羅　敏，舒　磊，李映瑩，錢志強(qiáng)，石京山，鄧　江

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

人參莖葉總皂苷抑制肺纖維化小鼠血清氧化水平的研究

羅敏1,2，舒磊1,2，李映瑩1，錢志強(qiáng)1，石京山1，鄧江1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察人參莖葉總皂苷(TG)對博萊霉素(BLM)致小鼠肺間質(zhì)纖維化模型的保護(hù)作用。方法 將120只昆明種小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組、模型對照組、人參莖葉總皂苷(40、80、160 mg/kg) 組及醋酸潑尼松(5 mg/kg)組。氣管內(nèi)灌注博來霉素(5 mg/kg)建立小鼠肺纖維化模型，制模后連續(xù)給藥28 d，觀察各組小鼠肺組織病理形態(tài)改變，檢測小鼠血清中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量，總抗氧化能力(T-AOC)、羥自由基(.OH)水平，超氧化物歧化酶(SOD)及髓過氧化物酶(MPO)活力。結(jié)果 制模28 d后，模型組小鼠肺系數(shù)明顯高于假手術(shù)對照組(P<0.01)，肺泡炎及肺纖維化明顯，血清中.OH、MPO水平及MDA的含量增高，GSH含量、T-AOC水平及SOD的活力顯著下降(P<0.05)。與模型對照組比較，TG(80、160 mg/kg)及醋酸潑尼松給藥能使模型小鼠的肺系數(shù)明顯降低(P<0.01)；肺纖維化程度明顯減輕，且血清中.OH水平、MPO活力、MDA含量顯著下降，而使GSH含量、T-AOC水平及SOD活力明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 TG對博來霉素所致的小鼠肺纖維化具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抑制氧化損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]人參莖葉總皂苷；肺纖維化；博萊霉素；氧化損傷；小鼠

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)又稱為肺間質(zhì)疾病，是一組由多種病因所引起的彌漫性肺間質(zhì)疾病[1]，嚴(yán)重危害人類健康。大部分患者因慢性、進(jìn)行性肺纖維化導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓、呼吸困難、肺源性心臟病和右心衰竭死亡，臨床預(yù)后差，且肺纖維化一旦形成則很難逆轉(zhuǎn)。其發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，目前尚無有效的藥物治療，常用藥物主要有糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，但因其不良反應(yīng)而成為臨床應(yīng)用受限[1-2]。因此迫切需要積極尋求一種療效高、不良反應(yīng)輕的治療藥物用于肺纖維化的治療。人參皂苷為我國名貴中藥人參(PanaxginsengC.A. Mayer)的主要有效成分，生物活性廣泛，其對機(jī)體許多系統(tǒng)均有調(diào)節(jié)作用[3-5]。已有的研究表明人參皂苷具抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能等多種藥理活性[6-8]。人參皂苷類化合物已被證實(shí)具有抗氧化，清除氧自由基作用[9]，而氧化損傷在炎癥和免疫介導(dǎo)的肺組織損傷及激發(fā)纖維化的主要病理過程中扮演了重要角色[10]。為了探索人參莖葉總皂苷是否可通過抗氧化損傷而抑制肺纖維化的病程進(jìn)展，本研究擬建立博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，探討人參莖葉總皂苷抗肺纖維化作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器人參莖葉總皂苷(total ginsenosides, TG)，北京天然藥物研究院(純度98%)；博來霉素(bleomycin, BLM)，浙江海正藥業(yè)股份有限公司(批號：120901)；醋酸潑尼松(Prednisone)，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司(批號：141135)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、總抗氧化能力(T-AOC)、羥自由基(.OH)、髓過氧化物酶(MPO)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；Masson試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；Olympus光學(xué)顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)，日本Olympus公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組給藥SPF級昆明種小鼠120只，雌雄各半，體重18～22 g，由第三醫(yī)科大學(xué)大坪醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號SCXK(渝)2012-0005。小鼠分籠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后隨機(jī)分為①假手術(shù)對照組(Sham)，②模型對照組(Model，氣管內(nèi)注入BLM 5 mg/kg)，③人參莖葉總皂苷40、80和160 mg/kg給藥組(TG-40、TG-80、TG-160)，④醋酸潑尼松5 mg/kg給藥組(Prednisone)，各組氣管內(nèi)灌注液體容量為0.1 mL/10g每組20只，雌雄各半。于造模次日灌胃給藥(i.g)，假手術(shù)與模型對照組均以同體積蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥28 d。

1.3模型制備[11]小鼠稱重后以3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，頸正中切口，分離暴露氣管，于氣管軟骨環(huán)間隙向心方向氣管腔內(nèi)緩慢注入BLM (5 mg/kg)，注藥后立即將小鼠直立沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3 min，使藥液在雙肺內(nèi)均勻分布，縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送SPF級觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)對照組小鼠在相同條件下經(jīng)氣管注入等體積生理鹽水。所有小鼠術(shù)后肌肉注射芐星青霉素預(yù)防感染。飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)準(zhǔn)則。

1.4動(dòng)物一般狀況及死亡率觀察制備模型后，每天觀察動(dòng)物的一般狀況如活動(dòng)情況、毛發(fā)、攝食、呼吸等，每5 d稱體重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，連續(xù)給藥28 d，統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的存活情況并計(jì)算死亡率。

1.5肺系數(shù)計(jì)算及肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察末次給藥后，小鼠以3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，取血后取肺組織稱重，根據(jù)公式計(jì)算肺系數(shù)：肺系數(shù)=肺重(mg)/體重(g)。取右肺下葉，4%中性福爾馬林中固定24 h，再經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋切片后，進(jìn)行Masson及HE染色，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。HE染色細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)呈紅色；Masson染色可使膠原纖維呈淡藍(lán)色。參照Szapiel等[12]的方法，用HE染色評定肺組織肺泡炎癥程度：0級——無肺泡炎，計(jì)0分； I級——輕度肺泡炎，受累面積小于全肺的20%，計(jì)1分；II級——中度肺泡炎，受累面積為全肺的20%～50%，計(jì)2分；III級——重度肺泡炎，全肺呈彌漫性病變分布，受累面積超過全肺的50%，計(jì)3分。以Masson染色評定肺組織纖維化程度：0級——無肺間質(zhì)纖維化，計(jì)1分；I級——輕度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍小于全肺的20%，計(jì)1分；II級——中度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍占全肺的20%～50%，計(jì)2分；III級——重度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍超過全肺的50%，肺泡融合，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，計(jì)3分。

1.6小鼠血清中丙二醛及谷胱甘肽含量、總抗氧化能力及羥自由基水平、超氧化物歧化酶及髓過氧化物酶活力測定麻醉后經(jīng)眼眶靜脈取血，3 500 rpm離心10 min，取上清液留存，用于小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、羥自由基(.OH)水平、髓過氧化物酶(MPO)活力測定，測定方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1人參莖葉總皂苷(TG)對肺纖維化小鼠一般狀態(tài)、死亡率及肺系數(shù)的影響假手術(shù)小鼠活潑好動(dòng)，毛發(fā)光澤發(fā)亮，體重逐漸增加，嘴角紅潤，呼吸平穩(wěn)，飲食及大便正常；模型組小鼠制模后出現(xiàn)不同程度飲食、活動(dòng)減少，呼吸急促，精神萎靡，毛枯，1周后出現(xiàn)體重減輕；潑尼松組和TG各給藥組小鼠制模開始1周內(nèi)表現(xiàn)與模型組相似，1周后逐漸好轉(zhuǎn)。制模28 d后，模型組動(dòng)物死亡7只；潑尼松組死亡2只；TG-40組死亡4只；TG-80組死亡2只；TG-160組及假手術(shù)組無動(dòng)物死亡。且模型對照組小鼠肺系數(shù)較假手術(shù)對照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，TG及潑尼松給藥后小鼠肺系數(shù)顯著降低(P<0.01，見表1)。

組別組別代碼樣本量肺系數(shù)(mg/g)死亡率(%)假手術(shù)對照組Sham206.66±0.220模型對照組Model1313.93±1.04**35潑尼松5mg/kg給藥組Prednisone167.83±0.02##10TG40mg/kg給藥組TG-401813.43±5.0520TG80mg/kg給藥組TG-80209.83±0.27##10TG160mg/kg給藥組TG-160187.79±0.60##0

與假手術(shù)組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。

2.2人參莖葉總皂苷(TG)對肺纖維化小鼠肺組織病理形態(tài)的影響如圖1所示，HE染色顯示假手術(shù)對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組及TG-40小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤，肺纖維化形成。TG-80、TG-160及潑尼松組小鼠肺泡間隔輕度增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤，肺組織纖維化程度減輕。采用Masson染色結(jié)果顯示(見圖2)，假手術(shù)對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，無肺泡炎及膠原纖維。而模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡坍陷融合，可見大量藍(lán)色寬帶狀及片狀膠原纖維，呈彌漫性肺纖維化。TG-80、TG-160及醋酸潑尼松組肺泡壁輕度增厚，出現(xiàn)少量肺泡炎，可見少量絲狀或點(diǎn)狀藍(lán)色膠原纖維，肺組織纖維化明顯減輕。各組肺泡炎和肺纖維化程度評分見表2。

A：假手術(shù)對照組；B：模型對照組；C：潑尼松5 mg/kg給藥組；D：TG 40 mg/kg給藥組；E：TG 80 mg/kg給藥組；F：TG 160 mg/kg給藥組。圖1　人參莖葉總皂苷(TG)對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠病理形態(tài)學(xué)的影響(HE，×200)

A：假手術(shù)對照組；B：模型對照組；C：潑尼松5 mg/kg給藥組；D：TG 40 mg/kg給藥組；E：TG 80 mg/kg給藥組；F：TG 160 mg/kg給藥組。圖2　人參莖葉總皂苷(TG)對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠病理形態(tài)學(xué)的影響(Masson，×200)

組別代碼樣本量肺泡炎評分肺纖維化評分Sham200.00±0.000.00±0.00Model132.65±0.24**2.90±0.21**Prednisone161.92±0.51##2.25±0.62##TG-40182.46±0.662.62±0.51TG-80201.75±0.46##2.13±0.64##TG-160181.63±0.52##1.88±0.35##

與假手術(shù)組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。

2.3人參莖葉總皂苷(TG)對肺纖維化小鼠血清中丙二醛及谷胱甘肽含量、總抗氧化能力及羥自由基水平、超氧化物歧化酶及髓過氧化物酶活力的影響模型組小鼠血清中SOD活性、GSH含量及T-AOC水平較假手術(shù)組明顯降低，MDA含量、.OH水平及MPO活力均顯著升高(P<0.05)；TG-80、TG-160及醋酸潑尼松給藥組可明顯升高小鼠血清中SOD活性、GSH含量及T-AOC水平，而顯著降低MDA含量、.OH水平及MPO活力(P<0.05，見表3)。

組別代碼SOD活性(U/mL)GSH含量(mg/L)T-AOC水平(U/mL)MDA含量(nmol/mL).OH水平(U/mL)MPO活力(U/L)Sham124.92±19.710.82±0.065.99±0.579.84±0.9859.17±0.663.33±0.01Model88.09±15.33**0.50±0.13**3.24±0.22**19.11±2.13**63.23±0.10**6.72±0.16**Prednisone115.33±25.39#0.66±0.13#5.15±0.37##11.73±1.82##60.66±0.43##3.53±0.14##TG-40102.95±29.710.57±0.043.26±0.2416.09±7.4462.03±0.055.17±0.12TG-80113.69±22.57#0.65±0.044.74±0.29##15.36±3.79#61.61±0.12#4.58±0.27#TG-160125.99±20.88##0.72±0.03##5.93±0.41##11.05±2.03##60.02±0.25##3.44±0.07##

與假手術(shù)組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3討論

肺纖維化是多種彌漫性肺間質(zhì)疾病的最終轉(zhuǎn)歸，其發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，目前尚無特效藥物治療，臨床預(yù)后差。氣管內(nèi)注入博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型是國際上普遍采用的一種方法，與人類肺纖維化性質(zhì)相近[13]。本實(shí)驗(yàn)通過建立氣管內(nèi)注入博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，研究TG對肺間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用。

肺纖維化的形成涉及致病因子對肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞彌漫性損害，啟動(dòng)炎癥免疫反應(yīng)，有多種炎性細(xì)胞參與，釋放各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，造成組織損傷，并引起間質(zhì)增生，繼而形成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖以及膠原和細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)的代謝紊亂，加重炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織改建和功能損害[14]。在本研究中TG各給藥組與模型組比較，造模1周后生存狀況逐漸好轉(zhuǎn)，且小鼠死亡率顯著降低，表明TG對博來霉素所致小鼠肺纖維化具有良好的防治作用。肺組織病理形態(tài)學(xué)改變是判斷肺纖維化最直觀、重要的指標(biāo)。HE染色和Masson膠原染色結(jié)果表明，TG可明顯減輕模型小鼠肺泡結(jié)構(gòu)受損及肺泡間隔增厚的程度，減少炎性細(xì)胞浸潤及膠原纖維含量，表明TG能明顯抑制小鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。肺系數(shù)是反映肺纖維化程度的指標(biāo)之一[15]，在肺纖維化的形成過程中，由炎癥滲出、細(xì)胞腫脹、毛細(xì)血管充血等多種因素造成的肺重量增加，而且造模后動(dòng)物身體狀況下降，導(dǎo)致體重減輕，故模型組小鼠肺系數(shù)顯著升高。本實(shí)驗(yàn)中，TG 可顯著降低模型小鼠的肺系數(shù)，進(jìn)一步證明了TG防治小鼠肺纖維化的效應(yīng)。

氧化-抗氧化失衡參與了肺纖維化的形成過程，博萊霉素能刺激肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，可引起活性氧生成和GSH消除增加及.OH水平增高[16-17]。SOD和GSH是拮抗氧化應(yīng)激、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要物質(zhì)。GSH量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素，在細(xì)胞清除氧化物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]；T-AOC是非酶促體系的抗氧化物質(zhì)和酶促體系少數(shù)小分子量抗氧化物質(zhì)的總和，是反映機(jī)體抗氧化作用的重要指標(biāo)之一，可直接反映機(jī)體抗氧化酶的活力[19]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，含量高低也可以反映體內(nèi)自由基過氧化的程度；.OH是已知氧化性最強(qiáng)和毒性最大的氧自由基[20]，也是導(dǎo)致肺組織氧化損傷的重要因素之一。這些氧自由基和抗氧自由基系統(tǒng)的失衡是導(dǎo)致肺纖維化發(fā)病機(jī)制之一，Cantin等[21]在1987年首次發(fā)表了肺纖維化中氧化應(yīng)激的研究報(bào)告，證實(shí)髓過氧化物酶(MPO)活力升高是導(dǎo)致肺纖維化中氧化損傷的另一個(gè)發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，TG-80、TG-160能顯著提高肺纖維化模型小鼠血清中SOD、GSH及T-AOC的水平，而降低MDA、.OH及MPO的活力。提示TG通過調(diào)節(jié)肺纖維化小鼠血清中自由基水平而抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化。其作用機(jī)制是否與影響線粒體氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)，還有待進(jìn)一步的深入研究。

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[收稿2016-04-08;修回2016-05-16]

(編輯：王靜)

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81360660)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：2012-2349)。

[通信作者]鄧江，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)、抗炎免疫藥理學(xué)，E-mail:dengjiang1225@sina.com。

[中圖法分類號]R963

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)03-0260-06

Effects of total ginsenosides on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice

LuoMin1, 2,ShuLei1, 2,LiYingying1,QianZhiqiang1,ShiJingshan1,DengJiang1

(1.Department of Pharmacology, Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China;2.School of Pharmaceutical Science, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To observe the protective effect of total ginsenosides on bleomycin (BLM) induced differentiation of mouse model with pulmonary fibrosis.Methods 120 Kunming mice (bisexual each half) are randomly divided into Sham-operation control group, model control group, total ginsenosides, TG (40, 80, 160 mg/kg)and prednisone group (5 mg/kg). After molding continuous administration 28 days, we will observe the pathological changes of lung tissue in every group of mice and superoxide dismutase (SOD), malon- dialdehyde (MDA), glutathione (GSH), total antioxidant capacity (T-AOC), hydroxyl radical (.OH), myeloperoxidase (MPO) vitality in serum of mice were detected.Results After molding 28 days, the lung coefficient of model mice is significantly higher than sham group (P<0.01), alveolitis and pulmonary fibrosis become obvious, the content of .OH, MPO, MDA in serum significantly increase (P<0.05), GSH content, T-AOC level and activity of SOD was remarkably decreased (P<0.05). The administration with TG and prednisone to make mice lung index decrease and pathomorphism ameliorate significantly comparing with the model group (P<0.01).Conclusion TG induced protection against pulmonary fibrosis by bleomycin in mice are involved, at least in part, to its inhibitory effects on oxidative damage.

[Key words]total ginsenoside; pulmonary fibrosis; bleomycin; oxidative damage; mice