何志全，李三華，陸　祥，高迎冬，陳　偉

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

孕前砷暴露對(duì)F1代新生鼠睪丸發(fā)育和vasa基因表達(dá)的影響

何志全1，李三華2，陸祥1，高迎冬1，陳偉1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 本實(shí)驗(yàn)主要探討孕前砷暴露對(duì)F1代新生鼠睪丸發(fā)育和vasa基因表達(dá)的影響。方法 將24只雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=8)，通過灌胃方式建立砷染毒模型后，“一代一窩”繁殖試驗(yàn)技術(shù)獲得后代。統(tǒng)計(jì)新生鼠的數(shù)量并稱重，鏡下觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)并測(cè)量生精索直徑及索間面積，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)新生鼠睪丸組織vasa mRNA和vasa蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組(0.9% NaCl)比較，高劑量組(1.5 mg/kg/d As2O3)新生鼠的出生數(shù)、活胎率和新生鼠平均體重都在顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與對(duì)照組比較，中劑量組(0.75 mg/kg/d As2O3)生精索直徑變窄和索間面積變寬，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，高劑量組生精索直徑變窄和索間面積變寬程度加劇，差異極顯著(P<0.01)；與對(duì)照組比較，中劑量組、高劑量組的vasa mRNA和vasa蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01)；與中劑量組比較，高劑量組vasa mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，vasa蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。結(jié)論 隨孕前染砷劑量的增加，F(xiàn)1代新生鼠生精索直徑變窄，索間面積增大，vasa mRNA和vasa蛋白表達(dá)量降低。因此，孕前砷暴露對(duì)新生鼠睪丸發(fā)育產(chǎn)生一定抑制作用。

[關(guān)鍵詞]砷暴露；新生鼠；SD大鼠；睪丸發(fā)育；vasa基因

砷對(duì)機(jī)體的危害是一個(gè)慢性蓄積的過程，青少年甚至成人的砷中毒臨床表現(xiàn)可能因胚胎或新生兒時(shí)期砷中毒所致。研究表明，攝入一定劑量的砷不僅對(duì)母體本身產(chǎn)生嚴(yán)重危害，還可能對(duì)子代胚胎發(fā)育或新生兒造成潛在危害[1-3]。目前，砷對(duì)子代發(fā)育的毒性作用機(jī)制并不完全清楚，普遍認(rèn)為砷通過胎盤屏障直接攻擊胚胎細(xì)胞，觸發(fā)胚胎細(xì)胞內(nèi)原本存在的死亡機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡規(guī)律異常，造成親代全套遺傳基因原定的選擇性激活、時(shí)空表達(dá)失控。也有相反意見認(rèn)為，砷致畸的原因是抑制細(xì)胞增殖，而不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。vasa基因是Schüpbach等[4]于1986年在果蠅(Drosophilamelanogaster)中首次報(bào)道，并發(fā)現(xiàn)其是腹節(jié)形成和生殖細(xì)胞發(fā)育過程所必需的成分之一。此后，這一基因也在許多其他物種中相繼被發(fā)現(xiàn)，并僅在生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中起重要作用，能夠標(biāo)記大鼠前精原細(xì)胞之后發(fā)育的各類生殖細(xì)胞發(fā)育潛能[5]。

為研究砷對(duì)子代生殖發(fā)育的毒性作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過研究F1代新生鼠睪丸發(fā)育的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察和生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因vasa基因的表達(dá)水平，分析判斷睪丸發(fā)育是否異常，從而通過形態(tài)學(xué)和分子水平揭示砷影響子代發(fā)育的毒理機(jī)制，對(duì)研究一定劑量砷對(duì)婦女和兒童(尤其是胎兒)的影響及發(fā)病機(jī)理，具有重要的現(xiàn)實(shí)和理論意義。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)動(dòng)物2.5月齡SD大鼠(200±10) g，雌性24只，雄性12只[中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005]。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑As2O3、多聚甲醛購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；0.01 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液、0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液、Trizol購(gòu)自北京中杉生物科技有限公司；SABC(兔IgG)-POD kit 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MVH antibody購(gòu)自英國(guó)abcam試劑公司；Primescript RT reagent kit、SYBR premix ex taqII購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；無水乙醇、二甲苯、丙酮購(gòu)自成都科龍化工試劑廠；硝酸鈷購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠；硫化胺購(gòu)自上海振欣試劑廠；蘇木精染液為實(shí)驗(yàn)室自配。

1.1.3主要設(shè)備光明牌101型電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自北京永光明醫(yī)療儀器廠；HG303-3K型電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自南京實(shí)驗(yàn)儀器廠； TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；Leica DM1000光學(xué)顯微鏡、Leica-RM 2135型切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自 Icycler IQ(BIORAD)公司；Perkin-Elmer 3110型原子吸收光譜儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司；AF-610A型原子熒光光譜儀購(gòu)自北京瑞利分析儀器公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1孕前砷暴露F1代新生鼠獲取及取材根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期生殖毒理研究實(shí)驗(yàn)的染毒劑量，中、高劑量As2O3可導(dǎo)致雄性生殖毒性[6-7]。因此，將24只雌性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、中劑量和高劑量組3組，每組8只，設(shè)0.75 mg/kg/d As2O3為中劑量、1.5 mg/kg/d As2O3為高劑量及0.9%NaCl為對(duì)照組。通過濃度換算，按1 mL/100g(大鼠體重)給予灌胃，每天1次，持續(xù)56 d。砷染毒模型建立后，選擇發(fā)情的雌性SD大鼠，按雌∶雄=2∶1合籠(每天的17點(diǎn)合籠)，次日清晨7點(diǎn)檢查雌性SD大鼠陰道口有無陰道栓和鏡檢陰道涂片，檢出有陰道栓或精子的視為受孕0.5 d，單獨(dú)飼養(yǎng)。妊娠結(jié)束后統(tǒng)計(jì)剛出生的F1代新生鼠數(shù)量并稱重。每胎各取F1代新生雄鼠1只，每組8只，75%酒精消毒，斷頭處死，解剖取出雙側(cè)睪丸。

1.2.2F1代新生鼠睪丸組織HE切片制作剛出生F1代新生鼠的睪丸組織在4%多聚甲醛中固定2 h后，雙蒸水沖洗24 h，梯度酒精脫水(70%、80%、90%、95%、100%各1 h)、透明(二甲苯I、II各1 h)、浸蠟(2 h)、包埋成蠟塊，制成石蠟切片后按常規(guī)HE染色步驟進(jìn)行染色、封片、鏡下觀察。每個(gè)樣品觀察6張HE組織切片，每張切片選取5個(gè)正中切面的生精索視野，應(yīng)用Leica DFC239圖像分析軟件測(cè)量生精索直徑及索間面積。

1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)vasa蛋白的表達(dá)同上述方法，將新生鼠睪丸組織制成石蠟切片，脫蠟至水化，0.01 mol/L PBS 洗3遍，3%H2O2室溫孵育10 min(用于消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性)，雙蒸水沖洗3次(2 min/次)；采用高壓修復(fù)法修復(fù)：將切片置于1 500 mL 0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋高壓80 s，冷卻后0.01 mol/L PBS沖洗3次，用5% BSA封閉液封閉20 min，滴加一抗(1∶400稀釋)4 ℃過夜(約14 h)，37 ℃復(fù)溫30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次，滴加BIO-羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，滴加SABC-POD(1∶100稀釋)，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌4次，滴加DAB顯色10 min，蒸餾水洗滌，終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染5 min，0.5%鹽酸酒精分化10 s，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)vasa mRNA表達(dá)用Trizol一步法提取新生鼠睪丸組織的總mRNA，用紫外吸收光譜檢測(cè)(核酸的吸收峰在260 nm處)，計(jì)算出mRNA的濃度，調(diào)整至500 μg/μL。按試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄RNA獲取cDNA?；驇?kù)中查詢SD大鼠vasa和β-actin的基因序列，專業(yè)BLAST比對(duì)無誤后，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 mL: SYBR? Premix Ex TaqTM(10 μL)，PCR Forward Primer(0.8 μL)，PCR Reverse Primer(0.8 μL)，模板(cDNA溶液)(1 μL)，ddH2O(7.4 μL)；PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，59 ℃退火30 s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，采用2-△△Ct方法計(jì)算vasa mRNA相對(duì)表達(dá)。

2結(jié)果

2.1砷暴露對(duì)新生鼠發(fā)育的影響表1結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，中劑量組和高劑量組新生鼠的平均數(shù)、活胎率和新生鼠平均體重均有所降低，但中劑量組與對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，高劑量組與對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。說明孕前砷暴露對(duì)新生鼠發(fā)育產(chǎn)生了一定影響。

組別新生鼠平均數(shù)(只)活胎率(%)平均重量(g)對(duì)照組(0.9%NaCl)13.12±2.0398.756.5±0.54中劑量組(0.75mg/kg/dAs2O3)11.00±2.0896.056.3±0.37高劑量組(1.5mg/kg/dAs2O3)7.83±2.04*92.16*6.2±0.42*

與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2砷暴露對(duì)新生鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響光鏡結(jié)構(gòu)如圖1所示：對(duì)照組睪丸生精索排列緊密，生精索較大，未見索腔，索間結(jié)締組織少。在索中間可見體積大、染色淺的精原細(xì)胞，緊貼索基膜可見排列整齊、數(shù)量多、體積小的支持細(xì)胞。中劑量組生精索偏小，染色較淺，排列稀疏，索間結(jié)締組織增多，索中可見精原細(xì)胞和支持細(xì)胞；高劑量組生精索緊縮，直徑明顯變窄，染色較深，排列稀疏，索間距增大，結(jié)締組織增多，索中可見精原細(xì)胞和支持細(xì)胞融在一起。通過圖像分析軟件測(cè)量生精索直徑及索間面積(見表2)，中劑量組(P<0.05)和高劑量組(P<0.01)與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；高劑量組與中劑量組相比也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。說明隨染砷劑量的增加，生精索直徑逐漸減小，生精索間面積逐漸增大。

A:對(duì)照組；B:中劑量組；C:高劑量組；圖中紅色箭頭所示為生精索；紅色三角形所示為索間結(jié)締組織。圖1　新生鼠睪丸組織光鏡結(jié)構(gòu)(HE染色，×400)

組別生精索直徑(μm) 精索間面積(μm2)對(duì)照組(0.9%NaCl)23.39±1.78 13.96±1.95低劑量組(0.75mg/kg/dAs2O3)19.48±1.20*13.13±1.20*高劑量組(1.5mg/kg/dAs2O3)18.44±1.44**#12.14±1.70**#

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與中劑量組比較，#P<0.05。

2.3砷暴露對(duì)新生鼠睪丸組織vasa mRNA和vasa蛋白表達(dá)影響利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，在各組睪丸組織中的擴(kuò)增曲線均能體現(xiàn)CT值，即能檢測(cè)到vasa mRNA表達(dá)。與對(duì)照組比較，中劑量組和高劑量組的vasa mRNA表達(dá)量下降顯著(P<0.01)；與中劑量組比較，高劑量組vasa mRNA表達(dá)量下降顯著(P<0.05，見圖2A)。利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，各組睪丸組織精原細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色的陽性產(chǎn)物，均有vasa蛋白表達(dá)(見圖3)。通過光密度分析，與對(duì)照組比較，中劑量組、高劑量組的vasa蛋白表達(dá)量下降顯著(P<0.01)；與中劑量組比較，高劑量組vasa蛋白表達(dá)量下降顯著(P<0.01，見圖2B)。說明，vasa mRNA和vasa蛋白表達(dá)量隨染砷劑量的增加而降低，即孕前染砷對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因vasa起到一定抑制作用，降低了精原細(xì)胞細(xì)胞發(fā)育潛能，從而影響睪丸發(fā)育。

與對(duì)照組比較，**P<0.01；與中劑量組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2　新生鼠睪丸組織vasa mRNA表達(dá)(A)和vasa蛋白表達(dá)光密度(B)

A:對(duì)照組；B:中劑量組；C:高劑量組；紅色箭頭所示為棕黃色的陽性產(chǎn)物。圖3　新生鼠睪丸組織vasa蛋白的表達(dá)(HE染色，×400)

3討論

3.1砷暴露對(duì)新生鼠發(fā)育及睪丸組織結(jié)構(gòu)變化的影響砷對(duì)機(jī)體的危害是一個(gè)慢性蓄積的過程，中毒途徑廣泛，可以通過水、空氣等環(huán)境污染，也可通過藥物制劑和飲食等途徑造成[8]，據(jù)報(bào)道As2O3可導(dǎo)致新生兒體重減輕甚至畸形和死亡，具有潛在的發(fā)育毒性[9]。本實(shí)驗(yàn)孕前砷暴露后，隨染砷劑量增加，不僅出生的新生鼠數(shù)量下降，平均體重減輕。分析其原因，可歸納為以下兩個(gè)方面：①砷可以通過抑制卵母細(xì)胞第一極體釋放，影響卵母細(xì)胞的成熟，從而降低卵母細(xì)胞的受精能力或體外受精率[10]。②在妊娠期，As2O3(分子量?jī)H有197.84)可通過胎盤屏障(允許分子量小于700～1 000的通過)，從而影響胎兒發(fā)育[11]。對(duì)于剛出生的新生鼠睪丸僅發(fā)育形成生精索，索中央尚未出現(xiàn)官腔，但索內(nèi)已有精原細(xì)胞和支持細(xì)胞。待新生鼠出生4周后，睪丸生精索內(nèi)精原細(xì)胞開始增殖分裂形成生精細(xì)胞，產(chǎn)生精子，生精索中央逐漸出現(xiàn)官腔，即形成生精小管。因此，新生鼠睪丸生精索大小和索間結(jié)締組織的多少能反映睪丸組織結(jié)構(gòu)的異常和睪丸發(fā)育潛力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨染砷劑量的增加，新生鼠睪丸組織生精索直徑逐漸減小，索內(nèi)精原細(xì)胞數(shù)量減少，生精索間面積逐漸增大，睪丸組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯的變化。因此，孕前砷暴露不僅對(duì)新生鼠發(fā)育產(chǎn)生了一定影響，且對(duì)新生鼠睪丸發(fā)育也起到了抑制作用。

3.2砷暴露對(duì)新生鼠睪丸發(fā)育潛能的影響睪丸發(fā)育是從胚胎期原始生殖細(xì)胞(PGCs)進(jìn)入生殖嵴開始，歷經(jīng)原始生殖細(xì)胞階段—生殖母細(xì)胞階段—前精原細(xì)胞階—早期精子發(fā)生階段—精子發(fā)生階段等5個(gè)階段，具體表現(xiàn)主要是生殖細(xì)胞的發(fā)育。作為生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因vasa基因在生殖系發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，它在胚胎發(fā)育、生殖系分化及配子形成中起重要作用。在大鼠生殖細(xì)胞發(fā)育過程中，vasa基因主要集中生殖細(xì)胞發(fā)生、分化和發(fā)育各階段中高表達(dá)，對(duì)原始生殖細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化、生殖細(xì)胞發(fā)育及配子發(fā)生等均具有重要意義[5]。因此，可根據(jù)vasa基因的表達(dá)情況評(píng)價(jià)生殖細(xì)胞的發(fā)育潛能，從而間接反映睪丸發(fā)育潛能。砷在體內(nèi)通過氧化還原產(chǎn)生MMA(單甲基砷酸)和DMA(二甲基砷酸)，DMA在體內(nèi)代謝可生成ROS(活性氧)，ROS可引起氧化應(yīng)激，直接損傷DNA，改變信號(hào)蛋白傳遞、修復(fù)途徑和細(xì)胞分化增殖方向，干擾DNA甲基化狀態(tài)而影響基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)檢測(cè)了vasa基因的vasa mRNA和vasa蛋白的表達(dá)情況，與對(duì)照組比較，中劑量組、高劑量組的vasa mRNA和vasa蛋白表達(dá)量下降顯著(P<0.01)；與中劑量組比較，高劑量組vasa mRNA表達(dá)量下降明顯(P<0.05)，vasa蛋白表達(dá)量下降顯著(P<0.01)；說明，vasa mRNA和vasa蛋白表達(dá)量隨染砷劑量的增加而降低，即孕前染砷對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因vasa起到一定的抑制作用，降低了精原細(xì)胞細(xì)胞發(fā)育潛能，從而影響新生鼠睪丸的發(fā)育。

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[收稿2016-03-04;修回2016-04-05]

(編輯：王靜)

[基金項(xiàng)目]貴州省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：黔教合KY字[2014]263)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ[2012]36)。

[通信作者]陳偉，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生殖毒理與發(fā)育，E-mail: jcbzupei@163.com。

[中圖法分類號(hào)]R329.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)03-0241-05

Effect on neonatal rat testis development andvasagene expression after pregestational arsenic exposure

HeZhiquan1,LiSanhua2,LuXiang1,GaoYingdong1,ChenWei1

(1.Department of Histology and Embryology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China;2.Research Center for Medicine & Biology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

[Abstract]Objective This experiment mainly discusses the effect of neonatal rats testis development and vasa gene expression after pregestational arsenic exposure.Methods The 24 female SD rats were randomly divided into three groups (n=8). Establishment of arsenic exposure model by means of gastric lavage, offspring were obtained through "One generation nest" breeding test technology. Counted the number and weight of newborn rats, Observed the structure of the testis tissue and measured the diameter of the cord and the area between the cords. The expression of vasa mRNA and vasa protein were detected by RT-PCR and immunohistochemistry.Results Comparison of high dose group(1.5 mg/kg/d As2O3)and control group(0.9%NaCl)，there were significant differences (P<0.05) in the number and average weight and live birth rate of newborn rats.Compared with the control group,the diameter of the cord narrows and the area between the cords broaden, the medium dose group(0.75 mg/kg/d As2O3) was statistical difference (P<0.05), the high dose group was significantly different (P<0.01); Compared with the control group, the expression of vasa mRNA and vasa protein decreased significantly (P<0.01).Compared with the medium group, the vasa mRNA expression of the high dose group decreased significantly (P<0.05), and the expression of vasa protein decreased significantly (P<0.01).Conclusions With increasing doses after pregestational arsenic exposure, the diameter of the cord were narrows, the area between the cords were increases, the expression of vasa mRNA and vasa protein decreased. After pregestational arsenic exposure, neonatal rat testis development has a certain inhibitory effect.

[Key words]arsenic exposure; neonatal rat; SD rats;testis development; vasa gene