趙琳，于兆進，何苗，孫明立，魏敏杰

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽 110122）

·論著·

散發(fā)性乳腺癌中Ezrin和β?catenin蛋白表達的相關(guān)性和臨床意義

趙琳，于兆進，何苗，孫明立，魏敏杰

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽 110122）

目的埃茲蛋白（Ezrin）和β?連環(huán)蛋白（β?catenin）的作用與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究旨在探討二者在乳腺癌中的臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測145例乳腺癌病理組織中Ezrin和β?catenin蛋白的表達水平，并分析二者相關(guān)性及其與乳腺癌臨床資料和預(yù)后資料的相關(guān)性。結(jié)果145例散發(fā)性乳腺癌組織中Ezrin陽性表達70例（48.3%），β?catenin陽性表達82例（56.6%），二者呈顯著負相關(guān)（r=-0.267，P=0.001）。乳腺癌組織學(xué)分級增高，Ezrin表達水平顯著升高（P=0.007），β?catenin表達水平顯著降低（P＜0.001）。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織Ezrin表達水平顯著升高（P=0.027），β?catenin表達水平顯著降低（P=0.011）。Ezrin蛋白表達與乳腺癌患者總體生存期（P=0.004）及無病生存期（P=0.017）縮短顯著相關(guān)，β?catenin陽性表達則可顯著延長患者總體生存期（P＜0.001）及無病生存期（P=0.001）。但多變量Cox回歸發(fā)現(xiàn)，Ezrin 與β?catenin并非影響乳腺癌患者生存期的獨立風(fēng)險因素。結(jié)論乳腺癌中Ezrin和β?catenin顯著負相關(guān)，且在乳腺癌轉(zhuǎn)移、惡化等病程進展及不良預(yù)后過程中發(fā)揮一定作用，可作為乳腺癌治療靶點。

乳腺癌；埃茲蛋白；β?連環(huán)蛋白；轉(zhuǎn)移；預(yù)后

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惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是造成其復(fù)發(fā)和不良預(yù)后的重要因素，因此對女性最常見的惡性腫瘤乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制進行深入研究具有重要意義。埃茲蛋白（Ezrin）是膜-細胞骨架連接蛋白家族成員之一，在細胞的有絲分裂、增殖及細胞黏附、遷移等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用［1?2］。在諸多腫瘤研究［3?4］中發(fā)現(xiàn)，Ezrin與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有密切關(guān)系。β?連環(huán)蛋白（β?catenin）主要具有細胞間黏附連接功能，參與包括Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在內(nèi)的多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其功能異常與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移亦密切關(guān)系［5?6］。最近SAITO等［7］研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)舌鱗癌細胞株HSC?3的Ezrin表達水平，可造成β?catenin蛋白水平增加。但是在乳腺癌組織中同時檢測Ezrin和β?catenin蛋白表達，筆者查閱國內(nèi)外文獻尚未見相關(guān)報道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測145例乳腺癌病理組織中Ezrin和β?catenin蛋白的表達水平，并分析二者相關(guān)性及其與乳腺癌臨床資料和預(yù)后資料的相關(guān)性，以探討Ezrin和β?catenin在乳腺癌中的臨床意義。

1　材料與方法

1.1組織標本

本研究收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科病房2004年至2008年間收治的145例女性乳腺癌患者手術(shù)切取的乳腺組織，組織標本于-80℃冰凍保存?zhèn)溆??；颊咝g(shù)前均未接受放療或化療，采用世界衛(wèi)生組織標準進行組織學(xué)判定。

1.2免疫組織化學(xué)染色

冰凍組織經(jīng)室溫解凍后，常規(guī)制作多聚甲醛固定、石蠟包埋組織塊，切4 μm厚組織切片，固定于防脫載玻片上制成組織切片。組織切片經(jīng)脫蠟及水化后，進行高壓修復(fù)（80 kPa，10 min），然后用過氧化氫和正常山羊血清進行處理。滴加鼠抗人Ezrin單克隆抗體（ab4069，1∶100稀釋，美國Abcam公司）或兔抗人β?catenin單克隆抗體（ab32572，1∶100稀釋，美國Abcam公司）于4℃孵育過夜。次日，組織切片先后經(jīng)生物素標記的二抗和鏈霉菌抗生物素蛋白-辣根過氧化酶（SP）復(fù)合物孵育，然后滴加DAB顯色。最后，組織切片經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片后觀察。陰性對照以PBS代替Ezrin、β?catenin等抗體，其他步驟不變。

1.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評判

組織切片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2位臨床病理醫(yī)生進行盲法評價。Ezrin表達于細胞質(zhì)中，β?catenin表達于細胞膜中。細胞染色強度計分：無染色計為0，弱陽性計為1，中等強度計為2，強陽性計為3。染色細胞百分率（0～100%）與染色強度計分之積計為總分（0～300%）。采用受試者工作特征曲線分析以總分評判生存狀態(tài)的界值作為定義蛋白陰性表達和陽性表達的界值（圖1），結(jié)果顯示Ezrin 和β?catenin的界值分別為175%和167.5%。因此，定義總分＜175%為Ezrin陰性表達，總分≥175%為Ezrin陽性表達；定義總分＜167.5%為β?catenin陰性表達，總分≥167.5%為β?catenin陽性表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用Spearman相關(guān)分析Ezrin與β?catenin蛋白表達的相關(guān)性，采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法分析Ezrin 和β?catenin蛋白表達水平與乳腺癌臨床資料的相關(guān)性，采用log?rank檢驗分析2組生存率的差異，采用Cox回歸進行多變量分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1病例的病理參數(shù)特征

圖1　　受試者工作特征曲線分析Ezrin和β?catenin免疫組化染色總分評判患者生存狀態(tài)的界值Fig.1　The receiver operating characteristic curve analysis with respect to survival state was used to determine the cutpoint of the immu?nohistochemical total score for Ezrin and β?catenin

本研究共收集145例散發(fā)性乳腺癌患者病理組織樣本，其中年齡≤50歲68例，＞50歲76例；絕經(jīng)前患者72例，已絕經(jīng)患者69例；病理診斷為導(dǎo)管癌118例，小葉癌17例；組織學(xué)分級Ⅰ級60例，Ⅱ～Ⅲ79例；TNM分期Ⅰ期20例，Ⅱ期61例，Ⅲ期21例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84例。對145例患者進行隨訪以獲得生存資料，隨訪時間9～118個月，患者5年生存率為69.0%，患者總體生存期（overall survival，OS）平均為（96.9±2.7）個月，無病生存期（disease free survival，DFS）平均為（88.8±3.1）個月。

2.2乳腺癌組織中Ezrin與β?catenin蛋白表達及二者相關(guān)性

免疫組織化學(xué)檢測145例散發(fā)性乳腺癌組織中Ezrin與β?catenin蛋白表達（圖2），發(fā)現(xiàn)Ezrin陽性表達70例，陽性率為48.3%；β?catenin陽性表達82例，陽性率為56.6%。進一步分析二者表達相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者呈顯著負相關(guān)（r=-0.267，P=0.001）。

2.3Ezrin和β?catenin蛋白表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

圖2　　乳腺癌中Ezrin與β?catenin免疫組化染色的典型圖片 SP法×400Fig.2　Representative micrographs showing immunohistochemical staining of Ezrin and β?catenin in breast cancer tissues SP×400

采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法分析Ezrin和β?catenin蛋白表達與乳腺癌患者臨床資料的相關(guān)性（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與組織學(xué)分級Ⅰ級的組織相比，Ⅱ～Ⅲ級的乳腺癌組織Ezrin表達水平顯著升高（P= 0.007），β?catenin表達水平顯著降低（P＜0.001）；與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織相比，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織Ezrin表達水平顯著升高（P=0.027），β?catenin表達水平顯著降低（P=0.011）。

2.4Ezrin與β?catenin蛋白表達對乳腺癌患者預(yù)后的影響

應(yīng)用log?rank檢驗分析Ezrin與β?catenin蛋白表達水平對乳腺癌患者OS及DFS的影響（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白表達與乳腺癌患者OS（P=0.004）及DFS（P=0.017）縮短顯著相關(guān)（圖3A、3C），β?catenin陽性表達則可顯著延長患者OS（P＜0.001）及DFS （P=0.001，圖3B、3D）。

引入年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Ezrin蛋白表達、β?catenin蛋白表達等因素，進行多變量Cox回歸分析（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤大?。∣S，P=0.008；DFS，P=0.002）、組織學(xué)分級（OS，P=0.002；DFS，P=0.006）、TNM分期（OS，P= 0.008；DFS，P=0.006）為影響預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。此外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者DFS的獨立風(fēng)險因素（P=0.002）。而Ezrin、β?catenin蛋白表達不是影響乳腺癌預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。

3　討論

Ezrin和β?catenin是參與調(diào)解腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的2個重要蛋白。本研究通過免疫組織化學(xué)染色法檢測了145例散發(fā)性乳腺癌中Ezrin和β?catenin蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)二者呈顯著負相關(guān)。相關(guān)的研究報道中，如SAITO［7］在舌鱗癌細胞中發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)Ezrin表達可導(dǎo)致β?catenin蛋白水平增加；而國內(nèi)胡雪梅［8］對卵巢癌組織的研究發(fā)現(xiàn)Ezrin表達與β?catenin呈正相關(guān)，與本研究相悖。這可能是由于卵巢組織與乳腺組織的特異性所致，或者對β?catenin表達部位限定的差異造成。胡雪梅考察了細胞膜和細胞質(zhì)中的β?catenin表達，而本研究只考察了細胞膜上正常的β?catenin表達，未考察細胞質(zhì)和細胞核中的異常表達。

分析Ezrin和β?catenin與乳腺癌臨床資料及生存資料的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Ezrin表達與較高的組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，而β?catenin則與之負相關(guān)；且Ezrin與生存期縮短相關(guān)，β?catenin與生存期延長相關(guān)。這與已有的Ezrin的相關(guān)報道結(jié)果一致［3?4］。在已有的β?catenin的相關(guān)報道［9?11］中，β?catenin異常表達（非細胞膜位置）將失去介導(dǎo)細胞間鏈接、黏附的功能，并引起某些癌基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細胞癌變、轉(zhuǎn)移；并且MEI等［12］應(yīng)用meta分析，發(fā)現(xiàn)β?catenin表達水平下降可導(dǎo)致非小細胞肺癌患者預(yù)后不良?？梢?，在乳腺癌中Ezrin促進細胞惡化及侵襲轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后，而β?catenin則相反。但Ezrin和β?catenin并不是影響乳腺癌患者生存期的獨立風(fēng)險因素，這可能是因為二者的作用與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進而影響預(yù)后，而非直接作用。

表1　Ezrin和β?catenin蛋白表達與乳腺癌患者臨床資料的相關(guān)性Tab.1　Association of Ezrin and β?catenin expression with clinicopathological features of breast cancer

圖3　Ezrin與β?catenin蛋白表達對乳腺癌患者預(yù)后的影響Fig.3　Analysis of the prognostic significance of Ezrin and β?catenin in breast cancer patients

綜上所述，筆者認為，在乳腺癌轉(zhuǎn)移、惡化等病程進展及不良預(yù)后過程中，Ezrin和β?catenin均發(fā)揮了一定作用，且二者密切相關(guān)，因此Ezrin和β?catenin可作為乳腺癌治療方案的作用靶點。

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表2　　多變量Cox回歸分析乳腺癌臨床病理參數(shù)對患者生存期的影響Tab.2　Multivariate Cox regression analysis of clinicopathological data correlated with OS and DFS in breast cancer

（編輯陳姜）

Correlation and Clinical Significance of Ezrin and β?catenin Protein Expression in Sporadic Breast Cancer

ZHAO Lin，YU Zhaojin，HE Miao，SUN Mingli，WEI Minjie
（Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo explore the clinical significance of Ezrin and β?catenin in breast cancer.MethodsImmunohistochemical staining method was adopted to detect Ezrin and β?catenin protein expression level in 145 cases of breast cancer tissues，and their correlation with clinical data and prognosis of breast cancer was analyzed.ResultsEzrin was expressed in 70 cases（48.3%），β?catenin was expressed in 82 cases （56.6%），and there was significantly negative correlation（r=0.267，P=0.001）.The higher histologic grade of breast cancer，the higher expres?sion level of Ezrin（P=0.007），and the lower expression level of β?catenin（P＜0.001）.Ezrin expression level was increased significantly（P= 0.027），but β?catenin expression level was reduced significantly（P=0.011）in lymph node positive breast cancer tissue.Ezrin expression was sig?nificantly correlated with shorter overall survival（P=0.004）and disease free survival（P=0.017）of breast cancer patients，but β?catenin expres?sion was significantly correlated with longer overall survival（P＜0.001）and disease free survival（P=0.001）of breast cancer patients.However，Ezrin and β?catenin were not the independent risk factors of breast cancer patients as determined by multivariate Cox regression.ConclusionEz?rin was significantly negative correlated with β?catenin in breast cancer.They play a role in the progression and poor prognosis of breast cancer，which can be used as breast cancer treatment targets.

breast cancer；Ezrin；β?catenin；metastasis；prognosis

R73?3

A

0258-4646（2016）08-0673-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.001

國家自然科學(xué)基金（81373427）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃本溪生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)集群項目（2014226033）；遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團隊項目（LT2014016）

趙琳（1979-），女，副教授，博士.

魏敏杰，E-mail：weiminjiecmu@163.com

2015-12-09
網(wǎng)絡(luò)出版時間：