孫昌裕　　鄧靖宇　　梁寒

·國家基金研究進展綜述·

早期胃癌體液中分子標志物研究進展*

孫昌裕鄧靖宇梁寒

胃癌發(fā)生的機制目前仍未被完全闡明，盡管胃癌的診斷和治療技術已得到較大程度的提高，但其預后仍然不能讓人滿意，早診早治是提高胃癌總生存率的關鍵，常見的腫瘤標志物在臨床應用上卻易受限于其敏感性及特異性。隨著各種高通量技術的發(fā)展，分子標志物的基因組學及蛋白質組學的研究獲得突破，為胃癌早期診治提供了重要基礎，其中體液中分子標志物得益于其易獲得性逐漸受到關注。本文就近年來的早期胃癌相關體液分子標志物研究進行綜述。

胃腫瘤體液基因甲基化蛋白質

惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的疾病之一，胃癌在癌癥相關死因中占第3位。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多步驟的過程，涉及大量的分子參與和復雜的網絡調控。腫瘤分子標志物是指在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，由腫瘤細胞的基因表達而合成分泌，或機體對腫瘤反應而異常產生和/或升高的物質，廣義上也應包括因腫瘤而導致的不同分子水平的一系列異常改變。這些改變涉及基因及蛋白質等不同水平，有些則是腫瘤發(fā)生發(fā)展的驅動因素，發(fā)現(xiàn)其中的關鍵分子并確定為胃癌高危預警、早期診斷和有效治療的生物標志物，對當前胃癌的臨床治療具有重要意義，同時也是攻克胃癌的關鍵科學問題［1］。近年來，隨著技術的革新，越來越多的早期胃癌相關分子標志物被發(fā)現(xiàn)，其對于預測療效、判斷預后以及監(jiān)測治療反應均有作用。其中，體液中的分子標志物相比于其他來源的標志物具有易獲得性的優(yōu)點，在早期診斷方面有更廣闊的前景。

1　早期胃癌常見異常表達的基因水平標志物

1.1DNA甲基化

DNA甲基化為DNA化學修飾的一種形式，能在不改變DNA序列的前提下，改變相對應的遺傳表現(xiàn)，屬于表觀遺傳學的范疇。DNA甲基化與胚胎發(fā)育中的X染色體失活、基因印跡及基因組的結構穩(wěn)定性等相關，而抑癌基因的啟動子甲基化則導致該基因轉錄失活，在腫瘤研究中檢測基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，對于闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制及建立早期診斷方法均具有重要意義［2］。通過對胃癌相關基因甲基化的分析發(fā)現(xiàn)，多種相關基因甲基化是胃癌形成的重要機制之一，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，許多基因由于CpG島的異常甲基化而被沉默［3］。研究發(fā)現(xiàn)，PAX5、RNF180及PCDH10基因啟動子甲基化在胃癌發(fā)生中起重要作用，并且與胃癌惡性程度相關［4-6］。Abbaszadegan等［7］通過甲基化特異性PCR（MSP）和免疫組織化學等方法對52例胃癌患者組織中p16基因甲基化及蛋白表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)p16基因甲基化與胃癌具有顯著相關性。

2　早期胃癌常見異常表達的蛋白質標志物

2.1蛋白質組學分析

蛋白質組學類似于基因組學的概念，指一個基因組、一個細胞或組織所表達的全部蛋白質的總和。蛋白質組學是后基因組時代研究的一個新領域，通過在蛋白質水平上對細胞或機體基因表達的終產物進行定性和定量的研究，揭示生命活動的過程和規(guī)律及基因表達的調控機制。研究技術主要由雙向凝膠電泳（2-DE）、質譜（MS）鑒定技術、蛋白質/抗體微陣列（蛋白質/抗體芯片）及生物信息學4部分組成［17］。通過應用蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)大量早期胃癌特異性蛋白質。Lu等［18］通過分析胃癌患者血清中的多肽譜峰，發(fā)現(xiàn)質荷比為4665的多肽譜峰在Ⅰ/Ⅱ期胃癌與Ⅲ/Ⅳ期胃癌患者中的差異具有統(tǒng)計學意義，特異度和敏感度分別為91.6%和95.4%，預示其可作為早期胃癌的分子指標。Liu等［19］發(fā)現(xiàn)6種多肽譜峰，在早期胃癌檢測中的特異度和敏感度分別為75% 和100%。Li等［20］發(fā)現(xiàn)質荷比為1741～4210的多肽譜峰在胃癌、胃癌前病變與健康對照之間差異最為明顯，該研究檢出胃癌和癌前病變患者的敏感度為66.7%，特異度為77.3%。以上的研究表明血清蛋白質組學分析對篩選胃癌標志物，尤其是早期胃癌標志物具有重要意義，且這些標志物相比于傳統(tǒng)蛋白標志物具有較高的靈敏度和特異度。

2.2芳香族氨基酸

除血清之外胃液中也含有提示胃內早期腫瘤病變的成分。Deng等［21］應用液相色譜法檢測胃液中的芳香族氨基酸，結果顯示芳香族氨基酸有助于區(qū)分早期胃癌與非胃癌患者。酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸診斷早期胃癌的ROC曲線下面積分別為79.0%、83.1%及81.9%，而苯丙氨酸檢出早期胃癌的敏感度和特異度分別為75.5%和81.4%。

2.3胃蛋白酶原

目前我國臨床上推薦胃蛋白酶原（PG）作為早期胃癌篩查指標。中國早期胃癌篩查及內鏡診治共識意見（2014年）推薦使用PGⅠ濃度≤70 g/L，且PGⅠ/ PGⅡ≤7.0作為高發(fā)區(qū)胃癌篩查的界值。

2.4顆粒體蛋白

顆粒體蛋白（granulin，GRN）為一種獨立的生長因子家族，來源于顆粒蛋白前體的水解，在動物機體組織中廣泛存在，調節(jié)其生長發(fā)育和損傷修復等過程，并在多種癌組織中高表達。Loei等［22］發(fā)現(xiàn)GRN在胃癌患者，尤其是早期胃癌患者的血清中表達增高，提示其具有早期診斷價值。

3　早期胃癌細胞水平上的相關檢測

3.1幽門螺桿菌檢測

幽門螺桿菌（helicobacterpylori，Hp）是一種螺旋形、微厭氧、對生長條件要求十分苛刻的細菌。1983年首次從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中分離成功，是目前所知能夠在人胃中生存的唯一微生物種類。Hp感染導致萎縮性胃炎（chronic atropic gastritis，CAG）、腸上皮化生（intestinal metaplasia，IM）、異型增生等胃黏膜病變，這些病變逐步向腫瘤靠近。Shiotani等［23］對100例行胃鏡黏膜剝離（endo?scopic mucosal resection，EMR）切除術的早期胃癌患者進行根除Hp治療，根除組、未根除組和陰性組異時性胃癌的發(fā)生率分別為11.1%、9.1%和11.2%，無顯著性差異，但根除Hp前對患者進行了胃體小彎萎縮評分，胃癌組全部為重度CAG，與無癌組相比具有顯著性差異（P=0.03）。根除Hp可以顯著改善胃黏膜CAG和IM，進而降低胃癌的發(fā)生。

3.2外泌體檢測

外泌體是由多種活細胞分泌到細胞外直徑為40～100 nm一種囊泡小體，其內容物含蛋白質、脂質和核酸等。胃癌細胞的外泌體可通過自分泌機制活化PI3K/PKB（又稱Akt）和MAPK/ERK信號通路，促進腫瘤細胞的增殖。胃癌細胞能選擇性地將Let-7包裝到外泌體中，并釋放至周圍環(huán)境中，促進胃癌的惡性進展。Gu等［24］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞來源的外泌體具有誘導分化的能力，使間質干細胞向腫瘤細胞相關的成纖維細胞分化，這一過程涉及TGF-β/Smad蛋白通路的激活。

3.3循環(huán)腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是由腫瘤組織脫離并進入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞，是導致腫瘤復發(fā)、轉移的關鍵。血液循環(huán)中的腫瘤細胞具有原發(fā)病灶內的腫瘤細胞學和基因遺傳學特征，CTCs及轉移病灶中的腫瘤細胞會因壞死和凋亡向外周血釋放DNA，即循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。CTCs陽性的胃癌患者遠處轉移及復發(fā)的概率明顯增高，而胃癌CTCs高陽性率者較CTCs低陽性率者的預后更差，且生存期更短。Matsusaka等［25］報道，外周血中CTCs數(shù)量越多，腫瘤細胞轉移的負荷越大，發(fā)生轉移的可能性也越大。目前有關ctDNA的研究主要集中在DNA甲基化，可能成為早期胃癌診斷的新方向。

4　結語

現(xiàn)代醫(yī)學的背景下，制約胃癌的治療效果的因素不再是各種治療手段，而是胃癌是否能夠早診早治。近年來，隨著高通量技術的發(fā)展，大量有關分子標志物的研究不斷開展，對胃癌的分子病理學有了新的認識?；蚪M學及蛋白質組學成為胃癌診斷及預后研究的利器，使得胃癌的早期篩查及分層個體化治療成為可能。高效能的分子標志物在早期診斷，評估遠處轉移，預測治療療效及復發(fā)和預后的評估方面能夠發(fā)揮重要作用。但仍存在一些問題：1）各種分子標志物的表達可能存在個體間的差異，會受到諸如缺氧、感染、細胞毒性藥物、耐藥性的影響，如何保證一種標志物穩(wěn)定可靠的表達是首先考慮的問題；2）更為高效、快捷的檢測手段必不可少，如DNA甲基化的檢測，目前主要手段是甲基化特異性PCR，操作步驟繁瑣、時間長、費用高，不適用于大量推廣；3）目前發(fā)現(xiàn)早期診斷分子標志物的主要方法是首先篩選進展期胃癌與正常組織相比的特有分子改變，現(xiàn)均樣本量較小，還需要后續(xù)大樣本、多中心的研究。總之，針對胃癌早期診斷發(fā)現(xiàn)有效分子標志物的工作具有重要的臨床意義及廣闊的前景。

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（2016-04-19收稿）

（2016-06-22修回）

Investigation progress of molecular biomarkers from body fluids in early gastric cancer

Changyu SUN，Jingyu DENG，Han LIANG
Correspondence to:Han LIANG；E-mail:tjlianghan@126.com
Department of Gastroenterology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China
This work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China（No.81572372），and the Application Foundation and Advanced Technology Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission（No.15JCYBJC24800）

The mechanism of gastric cancer（GC）remains unclear.The diagnosis and treatment of GC undergo rapid development，but the prognosis of the patients remains dismal.The key procedure to improve overall survival is early detection and treatment.However，classic tumor markers have several limitations in clinical practice because of their low sensitivity and specificity.Given the expansion of high throughput technologies，investigators have attained considerable progress in obtaining the benefits of molecular biomarkers through genomics and proteomics analysis.These findings provide new directions for the diagnosis and treatment of early-stage GC. Markers from body fluids，which can be easily obtained，are increasingly gaining attention.This article summarizes the progress of the investigation of molecular biomarkers in early GC using body fluids.

stomach，neoplasms，body fluids，genes，methylation，proteins

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.13.443

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院胃部腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）
*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81572372）和天津市科委應用基礎與前沿技術研究計劃項目（編號：15JCYBJC24800）資助

梁寒tjlianghan@126.com

手術標本及各種體液，如外周血漿中均可檢測到DNA甲基化異常，為臨床應用帶來極大便利。因此，腫瘤相關基因啟動子甲基化狀態(tài)是一種非常有前途的生物標記物，可作為腫瘤的敏感性生物標志物。目前已開展應用血漿及胃灌洗液作為標本進行DNA甲基化檢測。Zhang等［8］應用MSP法檢測胃癌患者和對照者血漿中腫瘤凋亡相關因子SFRP2和RNF180基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，結果顯示兩個基因在胃癌患者血漿中的甲基化率顯著高于正常健康者，且與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移等相關，而聯(lián)合檢測胃癌患者血漿中SFRP2及RNF180甲基化水平優(yōu)于任一基因單獨檢測。Oishi等［9］則利用胃灌洗液提取DNA，對128例早期胃癌患者標本，分為內鏡治療前組（64例）及內鏡治療后組（64例），甲基化檢測結果證實治療前組甲基化水平顯著高于治療后組，提示胃灌洗液DNA檢測的可行性。

1.2微小RNA

微小RNA（microRNA，miRNA）指18～25個核苷酸長度的非編碼RNA序列，由DNA轉錄而來，但不會被翻譯為蛋白質，通過與靶基因mRNA堿基配對降解mRNA或阻礙其翻譯，起到靶基因沉默作用。miRNA在腫瘤中根據(jù)其作用靶基因不同，可起促進腫瘤生長、轉移或抑制作用。miRNA可在血液中檢測到，且其特質不會因性別、年齡有所差異［10］。因此，血清/血漿miRNA檢測可作為多種腫瘤的新型分子標志物。目前miRNA主要通過即時聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）研究，標本來源包括胃癌組織、血清/血漿及胃液。其中血清/血漿及胃液作為標本意義較大，miRNA包括miRNA21、miRNA25、miRNA27a、miRNA106b、miRNA129、miRNA181c、miRNA191、miRNA199a、miRNA223及miRNA421［11］，均被證實與細胞增殖分化及轉移有關，并與腫瘤大小、浸潤深度、TNM分期、分化類型等臨床病理因素具有一定的相關性。

Cai等［12］報道，血漿miRNA對于早期胃癌的診斷具有一定價值，早期胃癌患者血漿中miRNA106b、miRNA20a和miRNA221明顯升高，用于診斷胃癌的ROC曲線下面積分別為77.3%、85.9%和79.6%。Shiotani等［13］分析87例行內鏡治療的早期胃癌患者血清中miRNA含量，結果顯示miRNA106b及miR?NA21可作為預測胃癌高風險人群的指標。Zhang等［14］發(fā)現(xiàn)，胃癌患者胃液中miRNA421明顯高于胃內良性病變患者，其ROC曲線下面積為76.7%。以上為較典型的早期診斷標志物研究。

1.3長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是真核細胞中一類轉錄本長度超過200 nt的非編碼RNA分子，無或較少有蛋白編碼功能，在哺乳動物基因組普遍被轉錄，也是近年來關注的一種非編碼RNA。其與miRNA類似也可在血液及胃液中檢測到，可能成為早期診斷胃癌的分子標志物。目前的研究包括lncRNACUDR、lncRNA-HOTAIR、lncRNA-BLACAT1、lncRNACCAT1、lncRNA-GAPLINC、lncRNA-HIF1A-AS2及l(fā)ncRNA-ABHD11-AS1。其中可作為早期診斷標志物的為lncRNA-CUDR，可在血漿中檢測到，且與患者的總生存期具有相關性［15］。另一項研究顯示，lncRNAABHD11-AS1水平在早期胃癌患者的胃液中顯著升高，結合血清及胃液中CEA檢測可提高其準確性［16］。

孫昌裕專業(yè)方向為胃腸腫瘤的臨床和基礎研究。E-mail：scydaidai@126.com