張亞妹，王久濤，宋玲珍，張　偉，李玲玲，顏潤川，胡新德，趙善廷

(西北農林科技大學 動物醫(yī)學院， 陜西 楊凌 712100)

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丙烯酰胺對小鼠成體神經發(fā)生及增殖相關基因的影響

張亞妹，王久濤，宋玲珍，張偉，李玲玲，顏潤川，胡新德，趙善廷

(西北農林科技大學 動物醫(yī)學院， 陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 探討丙烯酰胺對成年小鼠海馬成體神經發(fā)生及增殖相關基因的影響，為了解丙烯酰胺的毒性機理提供參考?！痉椒ā?將20只10周齡雄性成年昆白小鼠(體質量(30±2) g/只)，隨機均分為丙烯酰胺染毒組和生理鹽水對照組，丙烯酰胺染毒組通過腹腔注射丙烯酰胺進行染毒，注射劑量為50 mg/kg，連續(xù)注射14 d，第15天注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，50 mg/kg，2次/d，共3 d)，觀察2組小鼠體質量及行為活動的變化。用BrdU標記和免疫組織化學染色方法分析丙烯酰胺染毒對小鼠齒狀回神經干細胞數量的影響，用RT-PCR法研究丙烯酰胺對小鼠海馬增殖相關基因JNK3、Akt1、Gsk-3β、RhoA和Rac1 mRNA表達的影響?！窘Y果】 丙烯酰胺染毒組小鼠體質量極顯著低于對照組，精神萎靡、后肢無力，走路時后肢偶成劈叉姿勢；與對照組相比，丙烯酰胺染毒組小鼠齒狀回亞顆粒細胞層中的BrdU陽性細胞數量極顯著降低(P<0.01)，海馬組織中JNK3和Rac1的mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，Akt1、Gsk-3β和RhoA的mRNA表達量極顯著升高(P<0.01)。【結論】 丙烯酰胺中毒能顯著抑制小鼠齒狀回中成體神經干細胞增殖，可使海馬組織中增殖相關基因JNK3、Akt1、Gsk-3β、Rac1和RhoA的表達量發(fā)生明顯變化。

[關鍵詞]丙烯酰胺中毒；成體神經發(fā)生；免疫組織化學；增殖相關基因

丙烯酰胺是一種工業(yè)常用的化學藥品，用于制造聚丙烯酰胺，在人們的日常生活中經常會接觸到丙烯酰胺，如化妝品、洗滌劑和除臭劑等[1]。在實驗室中，丙烯酰胺常用于電泳和凝膠層析等。除了工業(yè)和實驗室使用之外，含糖量較高的食品經過高溫加熱，也會形成丙烯酰胺[2-4]。有研究報道顯示，丙烯酰胺具有神經毒性和生殖毒性，對動物具有致癌作用，導致動物體質量降低和神經綜合征等[5-6]。

在哺乳動物中，成體神經干細胞主要局限于中樞神經系統(tǒng)的兩個部位：海馬結構中的齒狀回(dentate gyrus,DG)和側腦室壁的室周帶(subventricular zone，SVZ)[7]。齒狀回的神經干細胞主要存在于亞顆粒細胞層(subgranular zone,SGZ)，其新生的神經干細胞遷移入亞顆粒細胞層，其中85%～95%的新生干細胞發(fā)育分化成神經元[8]。SVZ區(qū)新生的神經干細胞先是通過喙側遷移流(rostral migratory stream,RMS)到達嗅球(olfactory bulb)，然后在嗅球中發(fā)育分化成幾種中間神經元[9]。

5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)注射標記法是目前研究成體神經發(fā)生最常用的方法，BrdU 是一種胸腺嘧啶脫氧核苷的類似物，可以代替胸腺嘧啶插入并整合到正在合成的DNA鏈中，同時不影響細胞的正常功能，因此BrdU是研究細胞增殖較為理想的標記物[10]。SGZ區(qū)新生的神經干細胞能標記上BrdU，且一旦標記上BrdU，該細胞將會始終帶有BrdU。SGZ區(qū)被BrdU標記的細胞可能是神經干細胞，也可能是已經發(fā)生分裂或分化的神經干細胞的子細胞。

為了研究丙烯酰胺對海馬組織中增殖相關基因的影響，筆者通過大量查閱前人在增殖相關基因方面的研究成果，發(fā)現JNK信號通路參與神經元增殖、凋亡過程，而JNK3是JNK信號通路的關鍵分子。JNK有JNK1、JNK2和JNK3 3種亞型，前2個分布在機體大部分組織中，JNK3只特異性地在神經系統(tǒng)中表達并起細胞保護作用[11]。另外，與細胞增殖相關的PI3K信號通路中有2個關鍵分子Akt和Gsk-3β。Akt又稱PKB，研究表明,Akt與成纖維母細胞、上皮細胞以及神經元的增殖相關[12]。Rho家族蛋白也是目前研究細胞增殖相關基因的熱點。本試驗觀察了丙烯酰胺中毒對小鼠形態(tài)的學影響及齒狀回中神經干細胞的增殖變化，并對與增殖相關的基因進行深入分析，以期為研究丙烯酰胺毒性機理提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物10周齡昆白種小鼠20只，體質量(30±2) g/只，雄性，購自西安交通大學醫(yī)學院。

1.1.2主要試劑和儀器丙烯酰胺分析純(含量≥99.9%，Amresco)、BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷，bromodeoxyuridine，Sigma)、大鼠抗BrdU IgG(Serotec，Düsseldorf，Germany)、生物素化兔抗大鼠IgG(武漢博士德)、SABC(Streptavidin，HRP conjugated,武漢博士德，bse-0437P)、Trizol(Invitrogen)、反轉錄試劑盒(Thermo scientific)和DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術有限公司)；VT1000S振蕩切片機(Leica)、Observer Z1結構照明顯微鏡(Zessi)、PCR儀(Bio-Rad)、體視顯微鏡(浙江瞬宇)。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理試驗動物隨機分為對照組(生理鹽水， 10只)和丙烯酰胺染毒組(50 mg/kg，10只，連續(xù)腹腔注射14 d)。試驗第15天按50 mg/kg劑量腹腔注射BrdU，每只小鼠注射量為2 次/d(間隔12 h)，連續(xù)3 d，最后一次注射BrdU后24 h灌注取材。試驗期間，小鼠自由飲水和取食，每天光照及黑暗各12 h，溫度(25±3) ℃，相對濕度30%～73%，每天觀察小鼠的進食、活動、反應、死亡等情況并做好記錄。

(1)取材。先用質量分數0.56%戊巴比妥鈉腹腔注射，待小鼠麻醉后，將其腹部朝上放置在蠟盤上固定四肢，用剪刀快速從腹腔中部剪開，經兩側剪至膈膜直達胸腔，使小鼠心臟充分暴露。在小鼠未死亡狀態(tài)下將灌注針插入左心室，并迅速剪破右心房，灌注質量分數0.9%生理鹽水使其通過血液循環(huán)系統(tǒng)排盡小鼠體內血液，待流出液清亮時關閉生理鹽水閥門，用質量分數4%多聚甲醛(PFA)持續(xù)灌注固定10 min左右，至小鼠身體僵硬、肝臟和眼球發(fā)白時，開顱取小鼠大腦。用振蕩切片機進行冠狀切片(厚度50 μm)，然后進行免疫組織化學染色。

(2)染色。①取海馬冠狀切片，用質量分數3% H2O2漂洗10 min封閉內源性過氧化物酶；②0.1 mol/L PB(pH 7.4)充分漂洗，用蒸餾水緩沖處理10 min；③加入2 mol/L HCl在37 ℃條件下孵育30 min；④0.1 mol/L (pH 8.5)硼酸溶液充分漂洗(15 min/次，3次)；⑤加入一抗大鼠抗BrdU(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；⑥PB漂洗，加入二抗生物素化兔抗大鼠(1∶300) 4 ℃孵育過夜；⑦PB漂洗，加入SABC(1∶300 Streptavidin)室溫孵育1 h；⑧PB漂洗，DAB顯色試劑盒顯色2 min，PB漂洗并經梯度酒精脫水和二甲苯透明后中性樹膠封片觀察。

1.2.2BrdU陽性細胞計數在結構照明顯微鏡下觀察DAB染色切片，統(tǒng)計齒狀回SGZ區(qū)BrdU陽性細胞數量，測量整個齒狀回SGZ區(qū)的長度，門區(qū)(hilus)內的BrdU陽性細胞不作統(tǒng)計，計算齒狀回SGZ區(qū)單位長度(1 000 μm)內的BrdU陽性細胞數。

1.2.3細胞增殖相關基因表達的檢測本試驗選取與細胞增殖相關的基因,包括JNK3、Akt1、Gsk-3β、RhoA、Rac1，用Primer 5.0軟件設計各基因的特異性引物(表1)，內參基因為GAPDH。試驗結束后，小鼠斷頸處死，體視顯微鏡下分離小鼠左右兩側的海馬組織，參照Trizol法提取總RNA，通過反轉錄獲得cDNA模板，RT-PCR檢測海馬中各增殖相關基因轉錄水平的變化。2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增結果，用Image J軟件對PCR產物條帶進行灰度值分析，以各增殖基因與內參基因GAPDH灰度值的比值作為該基因的相對表達量。

表 1　本研究RT-PCR中所用的引物序列Table 1　Primer sequence for RT-PCR

1.3數據統(tǒng)計分析

所有試驗數據用GraphPad Prism v5.0軟件進行t檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果與分析

2.1丙烯酰胺對小鼠運動行為和體質量的影響

試驗開始前各組小鼠體質量為(30±2) g/只，無明顯差異。試驗后各組小鼠運動行為和體質量變化如圖1所示。由圖1可知，對照組小鼠正常采食飲水，被毛整潔有光澤，行為活動正常(圖1-A)，體質量(31.38±1.21) g/只。經過14 d丙烯酰胺腹腔注射染毒的染毒組小鼠被毛粗亂無光澤，精神萎靡，走路搖擺，后肢無力，有時走路后肢呈劈叉姿勢(圖1-B)，無法站立；染毒組小鼠采食量和飲水量均下降，體質量(26.62±1.49) g/只，極顯著低于對照組(P<0.01)(圖1-C)。

圖 1　丙烯酰胺對小鼠運動行為和體質量的影響 A.對照組；B.丙烯酰胺染毒組；C.小鼠體質量變化 *、**分別表示與對照組有顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)差異，下圖同Fig.1　Effect of acrylamide on motor behavior and body weight of mice A.Control group;B.Acrylamide poisoning group;C.Body weight change * and ** represent significantly(P<0.05) and very significantly(P<0.01) difference compared with the control group,respectively.The same below

2.2丙烯酰胺對小鼠齒狀回中成體神經干細胞增殖的影響

對照組小鼠BrdU陽性細胞多成簇存在，胞體呈橢圓形、胞核多濃染(圖2-A,B)，丙烯酰胺染毒組小鼠BrdU陽性細胞胞體形態(tài)、胞核染色深淺程度(圖2-C,D)與對照組無明顯差異，神經干細胞主要集中在齒狀回的亞顆粒細胞層。對每個小鼠的齒狀回SGZ區(qū)BrdU陽性細胞進行統(tǒng)計，結果顯示，對照組小鼠單位長度齒狀回中BrdU陽性細胞數量平均為29.53個，丙烯酰胺染毒組陽性細胞數量平均為 19.86 個(圖2-E)，丙烯酰胺染毒組BrdU陽性細胞數量比對照組極顯著降低了33.90%(P<0.01)。

圖 2　丙烯酰胺對小鼠齒狀回中成體神經干細胞增殖的影響 A.對照組；B.圖A放大效果圖；C.丙烯酰胺染毒組;D.圖C放大效果圖；E.2組小鼠BrdU陽性細胞數比較 圖A、C標尺長度為100 μm，B、D標尺長度為10 μmFig.2　Influence of acrylamide on proliferation of adult neural stem cells in dentate gyrus of mice A.Control group;B.Amplification of picture A;C.Neural stem cell of dentate gyrus in acrylamide poisoning group; D.Amplification of picture C;E.Number of BrdU positive cells in the two groups; Scale length in picture A and C is 100 μm while that in B and D was 10 μm

2.3丙烯酰胺對小鼠海馬組織中增殖相關基因mRNA表達的影響

圖3顯示，在JNK3、Akt1、Gsk-3β、RhoA、Rac1這些增殖相關基因中，mRNA表達量變化最為明顯的是Gsk-3β，丙烯酰胺染毒組小鼠海馬組織中Gsk-3β的mRNA表達量比對照組升高約3倍，差異極顯著(P<0.01)。其次是Akt1，其mRNA表達量比對照組升高2倍多，差異極顯著(P<0.01)。再次是RhoA，其mRNA表達量較對照組極顯著升高(P<0.01)。與對照組相比，丙烯酰胺染毒組小鼠海馬組織中JNK3和Rac1的mRNA表達量均顯著升高(P<0.05)。丙烯酰胺染毒后引起小鼠海馬組織中各增殖相關基因的表達量發(fā)生變化，說明丙烯酰胺中毒會導致小鼠海馬組織中這些基因表達量不同程度的升高。

圖 3　丙烯酰胺染毒后小鼠海馬組織中 各增殖相關基因的相對表達量Fig.3　Relative expression of proliferation genes in hippocampus of mice after acrylamide poisoning

3討論

丙烯酰胺是一種中等毒性的親神經毒物，水溶性強，可通過多種途徑進入生物體內，引起不同程度的神經系統(tǒng)損傷，Smith等[13]研究發(fā)現，在高劑量丙烯酰胺中毒時，動物機體不僅會出現周圍神經受損的癥狀，而且還會出現中樞神經受損癥狀。本試驗中，對小鼠進行丙烯酰胺染毒后，觀察到小鼠走路震顫,后肢無力,有時走路后肢呈劈叉姿勢等，這與Smith等[13]研究中所述癥狀相符，說明丙烯酰胺通過損傷小鼠神經系統(tǒng)導致運動障礙。

哺乳動物成體神經發(fā)生主要存在于海馬結構中的齒狀回和側腦室壁的室周帶。通過改變環(huán)境條件和提高機體代謝可以刺激成體神經發(fā)生，如加強鍛煉、豐富生存環(huán)境或限制飲食等[14]。本試驗中丙烯酰胺染毒組小鼠齒狀回中的神經干細胞數量、體質量均顯著降低，與Hee等[15]有關成體神經發(fā)生的研究結果相符，但在Hee等[15]的試驗中，染毒組小鼠與對照組小鼠體質量沒有表現出明顯差異，可能是動物品系、耐藥性等因素導致的。丙烯酰胺能影響小鼠成體神經發(fā)生，推測神經干細胞數量降低是導致小鼠運動行為障礙的因素之一。

本試驗發(fā)現，丙烯酰胺染毒組小鼠海馬組織中，JNK3 mRNA表達量升高，齒狀回神經干細胞數量減少，這與前人“JNK3高表達能促進神經干細胞凋亡”的研究結論[16-17]一致。研究發(fā)現，Gsk-3β與神經干細胞增殖相關，在小鼠發(fā)育時期，敲除Gsk-3β后，整個腦中神經前體細胞大量增殖[18]。據此可以推斷Gsk-3β是阻礙細胞增殖的一個因素。本研究中丙烯酰胺染毒小鼠海馬組織中Gsk-3β的mRNA表達量升高，齒狀回中神經干細胞減少。

研究發(fā)現，活化的Akt能促進細胞增殖，若雙敲除Akt1/Akt2，細胞增殖速度明顯減慢[19]。另外，Wu等[20]用一種降血脂藥物處理腦損傷小鼠后，其海馬組織中的Akt磷酸化水平升高，齒狀回SGZ區(qū)中的神經干細胞增殖數量增加。但Akt2并不介導細胞增殖[21]，因此本試驗只檢測了Akt1轉錄水平的變化，結果發(fā)現，與對照組相比，丙烯酰胺染毒組小鼠Akt1的mRNA水平極顯著升高，但齒狀回中的神經干細胞數量卻極顯著降低，與Wu等[20]結果不同的原因可能在于蛋白表達水平與轉錄水平不同，蛋白水平上存在著活性調節(jié)，本試驗結果說明，丙烯酰胺可能不是通過Akt1途徑來影響成體神經發(fā)生的。

Rho家族蛋白是一種重要的細胞內信號分子， 以多種信號途徑調節(jié)細胞的行為與功能，如細胞收縮、分裂、遷移、凋亡等[22]。Pierre等[23]研究發(fā)現，RhoA的持續(xù)性激活能阻止細胞中DNA從G1期向S期轉化，從而阻止細胞分裂。這與本試驗中RhoA表達量升高、神經干細胞增殖降低的結果相一致。另外，在大腦發(fā)育過程中，SVZ區(qū)神經前體細胞的增殖和分化都需要Rac1的參與[24]。但是對于Rac1的具體功能尚不清楚，本試驗中Rac1表達量升高，推測其可能也參與了成體神經干細胞的增殖抑制。

由于本研究僅檢測了增殖相關基因mRNA水平的變化，而未檢測其蛋白水平的變化，因此對丙烯酰胺影響成體神經發(fā)生的具體途徑，以及這種影響與增殖基因表達之間的關系，仍有待進一步研究。

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DOI：網絡出版時間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.006

[收稿日期]2014-12-10

[基金項目]西北農林科技大學人才引進專項基金項目(Z-111021101)

[作者簡介]張亞妹(1991-)，女，安徽蚌埠人，在讀碩士，主要從事分子神經生物學研究。E-mail：xinongzhangyamei@126.com [通信作者]趙善廷(1964-)，男，新疆烏魯木齊人，教授，博士生導師，主要從事分子神經生物學研究。 E-mail：zhaoshanting@nwsuaf.edu.cn

[中圖分類號]S852.21

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0039-06

Influence of acrylamide on adult neurogenesis and expression of proliferation associated genes of mouse

ZHANG Yamei,WANG Jiutao,SONG Lingzhen,ZHANG Wei,LI Lingling,YAN Runchuan,HU Xinde,ZHAO Shanting

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study investigated the influence of acrylamide poisoning on adult neurogenesis and expression of proliferation associated genes in hippocampus of mouse.【Method】 Twenty 10-week old male adult Kunbai mice with body weight of (30±2) g were randomly divided into control group and acrylamide exposure group.Acrylamide exposure group were exposed to acrylamide by intraperitoneal injection with a dose of 50 mg/kg for 14 days before injection of 50 mg/kg BrdU for 3 days and twice per day.The changes in body weight and behavioral activity was observed.Immunohistochemistry and BrdU labeling were used to investigate the effect on number of neural stem cells in the subgranular zone(SGZ).Influences of acrylamide on the expression of proliferation associated genes (JNK3,Akt1,Gsk-3β,RhoA and Rac1) were also examined using RT-PCR.【Result】 Result showed that the body weight of acrylamide exposed mice was significantly lower than that of the control group.The mice in acrylamide exposed group were listless with weak hind limbs,which showed splitting position when walking.BrdU-positive cells in experimentally acrylamide exposed mice were extremely significantly decreased compared with that in the control group (P<0.01).JNK3 and Rac1 mRNA expressions were remarkably increased (P<0.05),while Akt1,Gsk-3β and RhoA mRNA expressions were very significantly increased (P<0.01).【Conclusion】 Acrylamide poisoning suppressed the proliferation of adult neural stem cells of dentate gyrus in mouse and influenced the expression of JNK3,Akt1,Gsk-3β,Rac1 and RhoA in mouse hippocampus.

Key words:acrylamide poisoning;adult neurogenesis;immunohistochemistry;proliferation-associated gene

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.012.html