張露露　王昕陟*　劉旭龍　呂秋威　郁　恒

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽110866；2.沈陽波音飼料有限公司，沈陽110141)

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發(fā)酵豆粕中大分子蛋白質(zhì)和肽含量對(duì)仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)的影響

張露露1王昕陟1*劉旭龍2呂秋威2郁恒2

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽110866；2.沈陽波音飼料有限公司，沈陽110141)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究豆粕中大分子蛋白質(zhì)和肽含量對(duì)仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)的影響。采用凝膠過濾色譜技術(shù)分析豆粕中大分子蛋白質(zhì)和肽含量。選取40頭斷奶仔豬，隨機(jī)分成4個(gè)處理：去皮豆粕處理、發(fā)酵豆粕C處理、發(fā)酵豆粕E處理和動(dòng)物蛋白處理。試驗(yàn)期5周。結(jié)果表明：去皮豆粕中大分子蛋白質(zhì)含量約占80%，發(fā)酵豆粕中約占50%，甚至降至24%；發(fā)酵豆粕中肽含量約占19%，去皮豆粕中僅有2.7%。與去皮豆粕處理相比，發(fā)酵豆粕C處理十二指腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)，發(fā)酵豆粕E、發(fā)酵豆粕C處理十二指腸、空腸隱窩深度顯著下降(P<0.05)，發(fā)酵豆粕E、發(fā)酵豆粕C處理十二指腸和空腸的絨毛高度/隱窩深度均顯著升高(P<0.05)。由此可見，豆粕中大分子蛋白質(zhì)含量與小腸絨毛高度/隱窩深度呈負(fù)相關(guān)；發(fā)酵豆粕能夠在斷奶仔豬飼料中使用，并且有效改善斷奶仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵豆粕；凝膠過濾色譜；小腸絨毛結(jié)構(gòu)

近年來，養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，對(duì)飼料原料，尤其是蛋白質(zhì)原料的需求量日益增加。但動(dòng)物性蛋白質(zhì)原料資源匱乏、價(jià)格昂貴且安全系數(shù)低，迫使人們將目光鎖定植物性蛋白質(zhì)原料，發(fā)酵豆粕就是其中之一。研究表明，豆粕經(jīng)發(fā)酵后，抗?fàn)I養(yǎng)因子含量下降，部分大分子蛋白質(zhì)降解為肽和氨基酸[1]，緩解了對(duì)斷奶仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)的影響[2]，部分大分子蛋白質(zhì)甚至降解為更易吸收的小肽[3]。大分子蛋白質(zhì)和肽含量的不同是去皮豆粕與發(fā)酵豆粕的主要區(qū)別之一。本試驗(yàn)選取2種發(fā)酵豆粕，以去皮豆粕和動(dòng)物性蛋白質(zhì)為對(duì)照，主要通過凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography,GFC)技術(shù)分析豆粕中大分子蛋白質(zhì)和肽含量，探討其對(duì)小腸絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度/隱窩深度(V/C)的影響，旨在為發(fā)酵豆粕在飼料中的廣泛應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1GFC技術(shù)分析豆粕中蛋白質(zhì)含量

原料：去皮豆粕、發(fā)酵豆粕C、發(fā)酵豆粕E等豆粕產(chǎn)品(收集自沈陽波音飼料有限公司)。

主要儀器和設(shè)備：Agilent 1260高效液相色譜儀；FD-1100型冷凍干燥儀。

主要試劑：牛血清白蛋白、細(xì)胞色素c等標(biāo)準(zhǔn)品(購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)。

1.1.1GFC操作方法

按表1色譜條件進(jìn)行分析。記錄標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間(t)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)合樣品峰面積(S)和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算豆粕樣品中肽含量分布。

表1　色譜條件Table 1　The chromatographic conditions

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)品分析結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品名稱及保留時(shí)間見表2。

1.1.3樣品蛋白質(zhì)和肽含量分布結(jié)果

保留時(shí)間約10 min時(shí)，3種豆粕都有較大吸

收峰(圖1、圖2、圖3)。由表3可知，去皮豆粕中分子質(zhì)量約37 ku的蛋白質(zhì)約占80%，發(fā)酵豆粕中僅占50%，甚至降至24%；而發(fā)酵豆粕中肽含量高達(dá)19%，去皮豆粕中僅有2.7%。

表2　標(biāo)準(zhǔn)品名稱及保留時(shí)間Table 2　Standard name and retention time

圖1　去皮豆粕中肽類分布Fig.1　Distribution of peptide in dehulled soybean meal

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

原料：從上述GFC技術(shù)分析結(jié)果中選出大分子蛋白質(zhì)含量由高至低的去皮豆粕、發(fā)酵豆粕E、發(fā)酵豆粕C 3種產(chǎn)品。

試驗(yàn)動(dòng)物：40頭28日齡斷奶、均重10 kg的三元(杜洛克×長白×大白)雜交仔豬。

主要儀器和試劑：DM4000 B LED Leica顯微鏡；磷酸鹽緩沖液。

40頭仔豬隨機(jī)分為4處理，每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)3頭豬(其中一個(gè)重復(fù)為4頭豬)。以去皮豆粕處理為負(fù)對(duì)照組，植物性蛋白質(zhì)原料為去皮豆粕；發(fā)酵豆粕C處理和發(fā)酵豆粕E處理為試驗(yàn)組，植物性蛋白質(zhì)原料分別為發(fā)酵豆粕C和發(fā)酵豆粕E；動(dòng)物蛋白處理為正對(duì)照組。參照NRC(1998)仔豬和保育豬營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，以去皮豆粕總蛋白質(zhì)含量為基準(zhǔn)，采用等蛋白質(zhì)含量替換的方式，配制其他處理飼糧(表4)。試驗(yàn)為期5周，自由采食，按日常生產(chǎn)流程管理。

圖2　發(fā)酵豆粕E中肽類分布Fig.2　Distribution of peptide in fermented soybean meal E

圖3　發(fā)酵豆粕C中肽類分布Fig.3　Distribution of peptide in fermented soybean meal C 表3　豆粕樣品中蛋白質(zhì)的分布 Table 3　Distribution of soybean meal protein

名稱Name項(xiàng)目Items數(shù)值Values去皮豆粕Dehulledsoybeanmealt/min5.2429.2389.62810.03410.17511.14413.56W/u38823.081372.486236.679147.615125.29240.6052.446S/%79.5360.5310.9790.5810.65114.5773.146發(fā)酵豆粕EFermentedsoybeanmealEt/min5.2848.8689.8009.98010.76311.13813.547W/u36972.601572.743193.776157.18163.23940.8892.484S/%51.1043.1766.5263.5716.16924.1205.333發(fā)酵豆粕CFermentedsoybeanmealCt/min5.3316.4047.7348.2458.8269.78211.11813.533W/u35006.20210052.6372141.0661181.884601.409197.87541.8512.524S/%24.26617.0261.8636.5277.24112.04027.4113.626

t：保留時(shí)間 retention time；W：分子量 molecular weight；S：峰面積 peak area。

1.3檢測指標(biāo)和方法

試驗(yàn)期內(nèi)，記錄仔豬每日采食量、腹瀉率(以糞便黏稠呈糊狀或水樣為腹瀉糞便)；試驗(yàn)期末，各處理仔豬分別稱重，計(jì)算平均日采食量、平均日增重、料重比、腹瀉率。計(jì)算公式如下：

平均日增重=(試驗(yàn)期末仔豬平均體重- 試驗(yàn)初期仔豬平均體重)/試驗(yàn)天數(shù)； 平均日采食量=(試驗(yàn)初期總料量- 試驗(yàn)期末余料量)/試驗(yàn)天數(shù)； 料重比=平均日采食量/平均日增重； 腹瀉率(%)=(試驗(yàn)期內(nèi)仔豬腹瀉頭數(shù)/ 試驗(yàn)天數(shù))×100。 表4　試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 4　Composition and nutrient levels of experimental diets　%

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 12 000 IU，VD 2 400 IU，VE 67.5 mg，VK 1.311 mg，VB11.92 mg，VB29.6 mg，VB521.60 mg，VB329.451 mg，VB62.675 mg，生物素 biotin 0.084 mg，葉酸 folic acid 72.01 mg，VB120.036 mg，Cu 63.959 mg，F(xiàn)e 85.682 mg，Zn 124.886 mg，Se 0.5 mg，I 0.7 mg。

2)營養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

試驗(yàn)期末，各處理隨機(jī)選2頭豬屠宰。分別剪取十二指腸、空腸、回腸5 cm，磷酸鹽緩沖液沖洗腸腔，再剪取中間1～2 cm置于10%濃度甲醛溶液中固定。制作石蠟切片，圖像分析軟件分析、測定絨毛高度、隱窩深度，計(jì)算V/C。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著者用LSD氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果

2.1試驗(yàn)處理對(duì)仔豬生長性能的影響

由表5可知，試驗(yàn)處理對(duì)仔豬平均日采食量、平均日增重和腹瀉率有影響，對(duì)料重比無顯著影響(P>0.05)。與去皮豆粕處理相比，發(fā)酵豆粕E、發(fā)酵豆粕C處理仔豬平均日采食量和平均日增重顯著提高(P<0.05)，腹瀉率顯著下降(P<0.05)。

表5　試驗(yàn)處理對(duì)仔豬生長性能的影響Table 5　Impacts of experimental treatments on growth performance of piglets

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2試驗(yàn)處理對(duì)仔豬小腸絨毛高度的影響

由表6可知，試驗(yàn)處理對(duì)仔豬回腸絨毛高度無顯著影響(P>0.05)。與去皮豆粕處理相比，發(fā)酵豆粕C處理仔豬十二指腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)，發(fā)酵豆粕E處理則無顯著差異(P>0.05)。與動(dòng)物蛋白處理相比，發(fā)酵豆粕E處理仔豬十二指腸絨毛高度顯著降低(P<0.05)，發(fā)酵豆粕C處理無顯著差異(P>0.05)。

表6　試驗(yàn)處理對(duì)仔豬小腸絨毛高度的影響Table 6　Impacts of experimental treatments on intestinal villus height of piglets　μm

2.3試驗(yàn)處理對(duì)仔豬小腸隱窩深度的影響

由表7可知，去皮豆粕處理仔豬小腸隱窩深度最大，發(fā)酵豆粕E、發(fā)酵豆粕C處理次之，動(dòng)物蛋白處理最小。與去皮豆粕處理相比，發(fā)酵豆粕E、發(fā)酵豆粕C處理仔豬十二指腸、空腸隱窩深度顯著下降(P<0.05)，回腸隱窩深度無顯著差異(P>0.05)。與動(dòng)物蛋白處理相比，發(fā)酵豆粕E、發(fā)酵豆粕C處理仔豬十二指腸隱窩深度顯著增加(P<0.05)。

2.4試驗(yàn)處理對(duì)仔豬小腸V/C的影響

由表8可知，與去皮豆粕處理相比，發(fā)酵豆粕E、發(fā)酵豆粕C處理仔豬十二指腸和空腸的V/C均顯著升高(P<0.05)，動(dòng)物蛋白處理仔豬十二指腸、空腸、回腸的V/C均顯著升高(P<0.05)。

表7　試驗(yàn)處理對(duì)仔豬小腸隱窩深度的影響Table 7　Impacts of experimental treatments on small intestinal crypt depth of piglets　μm

表8　試驗(yàn)處理對(duì)小腸V/C的影響Table 8　Impacts of experimental treatments on small intestinal villus height and crypt depth ratio of piglets

3討論

3.1試驗(yàn)處理對(duì)仔豬生長性能的影響

發(fā)酵豆粕對(duì)仔豬生長性能的影響主要原因包括：一是發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量減少，抗?fàn)I養(yǎng)作用減弱，對(duì)動(dòng)物生理機(jī)能的危害程度減輕；二是發(fā)酵豆粕中小分子蛋白質(zhì)、肽類和氨基酸等活性物質(zhì)含量增多，有利于動(dòng)物機(jī)體消化吸收，促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育。本試驗(yàn)中，發(fā)酵豆粕C處理仔豬平均日采食量和平均日增重分別提高5.06%、5.29%，腹瀉率下降19.27%以上，說明發(fā)酵豆粕處理有利于改善仔豬的生長性能。

3.2GFC技術(shù)分析豆粕中的蛋白質(zhì)含量

GFC技術(shù)是分析蛋白質(zhì)含量的技術(shù)之一，主要是以色譜柱中多孔的凝膠顆粒為介質(zhì)，以蛋白質(zhì)樣品中分子大小為依據(jù)進(jìn)行洗脫分離。其中，大分子先被洗脫出來，中等的其次，最后洗脫的是小分子物質(zhì)。被洗脫分離出來的蛋白質(zhì)經(jīng)紫外檢測器依次檢測后，形成色譜峰。經(jīng)系統(tǒng)積分后，得出各分子量物質(zhì)含量的百分比。本試驗(yàn)中，去皮豆粕、發(fā)酵豆粕E和發(fā)酵豆粕C中大分子蛋白質(zhì)(平均分子量分別約38、37、35 ku)含量分別占79.54%、51.10%、24.27%，肽含量(平均分子量范圍分別為372～125 u、572～157 u、601～198 u)分別為2.74%、13.27%、19.28%。2種發(fā)酵豆粕中大分子蛋白質(zhì)含量均低于去皮豆粕，且肽含量都高于去皮豆粕。

3.3試驗(yàn)處理對(duì)仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)的影響

小腸結(jié)構(gòu)和功能的完整性是養(yǎng)分得以有效吸收的前提，絨毛高度、隱窩深度以及二者的比值是衡量小腸機(jī)能狀態(tài)的重要指標(biāo)。小腸絨毛高度是養(yǎng)分吸收能力的表現(xiàn)，絨毛高度下降說明吸收功能降低[4]；隱窩深度小說明腸道細(xì)胞生長狀態(tài)良好；V/C是小腸機(jī)能狀態(tài)及其消化酶活力的綜合體現(xiàn)[5]。幼齡動(dòng)物的腸道尚未發(fā)育健全，飼料中部分大分子蛋白質(zhì)能以完整形式進(jìn)入血液和淋巴組織[6]：刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)，并與抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，引起免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫損傷[7]，使絨毛高度下降，酶分泌量減少；還能激活免疫效應(yīng)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子或直接進(jìn)攻靶細(xì)胞引起腸道組織損傷[8]，造成絨毛萎縮和隱窩深度增加。

植物性蛋白質(zhì)原料的缺點(diǎn)之一是抗?fàn)I養(yǎng)因子含量多，如胰蛋白酶抑制因子、植酸、抗原蛋白等，其中以大豆抗原蛋白對(duì)幼齡動(dòng)物腸道損傷程度最重。發(fā)酵豆粕能有效改善小腸絨毛結(jié)構(gòu)，且改善效果與發(fā)酵豆粕的添加量呈正相關(guān)[9]。研究表明，飼喂發(fā)酵豆粕的仔豬，其腸絨毛高度可提高2.24%以上，隱窩深度下降13.27%以上[10]。本試驗(yàn)中，與去皮豆粕處理相比，動(dòng)物蛋白處理小腸絨毛高度提高，隱窩深度下降，V/C增大，說明動(dòng)物蛋白處理對(duì)仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)有促進(jìn)作用。而發(fā)酵豆粕C處理十二指腸絨毛增高10.96%，隱窩深度下降16.38%，空腸隱窩深度下降20.63%，十二指腸、空腸、回腸V/C分別增高32.05%、31.76%、18.42%；發(fā)酵豆粕E處理十二指腸、空腸隱窩深度分別下降13.93%、18.03%，十二指腸、空腸V/C分別增高18.59%、24.71%。可見，發(fā)酵豆粕能夠提高絨毛高度，降低隱窩深，增加V/C，有效改善仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)。

4結(jié)論

豆粕中大分子蛋白質(zhì)含量與小腸V/C呈負(fù)相關(guān)。與去皮豆粕相比，發(fā)酵豆粕中大分子蛋白質(zhì)含量低，肽含量高，能夠有效提高小腸絨毛高度，降低隱窩深度，增加V/C，有效改善仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)。同時(shí)，對(duì)仔豬的生長性能具有促進(jìn)作用。

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(責(zé)任編輯武海龍)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.027

收稿日期：2016-01-17

基金項(xiàng)目：沈陽市預(yù)混合飼料生產(chǎn)工藝研究中心建設(shè)項(xiàng)目(F13-253-8-00)

作者簡介：張露露(1987—)，女，遼寧莊河人，碩士研究生，研究方向?yàn)閱挝竸?dòng)物營養(yǎng)。E-mail： lulu23422@163.com *通信作者：王昕陟，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： xinzwang@163.com

中圖分類號(hào)：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)07-2213-08

*Corresponding author, associate professor, E-mail: xinzwang@163.com

Effects of Contents of Macromolecular Protein and Peptide in Fermented Soybean on Intestinal Villi Structure of Piglets

ZHANG Lulu1WANG Xinzhi1*LIU Xulong2LYU Qiuwei2YU Heng2

(1. Animal Husbandry and Veterinary College, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866 China;2. Shenyang Boin Feed Limited Company, Shenyang 110141, China)

Abstract:The purpose of this test was to study the effects of contents of macromolecular protein and peptide in fermented soybean meal on the intestinal villi structure of piglets, and analysed the contents of macromolecular protein and peptide by gel filtration. Forty weaned piglets were randomly allotted into 4 treatments: dehulled soybean meal treatment, fermented soybean C treatment, fermented soybean E treatment and animal protein treatment. The experiment lasted for 5 weeks. The results showed as follows: the macromolecular protein content in dehulled soybean meal was about 80%, which in fermented soybean meal was about 50%, even down to 24%; the peptide content in fermented soybean meal was about 19%, which in dehulled soybean meal was 2.7%. Compared with the dehulled soybean meal treatment, the villus height in duodenum of fermented soybean C treatment was significantly increased (P<0.05), the crypt depth in duodenum and jejunum of fermented soybean E treatment and fermented soybean C treatment was significantly decreased (P<0.05), the villus height and crypt depth ratio in duodenum and jejunum of fermented soybean E treatment and fermented soybean C treatment was significantly increased (P<0.05). In conclusion, macromolecular protein content in soybean meal is negatively correlated with small intestinal villus height and crypt depth ratio; fermented soybean meal can be used in weaning piglets diets, and effectively improve the structure of small intestinal villus of weaning piglets.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2213-2220]

Key words:fermented soybean; GFC; intestinal villus structure