武　玲　汪鋆植，2　羅華軍　郭東艷　陳北燕　余海立　賀海波，2

(1. 三峽大學 天然產物研究與利用湖北省重點實驗室， 湖北 宜昌　443002； 2. 湖北省土家族藥物研究所， 湖北 宜昌　443002； 3. 陜西中醫(yī)藥大學藥學院， 陜西 咸陽　712046)

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3-羥基根皮苷的雌激素樣作用及其作用機制研究

武玲1汪鋆植1，2羅華軍1郭東艷3陳北燕1余海立1賀海波1，2

(1. 三峽大學 天然產物研究與利用湖北省重點實驗室， 湖北 宜昌443002； 2. 湖北省土家族藥物研究所， 湖北 宜昌443002； 3. 陜西中醫(yī)藥大學藥學院， 陜西 咸陽712046)

摘要：研究了3-羥基根皮苷雌激素作用并初步探討其發(fā)揮作用的可能機制．通過MTT法檢測3-羥基根皮苷對MCF-7細胞及MDA-MB-231細胞增殖的影響；小鼠子宮增重實驗檢測3-羥基根皮苷對子宮、卵巢系數的影響，并用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清中雌二醇(E2)含量，Western blot法檢測小鼠子宮組織中雌激素受體(ERs)的表達；計算機輔助藥物設計法及酵母雙雜交實驗檢測3-羥基根皮苷與ERs的結合能力．結果表明，與空白組相比，3-羥基根皮苷濃度為6×10-5～3×10-4mol/L可促進MCF-7細胞增殖，對MDA-MB-231細胞增殖無顯著影響；3-羥基根皮苷可促進小鼠子宮發(fā)育，提高體內E2的含量，對子宮組織中ERα表達有促進作用；計算機模擬3-羥基根皮苷與ERs分子對接及酵母雙雜交實驗表明3-羥基根皮苷與ERβ有較強結合能力．3-羥基根皮苷具有雌激素樣作用，可能通過與ERs結合，并影響雌激素分泌及ERα表達發(fā)揮作用．

關鍵詞：3-羥基根皮苷；雌激素；雌激素受體

雌激素(estrogen)是女性體內重要的調節(jié)激素之一，雌激素對女性生殖、心血管、骨骼等系統(tǒng)的功能具有重要作用．女性進入圍絕經期后，由于卵巢功能衰退，雌激素水平急速下降，出現一系列圍絕經期癥狀．臨床多使用雌激素替代療法(estrogen placement therapy， ERT)緩解圍絕經期癥狀，但長期應用激素替代療法有增加乳腺癌、子宮內膜癌等腫瘤的發(fā)病風險[1-3]．因此，尋求更安全的雌激素替代品成為圍絕經期綜合證的需要，植物雌激素具有更好的安全性，成為雌激素替代療法的選擇之一[4-6]．其中黃酮類化合物是常見植物雌激素的來源．

前期研究表明土家族常用藥湖北海棠具有雌激素樣作用，其主要成分黃酮類化合物根皮苷是主要有效成分，具有雌激素雙向調節(jié)的作用[7]．3-羥基根皮苷是湖北海棠葉中另一主要成分，結構與根皮苷類似，屬二氫查爾酮苷．本實驗重點研究3-羥基根皮苷的雌激素樣作用，為更好地開發(fā)利用湖北海棠提供基礎．

1材料與儀器

1.1實驗動物、細胞株及酵母菌株

SPF級昆明小鼠40只，雌性，出生21 d，體質量9～12 g，由三峽大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(鄂)2011-0012，設施許可證號：SCXK(鄂)2011-0061．人乳腺癌細胞株MCF-7(ER+)，由武漢中國典藏物培養(yǎng)中心提供；人乳腺癌細胞株MDA-MB-231(ER-)(ATCC)，重組人雌激素受體基因片段(hER)及共激活因子GPIP1的雙雜交酵母(Y191)，由日本富山大學饋贈．

1.2藥物與試劑

MTT、無酚紅、DMEM培養(yǎng)基(gibco公司)；L-15干粉培養(yǎng)基(Invitrogen Corporation)；鄰硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，17-β-雌二醇(購自sigma公司)；無氨基酵母氮源(Difco)(購自安琪酵母股份有限公司)；雌二醇ELISA試劑盒(Cayman公司)；單克隆ERα、多克隆ERβ抗體(abcam)．3-羥基根皮苷(本實驗室提供，純度98%)．

1.3主要儀器

酶標儀infiniteM200pro(TECAN)，CO2培養(yǎng)箱(SHELLJB)，電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，恒溫搖床(HDLAPPARATUS)，低溫高速離心機(德國eppendof公司)；超凈工作臺(HDLAPPARATUS)．

2方法

2.1小鼠子宮增重實驗

取剛斷奶的昆明小鼠9～12 g，共40只．按隨機的原則分為5組即空白組、雌二醇組和3-羥基根皮苷高、中、低劑量組，每組8只，每天給藥一次，持續(xù)5 d．空白組灌胃純水，雌二醇組灌胃E2懸濁液0.1 mg/kg，3-羥基根皮苷高劑量組80 mg/kg，中劑量組40 mg/kg，低劑量組20 mg/kg，最后一次給藥前一天，禁食，不禁水處理12 h后，給藥后1 h，稱體質量，眼球取血后處死，取子宮、卵巢．稱取卵巢、子宮濕重．全血樣本自然凝結30 min后，2 000 r/min離心15 min，分離血清，-20℃保存．所取組織包在錫箔紙中，-80℃保存?zhèn)溆茫畽z測指標：①計算子宮系數：子宮(或卵巢)系數(%)=子宮濕重(或卵巢)/體量×100%；②采用ELISA試劑盒檢測血清中E2；③利用Western-blot檢測子宮組織中ERα、ERβ蛋白表達．根據目的蛋白分子量配10% SDS-PAGE凝膠，調整蛋白量一致，進行電泳．然后常規(guī)轉膜操作，脫脂牛奶室溫封閉1 h．孵育ERα、ERβ抗體(抗體濃度按說明書濃度)，4℃過夜，二抗(1∶5 000稀釋)室溫輕搖1 h，CEL顯色．

2.2MTT法檢測細胞增殖情況

2.2.1細胞培養(yǎng)

MCF-7細胞于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)開放式培養(yǎng)，MDA-MB-231細胞于L-15培養(yǎng)基(含10%小牛血清)中封閉式培養(yǎng)．培養(yǎng)環(huán)境：37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中．

2.2.2藥物分組

3-羥基根皮苷濃度3×10-4、1.5×10-4、6×10-5、3×10-5、1.5×10-5mol/L，E2濃度1×10-9mol/L．

2.2.3MTT法檢測細胞增殖實驗

MDA-MB-231、MCF-7選取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入無血清DMEM吹打成細胞懸液，以1×104/孔的濃度接種于96孔板內，每孔培養(yǎng)液總體積為200 μL．培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，換為含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 d后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5～10 min，使結晶物完全溶解．以DMSO調零，用酶標儀在490 nm下測定各孔吸光度值(A490 nm)，計算增殖率[PR(%)=(A490 nm實驗組-A490 nm空白組)/A490 nm空白組×100%]．

2.3ERs結合能力的測定

2.3.1重組雌激素受體基因酵母培養(yǎng)

將酵母(Y191)接種于SD/-leu、-try固體培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)．待酵母長好后，挑取單菌落于含10 mLSD/-leu、-try液體培養(yǎng)基的試管中，放入搖床30℃過夜，轉化生長．取0.5 mL酵母培養(yǎng)液，于含4.5 mLSD/-leu、-try液體培養(yǎng)基試管中，使溶液在600 nm波長處的吸光度(A)值為0.4．于1.5 mL EP管中加入200 μL新SD/-leu、-try培養(yǎng)基，再加50 μL酵母培養(yǎng)液，加入受試物2.5 μL(不同濃度)繼續(xù)在搖床上30℃培養(yǎng)4 h．

2.3.2與受體結合情況的測定

取經藥物作用4 h的酵母培養(yǎng)液，取150 μL放入96孔板，于600 nm測A值作為酵母密度．將含剩余酵母培養(yǎng)液的EP管放入離心機，12 000 r/min，離心5 min．小心吸取上清液，加入200 μL Z緩沖液(用前加入Zymolyase至終濃度1 mg/mL)，振勻，37℃溫育15 min．然后加入40 μL濃度4 mg/ml的2-硝基苯β-D半乳糖苷開始酶促反應，30℃，30 min．之后加入100 μL 1 mol/L Na2CO3停止反應．取150 μL加入96孔板中測定酶活．β-半乳糖苷酶的活性按下式計算：

式中，t為反應時間(min)，v為用于測定的培養(yǎng)液體積(mL)，A600為細胞測定時的密度，A420為2-硝基苯反應完后的吸光度，A550為反應完后的吸光度．

2.4計算機模擬3-羥基根皮苷與ERs分子對接

采用分子對接法計算3-羥基根皮苷與ERs的結合能力，預測雌激素調節(jié)作用以及與ERs間的相互作用模式．ERα與ERβ三維結構坐標從Protein Data Bank 下載(PDB Code：3ERD、1U3R)．化合物分子結構構建后采用量子化學半經驗算法AM1進行能量最小化．分子對接采用半柔性對接方法GADock(遺傳算法分子對接)，設置如下：群規(guī)模：50；最大代數：2000；變異概率：0.2000；交叉概率：0.8000；ERα與ERβ的結合位點分別以Glu353和Glu305為中心，盒子大小為25?×25?×25?．

2.5統(tǒng)計學處理

3結果

3.1小鼠子宮增重實驗

3.1.13-羥基根皮苷對昆明小鼠子宮、卵巢系數及E2含量的影響

由表1可知．3-羥基根皮苷能促進小鼠子宮發(fā)育，提高子宮系數，但與空白組比較，差異無顯著性；用3-羥基根皮苷處理后能升高血清E2含量，與空白組比較，高劑量組差異有顯著性(P<0.05)，但3-羥基根皮苷對卵巢系數無顯著影響．

表1　3-羥基根皮苷對昆明雌性小鼠子宮、卵巢系數及E2含量的影響

注：與空白組比較，**P<0.01

3.1.23-羥基根皮苷對昆明小鼠子宮ERα、ERβ表達的影響

由圖1可見，3-羥基根皮苷能促進小鼠子宮ERα表達，且具有濃度依賴性，但差異無顯著性；3-羥基根皮苷對ERβ表達無明顯影響(與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01)．

圖1　3-羥基根皮苷對ERα、ERβ表達的影響

3.23-羥基根皮苷對MCF-7細胞及MDA-MB-231細胞增殖的影響

由表2可知，3-羥基根皮苷對MCF-7細胞有促進增殖的作用，與空白組相比，濃度為6×10-5～3×10-4mol/L對MCF-7細胞增殖差異有顯著性，但對MDA-MB-231細胞增殖無明顯影響．

表2　3-羥基根皮苷對MCF-7細胞及MDA-MB-231細胞增殖的影響

注：與空白組比較，**P<0.01

3.33-羥基根皮苷與ERs結合能力的影響

由表3可知，雌二醇與雌激素α、β受體有結合能力，3-羥基根皮苷在濃度為10-3mol/L與雌激素α受體的結合能力，與空白組比較差異有顯著性(P<0.01)．3-羥基根皮苷在濃度為10-5～10-3mol/L與雌激素β受體有較強的結合能力，與空白組比較，差異有顯著性(P<0.01)，且具有劑量依賴性．

表3　3-羥基根皮苷對雙雜交酵母系統(tǒng)中β-糖苷酶活性的影響±s，n=6)

注：與空白組比較，**P<0.01

3.4計算機模擬3-羥基根皮苷與ERs分子對接結果

通過分子對接計算得，3-羥基根皮苷與ERα和ERβ的結合自由能分別為-7.32和-7.66 kcal/mol，3-羥基根皮苷與ERβ的親和力較強．從分子作用模式圖3可知，3-羥基根皮苷與ERα受體的Arg352、Tyr328間有氫鍵作用，而3-羥基根皮苷糖苷上的羥基則與ERβ受體的His308、Ser311、Lys315之間存在較強的氫鍵作用(A圖：3-羥基根皮苷與ERα受體作用模式；B圖：3-羥基根皮苷與ERβ受體作用模式)．

圖2　3-羥基根皮苷與ERs的分子對接結果

4討論

體內外實驗研究表明，3-羥基根皮苷具有雌激素樣作用．作用較E2弱．其雌激素樣作用可能通過與ERs結合，進而調控相關基因，從而發(fā)揮作用．同時，在體內還可以通過影響雌激素的分泌，從而調節(jié)雌激素水平和效應．

3-羥基根皮苷與ERβ受體具有較強結合能力，高劑量時才與ERα具有結合能力．ERα和ERβ可通過不同的信號轉導方式調控著細胞中基因的表達，甚至在不同組織中，ERα和ERβ可發(fā)揮截然相反的作用．3-羥基根皮苷與不同受體結合能力具有明顯差異，與E2具有明顯區(qū)別．同時，3-羥基根皮苷對ERα表達的影響與E2作用相反，表明3-羥基根皮苷可能具有克服長期應用雌激素替代療法所致不良反應的應用潛質．Bircan等人[8-9]的研究表明，從正常子宮內膜到子宮內膜癌的進程中，ERα表達逐漸降低，3-羥基根皮苷可以提高ERα表達，可能對子宮內膜癌具有防治作用，但需要進一步研究．

ERs不僅對正常生理功能調控具有重要作用．同時，乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、結腸癌等許多腫瘤發(fā)生過程中，ERs也扮演了重要角色．所以，進一步探討3-羥基根皮苷對不同組織的作用及機制，以及3-羥基根皮苷及根皮苷的相互作用，對更好地利用土家族藥物湖北海棠具有重要意義．

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[責任編輯周文凱]

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.03.024

收稿日期：2016-03-24

基金項目：國家自然科學基金(81202905，31370373)

通信作者：汪鋆植(1966-)，男，教授，博士，主要從事土家族藥活性評價和質量控制研究．E-mail：wangjunzhi@ctgu.edu.cn

中圖分類號：R284

文獻標識碼：A

文章編號：1672-948X(2016)03-0108-05

Estrogen Effect and Mechanisms of 3-Hydroxy-Phlorizin

Wu Ling1Wang Junzhi1,2Luo Huajun1Guo Dongyan3Chen Beiyan1Yu Haili1He Haibo1,2

(1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China； 2. Hubei Research Institute of Tujia Medicine, Yichang 443002, China; 3. Shanxi College of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

AbstractThis paper investigates the 3-hydroxy Phlorizin estrogen effects and observes its action with different estrogen receptors. The 3-hydroxy Phloridzin effect of cell proliferation on MCF-7 and MDA-MB-231 are measured by MTT assay; mouse uterine weight experiment is conducted to analyze the effect of 3-hydroxy phlorizin on the uterus, ovaries coefficients influence, the determination of serum estradiol by ELISA method; hormone receptor expression detected by Western blot; computer-aided drug design method and the yeast two-hybrid assay 3-hydroxy-root hesperidin and estrogen receptor binding capacity. Compared with the control group, 3-hydroxy-phlorizin concentration of 6×10-5～3×10-4mol/L, the significantly promote the proliferation of MCF-7 cells of MDA-MB-231 cell proliferation is not significant influence; the 3-hydroxy-phlorizin can promote the development of mouse uteras, improve the content of the body estradiol on uterine tissue estrogen receptor α (ERα) expression promoted; computer-aided drug design and yeast two-hybrid experiments show and 3-hydroxy-phlorizin and ERβ have a stronger binding capacity. It is concluded that the 3-hydroxy phlorizin has estrogen effects, and regulating the effects of estrogen secretion and the expression of estrogen receptors by binding to estrogen receptors.

Keywords3-hydroxy phloridzin;estrogen;estrogen receptors