dú)特的DNA結(jié)構(gòu)域，該家族基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子為胚胎發(fā)育所必需，參與調(diào)控胚胎發(fā)育多種進(jìn)程［8］。作為T?box家族成員，該基因主要調(diào)控第二心區(qū)細(xì)胞的增殖及分化，是導(dǎo)致心臟流出道異常的先天性心臟病的主要基因。此外該基因參與牙齒、耳、甲狀旁腺及胸腺等多種組織和器官的發(fā)育，在精神疾病的發(fā)病中亦扮演一定角色［9?15］。目前關(guān)于TBX1基因的研究多圍繞該基因與胚胎期心臟發(fā)育及先天性心臟發(fā)育異常進(jìn)行，而關(guān)于此基因與胚胎期腎臟發(fā)育及腎臟相關(guān)疾病的研究較少。FU等［6］研究表明，TBX1基因在胚鼠腎臟發(fā)育過程中表達(dá)水平呈波動(dòng)趨勢(shì)，作為轉(zhuǎn)錄因子TBX1可與HOXD10相互作用，通過激活Smad通路參與腎臟發(fā)育過程；TBX1基因在腎臟發(fā)育成熟后僅微量表達(dá)。本課題組前期研究［16］發(fā)現(xiàn)，在慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎小管損傷模型鼠中TBX1基因被再激活，并通過TGF?β?Smad2/3途徑參與腎小管的損傷修復(fù)過程。

腎細(xì)胞癌具有遺傳性和散發(fā)性兩種發(fā)病形式，研究表明3號(hào)染色體短臂缺失為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中最常見的染色體畸變；BHD基因是腎細(xì)胞癌的易感基因，為抑癌基因，其編碼的蛋白產(chǎn)物為follicu?lin，該蛋白在正常腎組織中表達(dá)，其功能喪失可能為多種病理類型腎細(xì)胞癌發(fā)病的共同基礎(chǔ)；此外研究證實(shí)MET基因、FH基因及XP11.2易位/TFE3融合基因等均可能參與腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。IGA?RASHI［17］在對(duì)腎細(xì)胞癌及多種腫瘤細(xì)胞系的研究表明，PAX2基因在腎細(xì)胞癌中呈特異性表達(dá)且有增高趨勢(shì)，為原發(fā)及轉(zhuǎn)移的RCC的特異性標(biāo)志物。該基因在腎臟發(fā)育過程中參與前、中、后腎的發(fā)育，其表達(dá)失衡可導(dǎo)致多囊腎、先天性腎病綜合征等先天性腎發(fā)育異常［18］。該基因亦為腎臟間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致腎臟腫瘤的發(fā)生。研究證實(shí)PAX2基因表達(dá)異常與泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［19］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PAX2作為轉(zhuǎn)錄因子可直接與TBX1基因上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合，正向調(diào)節(jié)TBX1基因的表達(dá)，可能在腎臟發(fā)育及腎臟疾病發(fā)生過程中扮演重要角色［20］。本研究采用qRT?PCR法及Western blot法檢測(cè)ccRCC腫瘤組織TBX1mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示與癌旁正常腎組織比較，ccRCC癌組織TBX1mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜ 0.05）。由此推測(cè)，在ccRCC的發(fā)生過程中，PAX2基因過度表達(dá)，導(dǎo)致其下游TBX1基因表達(dá)增強(qiáng)，激活某一通路，促使腎小管上皮細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。然而關(guān)于TBX1基因究竟通過何種途徑參與ccRCC的發(fā)生發(fā)展尚待深入探討。

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（編輯武玉欣）

Expression of TBX1 Gene in Kidney Tissues in Patients with Clear Cell Renal Cell Carcinoma and Its Clinical Significance

JIANG Hongkun1，TIAN Hongyu1，GUO Yanping1，WANG Yan2，ZHANG Yuxi3，JIANG Hong1
（1.Department of Pediatrics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pathology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Urological Surgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo analyze the expression ofTBX1gene in kidney tissues in patients with clear cell renal cell carcinoma（ccRCC）and in?vestigate its molecular genetics mechanism during the tumor development.MethodsReal?time quantitative polymerase chain reaction（qRT?PCR）was used to detect the expression ofTBX1mRNA in 12 cases of clear cell renal cell carcinoma tissues and the corresponding normal kidney tissues adjacent to carcinoma.The protein expression of TBX1 was assayed by Western blot in both groups.ResultsBothTBX1mRNA level and the protein level were significantly up?regulated in ccRCC tissues compare to those in normal kidney tissues adjacent to carcinoma（allP＜0.05）.ConclusionOver?expression ofTBX1gene might be a potentially pathogenic mechanism of ccRCC.

R737.11

A

0258-4646（2016）08-0692-03

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.005

國家自然科學(xué)基金（81300130）；教育部高校博士點(diǎn)專項(xiàng)基金（20122104110001）；遼寧省省直醫(yī)院改革重點(diǎn)臨床科室診療能力建設(shè)項(xiàng)目（LNCCC?D06?2015）

姜紅堃（1974-），女，副教授，博士. E-mail：jianghongkun007@163.com

2015-11-29
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