姜琳珊，李　菲，聶　晶，吳　芹，石京山

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室暨藥理學(xué)教研室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

金釵石斛總生物堿對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

姜琳珊，李菲，聶晶，吳芹，石京山

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室暨藥理學(xué)教研室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 初探貴州省產(chǎn)金釵石斛總堿(DNLA)對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響。方法 雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型對照組、模型給藥組(DNLA，40 mg/kg)，同月齡野生型小鼠作為空白對照組，每組10只。自7月齡始灌胃給藥，連續(xù)8周。Morris水迷宮及Y迷宮檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，尼氏染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)。結(jié)果 Morris水迷宮定位航行實驗顯示，模型組逃避潛伏期較空白對照組明顯延長(P<0.05)；空間探索實驗顯示，模型組小鼠在原平臺象限停留時間及在原平臺象限游泳距離的百分比較空白組明顯縮短(P<0.05)；模型組小鼠在Y迷宮的空間自發(fā)性探索行為正確率明顯低于空白組。尼氏染色結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬神經(jīng)元排列疏松，神經(jīng)元數(shù)量及尼氏小體減少，胞質(zhì)呈淡藍色。與模型組比較，DNLA 40 mg/kg明顯縮短小鼠逃避潛伏期(P<0.05)；增加小鼠在原平臺象限停留時間及原平臺象限游泳距離的百分率 (P<0.05)、明顯增加Y迷宮小鼠自發(fā)探索行為正確率(P<0.05)，并改善模型小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。結(jié)論 DNLA對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力具有改善作用。

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默?。唤疴O石斛總生物堿；學(xué)習(xí)記憶；APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；平臺象限；海馬神經(jīng)元

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD )又稱為老年性癡呆，是一種好發(fā)于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進行性記憶與認知功能障礙為特點，嚴重危害了中老年人的身心健康，目前仍沒有良好的藥物治療。利用我國豐富的中藥資源，尋找對AD有效的防治藥物迫在眉睫。金釵石斛是貴州省道地中藥材，資源豐富，我室前期研究表明金釵石斛總堿(DendrobiumnobileLindl. Alkaloids, DNLA)對大鼠神經(jīng)具有良好的保護作用[1-2]，而DNLA是否對AD轉(zhuǎn)基因動物具有改善作用，未見報道。故本研究采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象，通過行為學(xué)檢測初探DNLA對AD的改善作用，為DNLA用于防治AD進行有益的探索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠、同月齡野生型小鼠，SPF級，體重為(20±5) g，均由南京模式動物研究所提供[合格證號：SCXK蘇2010-0001]。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室SPF級動物房。

1.1.2藥品與試劑DNLA總堿由遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室提取，采用UPLC-MS分析，DNLA純度79.8%，提取和測定方法參照文獻[3]。甲苯胺藍購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3主要儀器Morris水迷宮、Y迷宮和TopScan 3.0行為學(xué)分析系統(tǒng)(北京吉安得爾科技有限公司)， JY502電子天平(北京賽多利斯電子有限公司)，BX43正置顯微鏡 (日本奧林巴斯公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型組和DNLA組，同月齡野生型小鼠作為空白對照組，每組10只。DNLA組每日灌胃DNLA 40 mg/kg，模型組與空白對照組給予等體積生理鹽水，各組小鼠從7月齡時開始給藥，連續(xù)8周。

1.2.2Morris水迷宮實驗給藥結(jié)束前8 d，采用Morris水迷宮進行空間學(xué)習(xí)記憶檢測，分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分。定位航行指小鼠每次從平臺所在象限外的任一象限，面向水池壁入水，測試小鼠找到水中平臺所需時間，計為逃避潛伏期(s)，若60 s內(nèi)未能找到，則逃避潛伏期為60 s，并將其引導(dǎo)至平臺上停留20 s。定位航行每天3次連續(xù)6 d。第7天行空間探索實驗(測試小鼠對原平臺的記憶)，即撤去平臺，將小鼠從原平臺所在象限的對面象限放入水中，觀察并記錄60 s內(nèi)小鼠在原平臺象限停留時間及目的象限內(nèi)游泳距離與游泳總距離的百分比。

1.2.3Y迷宮實驗給藥結(jié)束前1天，采用Y迷宮進行自發(fā)選擇性行為學(xué)實驗(見圖1)，用以判斷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。小鼠被置于一個臂端面朝中心，允許每只小鼠自由探索10 min。每次進入臂內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)為：小鼠身體100%進入臂內(nèi)記為一次進入。一次成功的探索定義為：在一系列探索中，動物依次進入3個不同的臂內(nèi)(如：3-1-2，2-3-1，1-3-2)。正確率(%)=正確選擇次數(shù)/(總穿臂次數(shù)-2)×100%。

圖1　自發(fā)性選擇性行為實驗示意圖

1.2.4尼氏染色Y迷宮結(jié)束后第2天麻醉所有動物，每組隨機取3只小鼠行PBS及4%多聚甲醛透心灌注，收集腦組織，石蠟切片，進行尼氏染色。在光學(xué)顯微鏡(40×物鏡)下觀察CA1區(qū)海馬神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)及尼氏小體。每只小鼠選取相同冠狀切面的切片5張。具體實驗操作步驟參照文獻[4]。

2結(jié)果

2.1DNLA對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果顯示，各組小鼠第1、2天逃避潛伏期無明顯差異，自第3天始模型組小鼠逃避潛伏期較空白組明顯延長(P<0.05)，空白對照組逃避潛伏期自第3天始分別為30.31、33.23、33.78、28.66 s；模型組逃避潛伏期分別為53.51, 53.17, 53.15, 52.77 s，DNLA組小鼠逃避潛伏期自第3天始分別為42.13、41.93、42.39、38.97 s，較模型組明顯縮短(P<0.05，見圖2)。在空間探索實驗中，模型組小鼠在原平臺象限停留時間和目的象限內(nèi)占游泳總距離的比率明顯降低(P<0.05)，給予DNLA后原平臺象限內(nèi)停留時間和目的象限占游泳總距離的比率較模型組明顯增加(P<0.05，見圖3)。Y迷宮結(jié)果顯示，模型組小鼠的空間自發(fā)性探索行為正確率明顯低于空白組，而給予DNLA后，小鼠的自發(fā)性探索行為正確率較模型組明顯增加(P<0.05，見圖4)。

；*：與空白對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05。圖2　金釵石斛總堿對小鼠逃避潛伏期的影響

；*：與空白對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05。圖3　金釵石斛總堿對小鼠原平臺象限游泳距離百分比和停留時間的影響

；*：與空白對照組相比，P<0.05；#:與模型組相比，P<0.05。　　圖4　金釵石斛總堿對Y迷宮小鼠空間自發(fā)性探索行為的影響

2.2DNLA對小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響尼氏染色光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，尼氏小體豐富，明顯的虎斑狀染色；而模型組小鼠海馬神經(jīng)元排列松散，數(shù)量減少，尼氏小體染色淺；與模型組比較，DNLA治療后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列較整齊，神經(jīng)元及尼氏小體數(shù)量增多(見圖5)。

3討論

據(jù)AD流行病學(xué)研究報道，2020年全球有0.423億人患有癡呆，到2040年這一數(shù)字將達到0.811億，而這其中有60%～70%的人患阿爾茨海默病[5]。因此，阿爾茨海默病已成為重大的公共衛(wèi)生問題和研究的熱點?；蛲蛔兪茿D的一個重要發(fā)病機制，主要與1號染色體上早老素2(Presenilin-2,PS-2)基因、14號染色體上PS-1基因、19號染色體載脂蛋白E(ApoE)基因和21號染色體β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,β-APP)基因的突變有關(guān)[6]。在對AD的研究中，采用可靠的動物模型至關(guān)重要。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的特點是將APPswe、PSEN1de9這2個基因整合在一起，能夠很好地模擬AD主要病理學(xué)的改變，如神經(jīng)元缺失、炎癥損傷和Aβ沉積等[7]。因此，本實驗采用該轉(zhuǎn)基因模型小鼠判斷金釵石斛總堿抗AD的作用。

A: 空白對照組; B: 模型組; C: DNLA組。圖5　金釵石斛總堿對小鼠海馬神經(jīng)元細胞的影響(尼氏染色，×400)

AD患者主要的臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶的進行性減退，有報道稱APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在9月齡時即出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶受損，在水迷宮實驗中呈現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙[8]。Morris水迷宮實驗是讓實驗大鼠學(xué)習(xí)在水中尋找隱藏平臺，記錄其找到平臺所需時間和行走路徑，測試動物對空間定位的學(xué)習(xí)記憶能力，判斷其記憶功能。Y迷宮實驗是一種對小鼠自發(fā)選擇性行為的空間記憶能力的檢驗[9]，不需要經(jīng)過特定訓(xùn)練。本實驗自小鼠7月齡始給予DNLA連續(xù)8周，實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，轉(zhuǎn)基因(模型)小鼠在Morris水迷宮定位航行的逃避潛伏期明顯延長；在空間探索實驗中，模型小鼠原平臺象限停留時間、目的象限游泳距離所占比率明顯減少；在Y迷宮的空間自發(fā)性探索行為檢驗中，小鼠空間探索的正確率明顯降低。同時病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1區(qū)，神經(jīng)元數(shù)量及尼氏小體均減少。小鼠連續(xù)8周灌胃DNLA后與模型組比較，其游泳逃避潛伏期明顯縮短、平臺象限停留時間和平臺象限游泳距離所占比率均明顯增加；Y迷宮用藥小鼠空間探索的正確率明顯提高，病理學(xué)可見在小鼠海馬CA1區(qū)，DNLA組較之模型組神經(jīng)元數(shù)量及尼氏小體增多，進一步佐證DNLA在一定程度上具有保護神經(jīng)元的作用，有關(guān)DNLA的作用機制值得進一步研究。

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[收稿2016-03-22;修回2016-04-15]

(編輯：王靜)

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(NO:81473201)；貴州省教育廳自然科學(xué)基金資助項目(NO:黔教科2010043)。

[通信作者]石京山，男，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail:shijs@zmc.edu.cn。

[中圖法分類號]R285.5

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)03-0246-04

Effect ofDendrobiumnobileLindl. alkaloids on the learning and memory function of APP/PS1 transgenic mice

JiangLinshan,LiFei,NieJing,WuQin,ShiJingshan

(Department of Pharmacology, The Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To explore the effects of Dendrobium nobile Lindl. alkaloids (DNLA) on the spatial learning and memory function of APP/PS1 transgenic mice.Methods Male APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into model and DNLA (40 mg/kg) groups, age-matched wildtype mice as controls ten mice in each group. Administration was performed from 7 months of age, and continued for 8 weeks. Morris water maze and Y maze were used to test the spatial learning and memory abilities. Nissl’s staining was used to observe the morphological changes of hippocampus neurons.Results Place navigation tests of Morris water maze showed that the escape latency was longer in model group than control group (P<0.05), while the probe trial assay data demonstrated that the time and the percentage of distance in the target quadrant were decreased in model group (P<0.05). The percentage of spontaneous alternation behavior correction in model group was decreased. The numbers of neurons and Nissl’s bodies were decreased in model group by Nissl’s staining,Compared with model group, DNLA 40 mg/kg reduced the escape latency (P<0.05), increased the time and the percentage of distance in the target quadrant (P<0.05), increased the percentage of spontaneous alternation behavior correct rates (P<0.05), and improved the morphology and structure in CA1 area of hippocampus.Conclusion DNLA has the ability of improving the spatial learning and memory function of APP/PS1 mice.

[Key words]Alzheimer’s disease; Dendrobium nobile Lindl. Alkaloids; learning and memory; APP/PS1 transgenic mice; platform quadrant; hippocampal neuron