唐富山，孟　翠，楊春先，原凌燕

(1.遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學院 護理學院，貴州 遵義　563099)

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基礎醫(yī)學研究

構建含5-氟尿嘧啶的自組裝短肽原位水凝膠的初步流變學研究

唐富山1，孟翠1，楊春先1，原凌燕2

(1.遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學院 護理學院，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 探討構建含5-氟尿嘧啶(5-Fu)的自組裝短肽RAD16-I原位水凝膠的可能性。方法 采用流變儀測量短肽水溶液與磷酸鹽緩沖液(PBS)混合前后的儲存模量、損耗模量、相位角等流變學參數(shù)，表征含5-Fu的RAD16-I水溶液在模擬生理條件下形成水凝膠的情況；通過倒置顯微鏡觀察含5-Fu的RAD16-I水溶液加入細胞培養(yǎng)基后形成的水凝膠及細胞的形態(tài)，考察含5-Fu 的RAD16-I溶液在細胞培養(yǎng)基中形成水凝膠、維持凝膠狀態(tài)的情形和水凝膠中藥物對細胞的作用。結果 不含和含5-Fu的RAD16-I水溶液在PBS或細胞培養(yǎng)基中均能形成凝膠，凝膠呈透明的膜片狀，在培養(yǎng)基中與細胞共處時，含藥水凝膠較好地維持其凝膠狀態(tài)和5-Fu的抗腫瘤效果。結論 自組裝短肽可以作為5-Fu等抗腫瘤藥物的載體材料加以開發(fā)。

[關鍵詞]自組裝短肽; 5-氟尿嘧啶; 原位凝膠; 流變學; 藥物載體材料

為提高抗腫瘤藥物的療效并降低不良反應，除口服和靜脈用藥外，局部或腔內(nèi)途徑實施抗腫瘤藥物給藥的研究方興未艾[1-3]，以不同材料構建抗腫瘤藥物的原位凝膠給藥系統(tǒng)是其中一個重要的研究分支[4-5]。近年來，不少研究者都意識并關注載體材料對主藥活性的影響[6]以及所涉及的給藥體系的生物安全性問題[7]。由于結構設計簡單可控、自組裝特性和生物相容性良好，離子互補型自組裝短肽得到許多新型生物材料領域研究者的注意[8-10]，在生物醫(yī)藥領域探討開發(fā)自組裝短肽為藥物載體的研究是其中頗具特色的部分[11-12]。已有研究表明，離子互補性自組裝短肽不僅能作為膠體穩(wěn)定劑表現(xiàn)出水難溶性藥物載體的潛力[13-14]，而且在體液離子強度和/或pH條件下能夠迅速形成具有一定機械強度的水凝膠而顯示出具有成為藥物原位水凝膠載體的潛力[15]。本文采用臨床常用且抗腫瘤療效較為顯著的5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-Fu)為模型[16]，初步探討自組裝短肽原位水凝膠用作抗腫瘤藥物局部給藥載體的可能性。

1材料與方法

1.1儀器與藥品流變儀，AR200ex，TA instruments, USA；恒溫金屬浴，CHB-100，杭州博日科技有限公司。

RAD16-I(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)，上海波泰公司商業(yè)合成，純度≥98%，溶解于水配成1%(w/v)，臨用前稀釋為所需濃度；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-Fu)，批號為0373B11，AMRESCO產(chǎn)品，生工生物工程(上海)有限公司分裝。

乳腺癌細胞株，MDA-MB-435S，四川大學納米生物醫(yī)學與膜生物學研究所保存；L-15培養(yǎng)基、胎牛血清，美國invitrogen公司。

其余試劑為分析純，溶液配制用超純水。磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)按照中國藥典方法配制。

1.2試驗方法

1.2.1自組裝短肽形成原位水凝膠的流變學試驗由1%RAD16-I水溶液稀釋而得0.1%、0.2%、0.5%的短肽水溶液，含5-Fu的不同RAD16-I濃度的水溶液由1% RAD16-I水溶液和5-Fu水溶液混合并稀釋而得，并分別取適量稀釋后溶液與等體積PBS混合。采用流變儀來測量不同濃度的短肽水溶液與PBS混合前后的儲存模量G′、損耗模量G″和相位角Δ。測量用夾具直徑20 mm，不銹鋼錐板錐度1o，平截25 μm。應變設為固定的0.5%。頻率掃描(frequency sweep test)時頻率范圍設為0.1～100 Hz，時間掃描(time sweep test)時頻率設為1.0 Hz。加蓋防止溶液揮發(fā)，帕耳貼板控溫系統(tǒng)控制溫度為25 ℃。每次測量用70 μL樣品。

1.2.2細胞培養(yǎng)基中自組裝短肽原位水凝膠的觀察二維細胞貼壁達80%時，胰酶消化，離心(1 000 rpm，5 min)，細胞計數(shù)，細胞終濃度為1×104/孔，接種于96孔板培養(yǎng)。置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在分別培養(yǎng)1 d后，更換培養(yǎng)基，加入含抗腫瘤藥物的RAD16-I溶液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于24、48 h觀察水凝膠和細胞的狀態(tài)，包括水凝膠的形狀、透明程度、凝膠狀態(tài)的維持情況以及不同給藥情形下培養(yǎng)基或水凝膠中腫瘤細胞的細胞密度、細胞形狀。

2結果

2.1含抗腫瘤藥物的RAD16-I溶液形成原位水凝膠的特性表1結果表明, 在不含藥物的RAD16-I水溶液中，G′近似或略大于G″，G′和G″隨短肽濃度增加變化很??；當加入等體積PBS后，盡管短肽的濃度實際上下降了1/2，但與加入PBS前相比，G′顯著增大且增加幅度隨短肽濃度增加而增加(P<0.01)，G″也有增加但增加幅度比G′小很多(P<0.01)，Δ顯著變小(P<0.01)。在不含藥物的短肽濃度均為0.5%(w/v)的RAD16-I溶液加入PBS后，表示彈性的G′增加了107倍(見表1)。

含5-Fu的RAD16-I與不含藥物的RAD16-I水溶液中有所不同。在0.1%短肽濃度下，加入PBS后G′和G″均減小(P<0.05)，但Δ值變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在0.2%短肽濃度下，加入PBS前后，各流變學參數(shù)均無顯著變化 (P>0.05)；在0.5%短肽濃度下，加入PBS后G′和G″均大幅增加(P<0.01)，Δ值增加(P<0.05，見表1)。由圖1可知，加入PBS后與加入前相比，G′和G″均顯著增加；然而，在頻率為10 Hz以下時，G′隨頻率變化的變化幅度都很小，且在不同頻率下G′均遠大于G″。說明5-Fu的水溶液也能像PBS一樣使RAD16-I溶液成水凝膠或使水凝膠的機械強度增加。

2.2細胞培養(yǎng)基中的自組裝短肽原位水凝膠圖2所示為不含藥物和含5-Fu的RAD16-I溶液在細胞培養(yǎng)基中形成的原位水凝膠經(jīng)過與細胞共同孵育48 h的顯微鏡照片?？梢姡缓秃?-Fu的RAD16-I均能在培養(yǎng)基中形成凝膠，水凝膠呈透明膜片狀；在未更換培養(yǎng)基情況下，水凝膠與細胞共處48 h時仍然很好地保持其存在狀態(tài)。圖3所示的顯微鏡照片分別表示含5-Fu的RAD16-IΔ、G′和G″分別為流變學參數(shù)相位角、儲存模量和損耗模量，Δ的正切值等于G″與G′之比。表中數(shù)據(jù)為在1 Hz頻率和固定應變0.5%的條件下，對不含和含五氟尿嘧啶(5-Fu)的RAD16-I溶液與等體積PBS混合前后分別進行時間掃描的流變學參數(shù)。在與PBS混合前5-Fu濃度為2.05 mg/mL。R：不含藥物的RAD16-I水溶液；RP：R與等體積PBS混合后；RF：含5-Fu的RAD16-I溶液；RFP：RF與等體積PBS混合后。a: 與“R”組相比，P<0.01；b: 與“RF”組相比，P<0.01；c: 與“RF”組相比，P<0.05；d：與“RP”組相比，P<0.01；e: 與“RP”組相比，P<0.05。

組別RAD16-I濃度0.1%ΔG'G″0.2%ΔG'G″0.5%ΔG'G″R47.47±3.350.61±0.040.14±0.0127.57±1.891.37±0.120.39±0.0213.92±1.01 4.25±0.441.05±0.12RP5.89±0.68a16.56±1.24a1.71±0.12a7.18±0.35a101.22±9.17a12.77±1.42a5.05±0.31a458.65±28.97a40.49±3.98aRF7.43±0.57ae40.73±4.22ad5.31±0.65ad7.59±0.54a91.52±7.21a12.19±1.20a3.30±0.98ae61.33±5.68ad3.54±0.31adRFP6.69±0.82a28.87±2.77ac3.38±0.49ac7.67±0.68a91.84±7.52a12.37±1.31a6.32±2.28ac1065.32±60.21ab118.09±9.77ab

在固定應變0.5%的條件下，對與等體積PBS混合前后的含5-Fu的RAD16-I溶液進行頻率掃描。在與PBS混合前RAD16-I濃度為0.5%(w/v)，5-Fu濃度為2.05 mg/mL?！鳌ⅰ謩e表示混合前后的儲存模量(G′)，○、●分別表示混合前后的損耗模量(G″)?！　D1　含抗腫瘤藥物(5-Fu)的RAD16-I原位水凝膠的流變學特征

溶液在培養(yǎng)基中形成的原位水凝膠作用細胞24和48 h細胞的生長狀況，含藥物水凝膠的培養(yǎng)基中細胞與加入藥物水溶液的培養(yǎng)基中細胞從細胞密度、細胞形狀等對比，生長狀況相似：空白對照和不含5-Fu的自組裝短肽組中，24和48 h的細胞密度均較高、細胞形狀均飽滿完整；而含5-Fu水凝膠的培養(yǎng)基中細胞在24 h時細胞密度明顯下降、細胞形狀尚飽滿，到48 h時不僅細胞密度下降、而且細胞多數(shù)呈現(xiàn)皺縮狀。表明水凝膠形成后保持了所加載藥物固有的抗腫瘤效果。

A：不含5-Fu的0.2%RAD水凝膠；B：含5-Fu的0.2%RAD水凝膠?；旌虾?8 h拍攝?！　D2　細胞培養(yǎng)基中RAD16-I水凝膠的顯微鏡照片(×200)

1：24 h的結果；2：48 h的結果。A：空白對照；B：0.2%RAD；C：0.5%RAD；D：5-Fu水溶液；E：含5-Fu的0.2%RAD；F：含5-Fu的0.5%RAD。5-Fu濃度(培養(yǎng)基+水凝膠整體體系中)為150 μg/mL。圖3　RAD16-I水凝膠作用細胞24和48 h后的細胞照片(×200)

3討論

3.1含抗腫瘤藥物的RAD16-I溶液原位成水凝膠的特性水溶液具有的粘彈性，可用儲存模量(G′)和損耗模量(G″)的大小和對頻率的依賴性來表征[17-18]。代表材料彈性特征的G′值增加意味著材料特性更接近于彈性固體；代表材料粘性特征的G″值增加意味著材料特性更接近于粘性液體；以G″/G′比值為正切的相位角(Δ值)的增加意味著材料在相對粘彈性上趨向于粘性液體，Δ值的減小提示材料更趨向于彈性固體。

流變學測定結果表明，在不含藥物的RAD16-I水溶液中， G′近似或略大于G″，G′和G″隨短肽濃度增加變化很?。划敿尤氲润w積PBS后，G′顯著增大且增加幅度隨短肽濃度增加而增加，G″也有增加，但增加幅度比G′小許多，相位角顯著變小。這表明，不含藥物的RAD16-I溶液在與PBS接觸后與接觸前相比，體系行為特性由更接近于粘性液體向更接近于彈性體轉變，表示溶液中粒子間相互締合、溶液中分子鏈之間的纏繞作用較強，已處于聚集狀態(tài)，表現(xiàn)出一定的機械強度；較低頻率時機械彈性且隨頻率變化不明顯，表明溶液中形成了典型的交聯(lián)網(wǎng)絡結構，即自組裝短肽RAD16-I在接觸到PBS后能夠迅速形成具有一定機械強度的水凝膠。而含5-Fu的RAD16-I水溶液情況有所不同。在0.1%和0.2%短肽濃度下，加入PBS前后，各個流變學參數(shù)均無顯著變化；在較高短肽濃度下，加入PBS后儲存模量增加，但G″也相應增加，耗損角值反而輕微增加。說明5-Fu的水溶液也能像PBS一樣使得RAD16-I溶液成水凝膠或使水凝膠的機械強度增加。這可能與5-Fu具有一定的水溶性、結構中含兩個氮原子有關，即5-Fu水溶液與RAD16-I水溶液混合后，可以由于離子強度和pH的變化而表現(xiàn)出輕度成水凝膠的趨勢。具有5-Fu這樣性質的藥物可以采取雙通道導入方式在需要的部位成水凝膠。當然，在較高短肽濃度的含5-Fu水溶液中，PBS的介入，使得代表彈性的G′和代表粘性的G″均顯著增加，這在某些同時需要機械強度和流動性的情況下也許比較有用。

3.2細胞培養(yǎng)基中的自組裝短肽原位水凝膠原位水凝膠在目的作用部位的保持時間與所加載藥物的作用發(fā)揮有關。因而，在有細胞生長的培養(yǎng)基中，水凝膠的存在狀態(tài)和保持時間是否穩(wěn)定持久，可以說是原位水凝膠能否體內(nèi)應用的重要指標。含和不含藥物的RAD16-I均能在培養(yǎng)基中形成凝膠并在一定時間內(nèi)保持其存在狀態(tài)，且水凝膠形成后保持了其中所加載藥物固有的抗腫瘤效果。

化療藥物給藥方法探索是腫瘤研究的重要主題，而運用各種材料構建原位凝膠是促進腫瘤化療高效低毒的一種實用方法[1-3]，自組裝短肽由于其良好的生物相容性和成膠性能成為有前景的藥物載體材料[8,11]。本文所報道的含有5-Fu的RAD16-I水溶液在接觸到磷酸鹽緩沖液時的流變學考察和細胞培養(yǎng)基中水凝膠形態(tài)和藥物作用的觀察，初步表明了自組裝短肽原位水凝膠體內(nèi)應用的可能性。但需要進一步開展深入的細胞和動物試驗以充分驗證其可行性。

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[收稿2016-01-25;修回2016-03-30]

(編輯：王靜)

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(NO：31460246)；貴州省科學技術基金資助項目(NO：黔科合LH字[2014]7564)；遵義醫(yī)學院博士科研啟動基金資助項目(NO：F-583)。

[中圖法分類號]R943；O641.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)03-0250-05

Rheology study on construction of in-situ hydrogel containing 5-fluorouracil with self-assembling peptide

TangFushan1,MengCui1,YangChunxian1,YuanLingyan2

(1. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China;2.School of Nursing, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate potential of self-assembling peptide RAD16-I as in-situ hydrogel for 5-fluorouracil.Methods Hydrogel formation of 5-fluorouracil-contained RAD16-I solution and the effect of 5-fluorouracil in the hydrogel were studied through rheology study on hydrogel and microscopic observation on hydrogels and cells cultured in the hydrogels.Results Hydrogel with certain mechanical intensity formed rapidly in 5-fluorouracil contained RAD16-I solutions immediately after they were mixed with PBS. Also, in cell culture media, RAD16-I solutions containing 5-fluorouracil can form hydrogels, which can keep their gel form and effects on cancer cells in the cell culture media.Conclusion The self-assembling peptide may be explored as in-situ hydrogel carrier for anti-cancer drugs.

[Key words]self-assembling peptide; 5-fluorouracil; in-situ hydrogel; rheology; drug carrier materials