康小龍，何承輝，劉晶，盧軍，楊俊玲

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥物研究室，烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥劑室，烏魯木齊 830004）

刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮病小鼠Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

康小龍1，何承輝2，劉晶1，盧軍1，楊俊玲1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥物研究室，烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥劑室，烏魯木齊 830004）

目的觀察刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮?。⊿Sc）小鼠病理及Ⅲ型膠原（COL?Ⅲ）表達(dá)的影響。方法BALB/c小鼠背部注射鹽酸博萊霉素建立SSc模型，給予刺山柑總生物堿進(jìn)行干預(yù)，HE染色觀察小鼠皮膚及肺組織病理變化，ELISA法檢測小鼠皮膚及肺組織COL?Ⅲ表達(dá)水平。結(jié)果高劑量刺山柑總生物堿可明顯改善SSc小鼠皮膚和肺部炎癥及纖維化，降低COL?Ⅲ表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論刺山柑總生物堿對SSc組織纖維化有一定改善作用。

刺山柑總生物堿；系統(tǒng)性硬皮??；病理；Ⅲ型膠原；纖維化

網(wǎng)絡(luò)出版地址

系統(tǒng)性硬皮?。╯ystemic sclerosis，SSc）是一種病因不明的結(jié)締組織病，表現(xiàn)為不同程度的皮膚硬化和內(nèi)臟器官纖維化［1］。在我國，SSc的發(fā)病率高，病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療手段有限。刺山柑（Cappa?ris spinosa L.）又名槌果藤、野西瓜、老鼠瓜，為白花菜科（Capparaceae）山柑屬（Capparis L.）植物，系維吾爾醫(yī)傳統(tǒng)藥材。本研究組從刺山柑中提取了有效成分刺山柑總生物堿，擬用于治療SSc。本研究通過觀察刺山柑總生物堿對SSc小鼠病理及Ⅲ型膠原（typeⅢcollagen，COL?Ⅲ）表達(dá)的影響，探討其抗SSc組織纖維化的療效。

1　　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～24 g，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號：SCXK（新）2003?0002。

1.1.2主要試劑：鹽酸博萊霉素粉針劑（日本化藥株式會(huì)社，批號：430312）；青霉胺片（上海信誼藥廠，批號：052130503）；小鼠COL?ⅢELISA試劑盒（上海江萊生物科技公司，批號：201502）；二辛可寧酸蛋白定量試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，批號：20150223）。

刺山柑總生物堿乳膏：將刺山柑總生物堿與基質(zhì)混勻，基質(zhì)為硬脂酸、白凡士林、單硬脂酸甘油酯、月桂氮卓酮，于水浴加熱至90℃使熔融，做為油相；甘油與濃縮液混合于水浴，加熱至90℃，做為水相；十二烷基硫酸鈉、對羥基苯甲酸乙酯溶于適量水中，于水浴加熱，使溶解為乳化劑，當(dāng)油相、水相溫度降至85℃時(shí)，依次將水相和乳化劑加入油相中，邊加邊攪拌至乳化完全。

1.1.3主要儀器：酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2方法

1.2.1小鼠SSc模型的復(fù)制及給藥方法：將90只清潔級雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、青霉胺組（125 mg·kg-1）、刺山柑總生物堿低、中、高劑量（225、450、900 mg·kg-1）組，每組15只。實(shí)驗(yàn)前用剃毛刀將小鼠背部毛剃除。除空白對照組外，其余各組用生理鹽水將鹽酸博萊霉素粉針劑稀釋至300 μg·mL-1，注射入小鼠背部皮下，空白對照組小鼠背部皮下注射生理鹽水，1次/d，0.1 mL/次，共4周。觀察小鼠背部注射部位皮膚是否出現(xiàn)皮膚增厚、彈性變差等變化。注射4周后，刺山柑總生物堿低、中、高劑量組小鼠背部外敷刺山柑總生物堿乳膏，青霉胺組給予青霉胺灌胃，空白對照組、模型組背部外敷不含藥基質(zhì)，1次/d，連續(xù)8周。

1.2.2病理組織切片制作：末次給藥后4 h，取小鼠背部注射區(qū)皮膚及肺組織，置于組織固定液中固定，HE染色，觀察病理組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3小鼠皮膚及肺組織COL?Ⅲ含量測定：末次給藥后4 h，取小鼠背部注射區(qū)皮膚及肺組織制成10%組織勻漿，制備好的勻漿以3 500 r·min-1離心10 min，提取上清液分裝。首先用二辛可寧酸蛋白定量試劑盒測定皮膚及肺組織勻漿中蛋白濃度，ELI?SA試劑盒檢測勻漿液中COL?Ⅲ含量，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，測定結(jié)果以每毫升勻漿液中蛋白含量（pg/mg prot）進(jìn)行校正。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1　刺山柑總生物堿對SSc小鼠皮膚組織病理形態(tài)學(xué)的影響 HE×40Fig.1　Effects of Capparis spinosa total alkaloid on the pathological change of skin tissue in systemic sclerosis mice HE×40

2　　結(jié)果

2.1刺山柑總生物堿對SSc小鼠皮膚和肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

小鼠皮膚組織病理切片HE染色（圖1）顯示：空白對照組膠原纖維分布正常，真皮層、真皮下層血管壁結(jié)構(gòu)正常，毛囊、皮脂腺分布均勻，脂肪層結(jié)構(gòu)正常；模型組皮膚厚度明顯增厚，膠原纖維增生，真皮下層血管增粗，血管壁明顯變薄，血管閉塞，毛囊、皮脂腺明顯減少，脂肪層變薄、消失，并伴有炎性細(xì)胞浸潤。刺山柑總生物堿低、中劑量組可見膠原纖維增生，排列緊密，真皮鱗狀上皮稍增生，真皮下毛細(xì)血管壁增厚，毛囊、皮脂腺減少，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤；刺山柑總生物堿高劑量組和青霉胺組可見真皮鱗狀上皮變薄，膠原纖維明顯減少、排列疏松、均質(zhì)化，皮脂腺增多，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。

小鼠肺組織病理切片HE染色（圖2）顯示：空白對照組肺結(jié)構(gòu)完整，小血管壁結(jié)構(gòu)未見異常，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組肺泡及細(xì)支氣管內(nèi)炎性滲出，肺泡間隔增厚，肺泡腔狹窄，大量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，小血管壁增厚，肺泡內(nèi)出血，炎性細(xì)胞浸潤；刺山柑總生物堿低劑量組肺泡間隔增厚，可見大量單核細(xì)胞浸潤，小血管壁增厚，肺泡內(nèi)出血，炎性細(xì)胞浸潤；刺山柑總生物堿中、高劑量組及青霉胺組肺泡間隔增厚明顯改善，可見少量單核細(xì)胞浸潤，小血管壁增厚，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。提示高劑量刺山柑總生物堿能明顯改善SSc小鼠皮膚和肺部的炎癥和纖維化。

2.2刺山柑總生物堿對SSc小鼠皮膚及肺組織COL?Ⅲ表達(dá)的影響

圖2　　刺山柑總生物堿對SSc小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 HE×40Fig.2　Effects of Capparis spinosa total alkaloid on the pathological change of lung tissue in systemic sclerosis mice HE×40

與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚及肺組織中COL?Ⅲ表達(dá)明顯增高（P＜0.01）；與模型組小鼠比較，高劑量刺山柑總生物堿組和青霉胺組小鼠皮膚組織COL?Ⅲ表達(dá)水平降低（P＜0.05），且后兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中、高劑量刺山柑總生物堿和青霉胺可降低小鼠肺組織中COL?Ⅲ表達(dá)水平（P＜0.01）。見表1。

表1　　刺山柑總生物堿對SSc小鼠皮膚及肺組織COL?Ⅲ表達(dá)的影響Tab.1　Effects of Capparis spinosa total alkaloid on typeⅢcollagen expression in systemic sclerosis mice

3　　討論

SSc是一種以多組織器官廣泛纖維化為特征的炎性自身免疫性結(jié)締組織疾病。最早出現(xiàn)的病理改變是外周微血管損傷，繼而活化成纖維細(xì)胞合成過多的膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），導(dǎo)致組織的廣泛纖維化。肺臟是最常發(fā)生纖維化的器官之一，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，血管破壞、膠原聚集、免疫活化是3個(gè)主要因素［2］。

維吾爾族傳統(tǒng)藥物刺山柑具有祛風(fēng)、散寒、除濕、消腫、止痛的作用［3］，研究表明，刺山柑對SSc、銀屑病等有明顯治療效果［4］。刺山柑乙醇提取物可抑制SSc患者成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原的合成［5］；刺山柑鮮果75%乙醇調(diào)制的糊膏以及刺山柑流浸膏均能顯著抑制SSc模型小鼠的真皮增厚、膠原沉積［6］。李凡等［7］用刺山柑治療6例SSc患者，獲得了較滿意的療效。刺山柑總生物堿系本研究組從刺山柑中提取的有效成分，本實(shí)驗(yàn)觀察了它對SSc小鼠皮膚和肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果表明，高劑量（900 mg·kg-1）刺山柑總生物堿可明顯改善SSc小鼠皮膚和肺部炎癥及纖維化，可能對治療SSc具有一定效果。

SSc的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要組織病理特點(diǎn)是皮膚真皮層增厚，ECM合成增多。膠原合成過多，降解減少，大量膠原纖維在皮膚、肺、消化道等組織器官的沉積是SSc的主要病理過程之一。成纖維細(xì)胞是合成膠原蛋白等ECM的主要細(xì)胞［8］，其膠原合成異常增多是SSc的重要環(huán)節(jié)［9］。COL?Ⅲ是ECM的主要成分，是反映膠原代謝的主要參數(shù)［10］。體外培養(yǎng)顯示，SSc患者皮損組織成纖維細(xì)胞COL?ⅢmRNA表達(dá)明顯多于正常皮膚，說明SSc患者成纖維細(xì)胞的膠原合成量增加，結(jié)締組織的異常代謝是SSc發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)［11］。本研究結(jié)果表明，高劑量刺山柑總生物堿能明顯降低SSc小鼠皮膚及肺組織中COL?Ⅲ的表達(dá)，提示刺山柑總生物堿可能通過抑制膠原表達(dá)，減少ECM合成，改善SSc組織纖維化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為刺山柑總生物堿的新藥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

［1］閆小寧，張建榮，李文彬，等.溫陽除痹湯對硬皮病模型小鼠CT?GF的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2013，12（1）：13-16.DOI：10.3969/j.issn.1672?0709.2013.01.004.

［2］徐清，羅龍飛，雷鐵池.系統(tǒng)性硬皮病伴纖維化改變機(jī)制研究進(jìn)展［J］.臨床皮膚科雜志，2013，42（6）：383-385.DOI：10.3969/j. issn.1000?4963.2013.06.030.

［3］李凡，陶娟，涂亞庭.刺山柑乳膏治療銀屑病的臨床觀察［J］.中國醫(yī)藥，2013，8（10）：1453-1454.

［4］李凡，陶娟，涂亞庭.刺山柑軟膏抗炎止癢作用評價(jià)［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2014，30（3）：166-168.

［5］曹越蘭，李欣，鄭敏.槌果藤對進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原產(chǎn)生的影響［J］.中國中藥雜志，2008，33 （5）：560-563.DOI：10.3321/j.issn：1001?5302.2008.05.019.

［6］曹越蘭，李欣，王群.槌果藤對硬皮病小鼠模型皮膚硬化抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中藥雜志，2008，33（2）：215-217.DOI：10.3321/j.issn：1001?5302.2008.02.033.

［7］李凡，阿曼古力，阿不里克木江，等.維吾爾藥槌果藤治療硬皮病6例［J］.中華皮膚科雜志，1997，30（1）：53-54.

［8］呂芹，卞華，陳志國，等.溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清對硬皮病成纖維細(xì)胞膠原分泌和TGF?β1表達(dá)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（16）：184-187.

［9］高地，朱鷺冰，李明.細(xì)胞因子TGFβ1，CTGF和IFN?γ對系統(tǒng)性硬皮病克隆成纖維細(xì)胞膠原代謝的影響［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2012，26（1）：9-11，35.

［10］閆小寧，韓世榮，李文彬，等.“熱敷藥”對硬皮病小鼠模型COL?Ⅰ、COL?Ⅲ蛋白含量的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2011，10（6）：353-355.

［11］謝志軍，曹靈勇，溫成平，等.溫陽通絡(luò)方對硬皮病成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原及MMP?1 mRNA的影響［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志2011，21（5）：295-297，299.DOI：10.3969/j.issn.1005?4561. 2011.05.002.

（編輯王又冬）

Effects of Capparis Spinosa Total Alkaloid on TypeⅢCollagen Expression in Systemic Sclerosis Mice

KANG Xiaolong1，HE Chenghui2，LIU Jing1，LU Jung1，YANG Junling1
（1.Department of Medicine Research，Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China；2.Department of Pharmaceu?tics，Xinjiang Medicine Research Institute，Urumqi 830004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of capparis spinosa total alkaloid on the pathological changes and the typeⅢcollagen（COL?Ⅲ）expression in systemic sclerosis（SSc）mice.MethodsMice models with SSc were established by repeated local injection of bleomycin in BALB/c mice back.After administration of capparis spinosa total alkaloid，the pathological changes of skin and lung tissue were observed，and the COL?Ⅲexpression was detected by ELISA.ResultsCompared with the model group，the inflammation and fibrosis of skin and lung tissue were improved，and the level of COL?Ⅲwas markedly reduced by treatment of high dose capparis spinosa total alkaloid（P＜0.05）.ConclusionCap?paris spinosa total alkaloid is effective in treating fibrosis of SSc.

Capparis spinosa total alkaloid；systemic sclerosis；pathological change；typeⅢcollagen；fibrosis

R965.1

A

0258-4646（2016）08-0688-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.004

國家自然科學(xué)基金（81260235）

康小龍（1975-），男，副主任藥師，博士.

何承輝，E-mail：408705201@qq.com

2015-05-11
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：