李美荃　劉　紅　張春勇　安清聰　駱　雪　陳克嶙　郭榮富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201)

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*同等貢獻(xiàn)作者

防御素基因在烏金豬與約大烏豬組織中的表達(dá)及東亞飛蝗抗菌活性物質(zhì)對(duì)防御素基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

李美荃劉紅*張春勇安清聰駱雪陳克嶙郭榮富**

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201)

摘要：本試驗(yàn)旨在檢測(cè)β防御素-1(pBD-1)、β防御素-2(pBD-2)和β防御素-3(pBD-3)基因在烏金豬和具有烏金豬血緣的約大烏豬不同組織中的表達(dá)，并探討東亞飛蝗抗菌活性物質(zhì)(LAAS)對(duì)豬胎兒皮膚成纖維細(xì)胞(PFSF)免疫應(yīng)激參數(shù)和防御素(pBDs)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)2月齡烏金豬與約大烏豬心臟、肝臟、肺臟、腎臟、空腸、回腸、十二指腸、皮膚、肌肉、胰腺、睪丸或卵巢這12種組織中pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表達(dá)差異；采用培養(yǎng)至第4～5代的PFSF，通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)建立免疫應(yīng)激模型，在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加不同濃度(0、75、150、300、600和1 200 μg/mL)的LAAS，考察LAAS對(duì)PFSF免疫應(yīng)激參數(shù)和pBD-1、pBD-2、pBD-3基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：1)烏金豬血清溶菌酶(LSZ)活性、免疫球蛋白G(IgG)含量顯著高于約大烏豬(P<0.05)，血清一氧化氮(NO)含量極顯著低于約大烏豬(P<0.01)。2)約大烏豬大多數(shù)組織中pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表達(dá)量高于烏金豬；2個(gè)品種豬的pBD-1和pBD-3基因均在皮膚和卵巢中表達(dá)量較高，pBD-2基因在肝臟和腎臟中表達(dá)量較高。3)300 μg/mL LAAS極顯著降低了培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性(P<0.01)；LAAS極顯著增加了培養(yǎng)液中NO含量(除75 μg/mL組正常細(xì)胞外)(P<0.01)，正常細(xì)胞和應(yīng)激細(xì)胞均在LAAS濃度為600 μg/mL時(shí)達(dá)到最高；LAAS濃度為0、75和150 μg/mL時(shí)應(yīng)激細(xì)胞一氧化氮合酶(NOS)活性顯著或極顯著高于正常細(xì)胞(P<0.05或P<0.01)；添加1 200 μg/mL LAAS可極顯著降低培養(yǎng)液中的LSZ活性(P<0.01)，LAAS濃度為150、300、600和1 200 μg/mL時(shí)應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞中LSZ活性差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。4)應(yīng)激細(xì)胞pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表達(dá)量均高于正常細(xì)胞；當(dāng)LAAS濃度為150 μg/mL時(shí)，pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表達(dá)量最高。結(jié)果提示，烏金豬和約大烏豬防御素基因的表達(dá)存在明顯的品種差異性和組織特異性，適宜濃度的LAAS能夠降低PFSF中LDH活性，提高NO含量及NOS、LSZ活性，上調(diào)應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞防御素的表達(dá)量。

關(guān)鍵詞：烏金豬；約大烏豬；β-防御素；免疫應(yīng)激；東亞飛蝗抗菌活性物質(zhì)

目前豬的疾病越來(lái)越趨向于復(fù)雜化，尋找新型、安全、高效的抗生素替代品已成為豬營(yíng)養(yǎng)研究和生豬健康養(yǎng)殖的重要研究課題。動(dòng)物健康是保障其生存、種屬繁衍和發(fā)揮遺傳生產(chǎn)潛力的重要生物學(xué)基礎(chǔ)。營(yíng)養(yǎng)與免疫是動(dòng)物健康的重要研究課題。抗病基因與動(dòng)物健康密切相關(guān)，營(yíng)養(yǎng)可通過(guò)改善免疫力和影響抗病基因進(jìn)而提高機(jī)體抗病力，從而增強(qiáng)動(dòng)物健康和改善其生產(chǎn)性能?？咕淖鳛橐环N無(wú)毒副作用、無(wú)殘留的抗微生物添加劑具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。防御素(pBDs)是動(dòng)物體內(nèi)防御系統(tǒng)中最大的成員，它是一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子活性肽，可形成3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，分子質(zhì)量為2～6 ku。根據(jù)防御素二硫鍵的連接位置及形成的空間結(jié)構(gòu)，可將其分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素，其中在豬體內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)了β-防御素，且研究較多的為β防御素-1(pBD-1)、β防御素-2(pBD-2)和β防御素-3(pBD-3)[1]。防御素具有廣譜抗菌、抗病毒活性和非特異性細(xì)胞毒性作用，可以調(diào)節(jié)體內(nèi)適應(yīng)性免疫及其他抗微生物免疫。Diamond等[2]首次在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了防御素，由38～42個(gè)氨基酸殘基組成，且主要存在于哺乳動(dòng)物的皮膚、黏膜等上皮細(xì)胞中。Herrera等[3]研究報(bào)道，人類pBD-2和pBD-3與成人口腔上皮細(xì)胞的抗艾滋病病毒耐藥性的機(jī)制密切相關(guān)。Kallóo等[4]研究報(bào)道，新型方法選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)可以快速分析防御素與生物樣本的相關(guān)性。昆蟲(chóng)具有其獨(dú)特的免疫機(jī)制，在免疫防御體系中主要由一系列抗菌肽發(fā)揮作用。駱雪等[5]研究報(bào)道，東亞飛蝗蟲(chóng)體內(nèi)含有抗菌活性物質(zhì)可被誘導(dǎo)表達(dá)。溫劉發(fā)等[6]以蠶抗菌肽飼喂豬和禽的試驗(yàn)證明，蠶抗菌肽具有代替?zhèn)鹘y(tǒng)飼用抗生素應(yīng)用的潛力。由此提示，昆蟲(chóng)抗菌肽作為一種免疫調(diào)節(jié)劑是否對(duì)動(dòng)物防御素基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。云南本地烏金豬生活在云南高原生態(tài)條件下，長(zhǎng)期的生物進(jìn)化形成耐粗飼、生長(zhǎng)速度緩慢、抗逆性即抗病和抗氧化性強(qiáng)等生物學(xué)特性和遺傳特點(diǎn)。約大烏豬是利用現(xiàn)代遺傳育種技術(shù)，經(jīng)過(guò)多代選育而成的含有25%烏金豬血緣的雜交豬種，其瘦肉率和生長(zhǎng)速度明顯提高，抗逆性也可能會(huì)發(fā)生改變。本研究檢測(cè)了具有抗菌活性的pBD-1、pBD-2和pBD-3基因在烏金豬和約大烏豬不同組織中的表達(dá)，同時(shí)探討了東亞飛蝗抗菌活性物質(zhì)(locust antibacterial active substances，LAAS)對(duì)豬免疫應(yīng)激細(xì)胞pBD-1、pBD-2和pBD-3基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物和血清生化指標(biāo)測(cè)定

隨機(jī)選取來(lái)源一致、健康、飼養(yǎng)方式相同、體重相近的2月齡烏金豬和約大烏豬各12頭(公母各占1/2)，所有仔豬空腹前腔靜脈采血5 mL，制備血清備用，測(cè)定溶菌酶(LSZ)、免疫球蛋白G(IgG)、一氧化氮合酶(NOS)、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)活性或含量。IgG含量采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，NO含量及NOS、LDH、LSZ活性采用比色法測(cè)定，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2組織采集

試驗(yàn)仔豬07:30空腹稱重后屠宰，收集心臟、肝臟、肺臟、腎臟、空腸、回腸、十二指腸、皮膚、肌肉、胰腺、睪丸或卵巢共12種組織，剔除脂肪組織，迅速剪碎，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

選用培養(yǎng)至第4～5代的皮膚成纖維細(xì)胞(porcine fetal skin fibroblasts，PFSF)，以DMEM/F12(1∶1)含血清培養(yǎng)液(10%的胎牛血清，1%的青霉素、鏈霉素雙抗，1%的谷氨酰胺)為細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4試驗(yàn)材料

東亞飛蝗成蟲(chóng)提取物由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料單胃動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究室提供(抗菌活性物質(zhì)提取率8.62%，抗菌活性物質(zhì)濃度11.78 mg/mL)，選用東亞飛蝗針刺蘸大腸桿菌法誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，抗菌活性物質(zhì)主要為防御素。具體方法為：東亞飛蝗成蟲(chóng)針刺腹部，浸泡于處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌菌懸液中10 min，作用24 h，收集蟲(chóng)體，-80 ℃過(guò)夜,勻漿離心取上清[5]。

1.5脂多糖(LPS)誘導(dǎo)豬細(xì)胞免疫應(yīng)激模型的建立

在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別加入0(對(duì)照)、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/mL的LPS，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)激，每組24個(gè)重復(fù)(1個(gè)24孔板)，每孔為1個(gè)重復(fù)。于培養(yǎng)后0、9、18、36 h觀察細(xì)胞狀態(tài)(圖1)，從中選擇10 μg/mL和培養(yǎng)18 h分別為試驗(yàn)LPS濃度和考察時(shí)間點(diǎn)。在應(yīng)激的細(xì)胞培養(yǎng)皿中移去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，添加600 μg/mL的LAAS，0、3、6、12、24、48 h后檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞的pBD-1、pBD-2、pBD-3基因的表達(dá)情況，從中選擇3個(gè)基因表達(dá)量均較高的24 h時(shí)間點(diǎn)作為試驗(yàn)考察時(shí)間點(diǎn)；然后在此時(shí)間點(diǎn)上，分別考察0、75、150、300、600、1 200 μg/mL 6個(gè)濃度的LAAS對(duì)PFSFpBD-1、pBD-2、pBD-3基因的表達(dá)的影響。

A：無(wú)任何處理的細(xì)胞；B：10 μg/mL脂多糖誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞；C：應(yīng)激后換用含有LAAS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞；D：100 μg/mL脂多糖誘導(dǎo)的過(guò)度應(yīng)激死亡細(xì)胞。

A: cells without any treatment; B: immune stress cells induced by 10 μg/mL LPS; C: cells cultured in culture medium containing LAAS for 24 h after stress; D: dead cells of excessive stress induced by 100 μg/mL LPS.

圖1不同形態(tài)的PFSF

Fig.1PFSF in different modality

1.6細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、NOS、LSZ活性及NO含量的測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性采用比色法測(cè)定；NO含量采用硝酸還原酶法測(cè)定；NOS活性采用比色法測(cè)定；LSZ活性采用比濁法測(cè)定。所有測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.7總RNA提取

各組織及細(xì)胞總RNA提取按照RNAsimple Total RNA Kit(北京天根)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每50～100 mg組織加1 mL裂解液。各組織經(jīng)過(guò)研磨粉碎勻漿后，加入氯仿萃取。最后得到的總RNA溶解于超純水中，總RNA的純度與濃度分別用分光光度計(jì)在260與280 nm下檢測(cè)，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間方可采用。

1.8反轉(zhuǎn)錄

采用相同濃度的總RNA樣品按試劑盒(TaKaRa，日本)說(shuō)明書(shū)要求配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，總體系10 μL。用于實(shí)時(shí)熒光定量的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)于-20 ℃保存。

1.9常規(guī)PCR反應(yīng)結(jié)果

以提取的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、明亮、無(wú)雜帶，說(shuō)明引物可以特異性擴(kuò)增出目的產(chǎn)物。

Marker：100 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pBD-1基因；2：pBD-2基因；3：pBD-3基因；4：β-肌動(dòng)蛋白；5：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因；6：18S rRNA。

Marker：100 bp DNA ladder marker；1：pBD-1 gene；2：pBD-2 gene；3：pBD-3 gene；4：ACTBgene；5：GAPDHgene；6：18S rRNA.

圖2PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.2Results of 2% agarose gel electrophoresis of PCR product

1.10實(shí)時(shí)熒光定量PCR

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物參數(shù)Table 1　Parameters of primers for RT-qPCR

1.11數(shù)據(jù)分析

所有組織的防御素表達(dá)量均以GAPDH、18SrRNA、ACTB為內(nèi)參基因，最終以mRNA相對(duì)表達(dá)量來(lái)表示，相對(duì)熒光定量計(jì)算方法采用Pfaffl[7]方法計(jì)算。所有數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組織間的基因表達(dá)采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1烏金豬與約大烏豬的血清生化指標(biāo)

如表2所示，烏金豬血清LSZ活性和IgG含量顯著高于約大烏豬(P<0.05)，血清NO含量極顯著低于約大烏豬(P<0.01)。烏金豬血清LDH和NOS活性低于約大烏豬，但差異不顯著(P>0.05)。

表2　烏金豬與約大烏豬的血清生化指標(biāo)Table 2　The serum biochemical indices of Wujin pigs and Yuedawu pigs

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫(xiě)字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)大寫(xiě)字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)，肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.2烏金豬與約大烏豬不同組織間pBD-1、pBD-2、pBD-3基因的表達(dá)差異

2.2.1不同組織間pBD-1基因的表達(dá)規(guī)律

如圖3-a所示，烏金豬和約大烏豬各個(gè)組織中均用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)到pBD-1基因的表達(dá)。在烏金豬不同組織間pBD-1基因表達(dá)量較高的組織為皮膚和卵巢，表達(dá)量較低的組織為心臟和腎臟。在約大烏豬不同組織間pBD-1基因表達(dá)量較高的組織為皮膚和卵巢，表達(dá)量較低的組織為心臟和肌肉。

2.2.2不同組織間pBD-2基因的表達(dá)規(guī)律

如圖3-b所示，烏金豬和約大烏豬各個(gè)組織中均用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)到pBD-2基因的表達(dá)。在烏金豬不同組織間pBD-2基因表達(dá)量較高的組織為肝臟和腎臟，表達(dá)量較低的組織是心臟和肌肉。在約大烏豬不同組織間pBD-2基因表達(dá)量較高的組織為肝臟和腎臟，表達(dá)量較低的組織為肌肉和胰腺。

2.2.3不同組織間pBD-3基因的表達(dá)規(guī)律

如圖3-c所示，烏金豬和約大烏豬各個(gè)組織中均用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)到pBD-3基因的表達(dá)。在烏金豬不同組織間pBD-3基因表達(dá)量較高的組織為皮膚和睪丸，表達(dá)量較低的組織為心臟和十二指腸。在約大烏豬不同組織間pBD-3基因表達(dá)量較高的組織為皮膚和卵巢，表達(dá)量較低的組織為肌肉和空腸。

1：心臟 heart；2：肝臟 liver；3：肺臟 lung；4：腎臟 kidney；5：皮膚 skin；6：肌肉 muscle；7：卵巢 ovary；8：睪丸 testis；9：胰腺 pancreas；10：十二指腸 duodenum；11：空腸 jejunum；12：回腸 ileum

同一品種豬數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注小寫(xiě)字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，大寫(xiě)字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)。同一組織數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖4同。

Data columns of the same breed of pigs with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). Data columns of the same tissue with * mean significant difference (P<0.05), and with ** mean significant difference (P<0.01). The same as Fig.4.

圖3烏金豬與約大烏豬不同組織間pBD-1，pBD-2，pBD-3基因的表達(dá)差異

Fig.3Difference ofpBD-1，pBD-2，pBD-3 genes expression in different tissues ofWujinpigs andYuedawupig

2.3LAAS對(duì)PFSF培養(yǎng)液應(yīng)激參數(shù)的影響

如表3所示，正常細(xì)胞：與對(duì)照組比較，300 μg/mL LAAS極顯著降低了培養(yǎng)液中LDH活性(P<0.01)，再增加LAAS濃度LDH活性繼續(xù)增加。應(yīng)激細(xì)胞：與對(duì)照組相比，300 μg/mL LAAS極顯著降低了培養(yǎng)液中LDH活性(P<0.01)，再增加LAAS濃度LDH活性繼續(xù)增加。

不論是正常細(xì)胞還是LPS應(yīng)激細(xì)胞，各LAAS組培養(yǎng)液中NO含量均極顯著高于對(duì)照組(除75 μg/mL組正常細(xì)胞外)(P<0.01)，正常細(xì)胞和應(yīng)激細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量均以600 μg/mL LAAS組最高，分別為(16.50±3.76) μg/mL和(20.39±2.81) μg/mL。

正常細(xì)胞：隨著LAAS濃度的增加，培養(yǎng)液NOS活性呈上升趨勢(shì)。應(yīng)激細(xì)胞：隨著LAAS濃度的增加，培養(yǎng)液中NOS活性呈下降趨勢(shì)。應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，0、75和150 μg/mL LAAS組NOS活性顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

正常細(xì)胞：添加600、1 200 μg/mL LAAS時(shí)LSZ活性極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。應(yīng)激細(xì)胞：添加300、1 200 μg/mL LAAS時(shí)LSZ活性極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。添加150、300、600和1 200 μg/mL LAAS時(shí)應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞LSZ活性差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。

表3　LAAS對(duì)PFSF培養(yǎng)液應(yīng)激參數(shù)的影響Table 3　Effect of LAAS on stress parameters of culture medium of PFSF

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫(xiě)字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)大寫(xiě)字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)；同一指標(biāo)、同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，and with different capital letter superscripts mean significant difference(P<0.01). In the same column, values of the same index with * mean significant difference(P<0.05), and with ** means significant difference.

2.4LAAS對(duì)PFSFpBD-1、pBD-2和pBD-3基因表達(dá)的影響

如圖4-a所示，應(yīng)激細(xì)胞pBD-1基因的表達(dá)量均高于正常細(xì)胞，LAAS濃度為0、75、300 μg/mL時(shí)差異極顯著(P<0.01)，LAAS濃度為150 μg/mL時(shí)差異顯著(P<0.05)。隨著LAAS濃度的增加，應(yīng)激細(xì)胞和正常細(xì)胞pBD-1基因的表達(dá)量均增加，當(dāng)LAAS濃度為150 μg/mL時(shí)，pBD-1基因的表達(dá)量最高，隨后呈降低趨勢(shì)。

由圖4-b所示，應(yīng)激細(xì)胞pBD-2基因的表達(dá)量均高于正常細(xì)胞，LAAS濃度為0、75、150、300 μg/mL時(shí)差異極顯著(P<0.01)，LAAS濃度為600 μg/mL時(shí)差異顯著(P<0.05)。隨著LAAS濃度的增加，應(yīng)激細(xì)胞和正常細(xì)胞pBD-2基因的表達(dá)量均增加，當(dāng)LAAS濃度為150 μg/mL時(shí)，pBD-2基因表達(dá)量最高，隨后呈降低趨勢(shì)。

由圖4-c所示，應(yīng)激細(xì)胞pBD-3基因的表達(dá)量均高于正常細(xì)胞，LAAS濃度為0、75 μg/mL時(shí)

差異極顯著(P<0.01)，LAAS濃度為150、1 200 μg/mL時(shí)差異顯著(P<0.05)。隨著LAAS濃度的增加，應(yīng)激細(xì)胞和正常細(xì)胞pBD-3基因的表達(dá)量均增加，當(dāng)LAAS濃度為150 μg/mL時(shí)，pBD-3基因表達(dá)量最高，隨后呈降低趨勢(shì)。

圖4　LAAS對(duì)PFSF pBD-1, pBD-2, pBD-3基因表達(dá)的影響Fig.4　Effect of LAAS on expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes of PFSF

3討論

3.1血清生化指標(biāo)的變化

血液免疫球蛋白濃度是仔豬免疫功能和健康的重要標(biāo)識(shí)之一。IgG具有免疫替代和免疫調(diào)節(jié)的雙重治療效果[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏金豬血清IgG含量顯著高于約大烏豬，血清NO含量、LDH和NOS活性低于約大烏豬。NO在免疫反應(yīng)中具有重要作用，通過(guò)非特異性殺傷細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)和腫瘤細(xì)胞而增強(qiáng)非特異性免疫功能，適量的NO含量有助于宿主增強(qiáng)免疫能力。烏金豬血清LSZ活性顯著高于約大烏豬，在畜禽養(yǎng)殖中，應(yīng)用LSZ可以提高仔豬的生產(chǎn)性能、降低腹瀉率、增強(qiáng)免疫力[9]。結(jié)果提示，培育豬種約大烏豬的免疫功能發(fā)生了適應(yīng)性變化。

3.2品種差異和組織特異性

本研究發(fā)現(xiàn)，烏金豬與約大烏豬不同組織中pBD-1基因表達(dá)量較高的組織為皮膚和卵巢，pBD-2基因表達(dá)量較高的組織為肝臟和腎臟，與Veldhuizen等[10]檢測(cè)的雜交豬(約克夏×荷蘭長(zhǎng)白豬)防御素表達(dá)結(jié)果類似。pBD-3基因表達(dá)模式與pBD-1相似，在皮膚、睪丸和卵巢中表達(dá)量較高，這與Sang等[11]報(bào)道的遠(yuǎn)親雜交豬pBD-3基因在十二指腸、肝臟、皮膚、睪丸及附睪上表達(dá)較高的試驗(yàn)研究結(jié)果不完全一致，原因可能與豬種及日齡有關(guān)。已有研究證明，不同日齡、不同健康狀況的試驗(yàn)動(dòng)物具有不同的防御素基因表達(dá)模式[12-13]。迄今為止，有關(guān)云南高原本地烏金豬和約大烏豬不同組織間防御素基因表達(dá)差異的研究報(bào)道尚未見(jiàn)到。

皮膚作為機(jī)體和環(huán)境間的第1道屏障，它的破壞易使病原菌直接入侵機(jī)體，導(dǎo)致炎癥甚至發(fā)生疾病。本試驗(yàn)結(jié)果表明，烏金豬和約大烏豬pBD-1、pBD-3基因在皮膚的表達(dá)量最高，皮膚表面防御素的大量存在有利于增強(qiáng)豬機(jī)體的抗病能力。

小腸不僅是動(dòng)物消化吸收的主要場(chǎng)所，也是機(jī)體重要的免疫器官。安沙等[14]研究報(bào)道，初生到60日齡，pBD-1和pBD-3基因在豬腸道中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。約大烏豬小腸中pBD-1、pBD-3基因的表達(dá)量高于烏金豬。結(jié)果提示，含有烏金豬血緣的約大烏豬小腸免疫功能發(fā)生了適應(yīng)性改變。

在心臟、腎臟和肌肉等組織器官中，均檢測(cè)到防御素基因的表達(dá)。防御素基因在肝臟、腎臟中表達(dá)趨勢(shì)一致，均為約大烏豬高于烏金豬，pBD-2基因在肝臟和腎臟的表達(dá)量極顯著高于其他組織，為所檢測(cè)12個(gè)組織中表達(dá)量最高的2個(gè)組織，結(jié)果與Veldhuizen等[10]報(bào)道的雜交豬(約克夏×荷蘭長(zhǎng)白豬)防御素表達(dá)結(jié)果一致。

胰腺中，pBD-1基因在約大烏豬的表達(dá)量低于烏金豬，而pBD-2、pBD-3基因在約大烏豬的表達(dá)量則高于烏金豬，有關(guān)胰腺中防御素基因表達(dá)差異與胰腺功能間的聯(lián)系有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，絕大多數(shù)約大烏豬組織中防御素基因的表達(dá)量高于烏金豬。

3.3細(xì)胞免疫應(yīng)激參數(shù)變化

試驗(yàn)研究選擇本試驗(yàn)團(tuán)隊(duì)提供的東亞飛蝗為試驗(yàn)材料，選用東亞飛蝗針刺蘸大腸桿菌法誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)。鄒峰[15]通過(guò)對(duì)各種家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽誘導(dǎo)表達(dá)方式進(jìn)行篩選，以抗菌活性為指標(biāo)，確定了豬糞飼養(yǎng)誘導(dǎo)法。索相敏等[16]以黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)和甜菜夜蛾幼蟲(chóng)為材料，發(fā)現(xiàn)以針刺蘸大腸桿菌法誘導(dǎo)得到的抗菌肽的抑菌活性最強(qiáng)。LDH存在于豬體內(nèi)各組織器官中，是國(guó)際上常用的評(píng)價(jià)細(xì)胞存活狀態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和損傷狀態(tài)的檢測(cè)指標(biāo)，用于檢測(cè)細(xì)胞整體損傷，損傷細(xì)胞因胞溶作用而使LDH釋放于細(xì)胞外。駱雪等[17]研究報(bào)道，L-精氨酸能夠降低豬胎兒PFSF培養(yǎng)液中LDH活性，提高NO含量以及NOS、LSZ活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以LPS刺激PFSF產(chǎn)生免疫應(yīng)激時(shí)，NO含量及LDH、NOS、LSZ活性免疫應(yīng)激參數(shù)均發(fā)生不同程度的升高，添加適宜濃度的LAAS有利于維持細(xì)胞形態(tài)和正常生長(zhǎng)。有研究表明，通過(guò)減少白細(xì)胞來(lái)促進(jìn)誘導(dǎo)型NOS產(chǎn)生，能保護(hù)腸道免受炎癥損傷[18]。

3.4LAAS對(duì)PFSF防御素基因的誘導(dǎo)表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，LAAS可誘導(dǎo)豬防御素基因的表達(dá)，LPS誘導(dǎo)豬免疫應(yīng)激細(xì)胞防御素基因表達(dá)量均明顯高于正常細(xì)胞。雖然目前關(guān)于防御素產(chǎn)生的分子機(jī)制還不十分清楚，但當(dāng)細(xì)菌微生物侵襲時(shí)，LPS、細(xì)菌鞭毛等可被模式識(shí)別受體識(shí)別和結(jié)合，啟動(dòng)機(jī)體免疫防御反應(yīng)[19]，從而產(chǎn)生大量防御素。研究表明，LPS可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生防御素[20]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

在本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的LAAS濃度范圍之內(nèi)，LAAS對(duì)防御素基因具有誘導(dǎo)表達(dá)作用，當(dāng)LAAS濃度為150 μg/mL時(shí)，均能顯著提高pBD-1、pBD-1和pBD-3基因的表達(dá)量。有研究表明，昆蟲(chóng)抗菌肽不僅對(duì)細(xì)菌有殺傷作用，而且對(duì)真菌、病毒、腫瘤細(xì)胞和病原蟲(chóng)具有廣泛的抑制作用[21]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。LAAS濃度與豬不同組織β-防御素表達(dá)量之間的適宜劑量效應(yīng)仍需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)豬不同組織和LAAS濃度對(duì)免疫應(yīng)激細(xì)胞防御素基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其細(xì)胞免疫應(yīng)激參數(shù)研究結(jié)果提示，有關(guān)LAAS提高豬的免疫力和機(jī)體抗病能力的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

4結(jié)論

① 烏金豬血清LSZ活性、IgG含量顯著高于約大烏豬，血清NO活性極顯著低于約大烏豬。

② 烏金豬和約大烏豬防御素基因的表達(dá)存在明顯的品種差異性和組織特異性。2個(gè)品種豬的pBD-1、pBD-3基因均在皮膚和卵巢表達(dá)量較高，pBD-2基因在肝臟和腎臟表達(dá)量較高。

③ 適宜濃度的LAAS能夠降低細(xì)胞LDH活性，增加NO含量及NOS、LSZ活性。

④ 適宜濃度的LAAS能夠上調(diào)應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞防御素的表達(dá)量，且LAAS濃度為150 μg/mL時(shí)，pBD-1、pBD-1和pBD-3基因的表達(dá)量最高。

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*Contributed equally

**Corresponding author, professor, E-mail: rongfug@163.com

(責(zé)任編輯李慧英)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.014

收稿日期：2016-1-29

基金項(xiàng)目：云南省重大科技專項(xiàng)基金(2012ZA018)；云南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系2014[云財(cái)教]105#、2015[云財(cái)教]90#、2016[云財(cái)教]112#

作者簡(jiǎn)介：李美荃(1986—)，女，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，從事豬的營(yíng)養(yǎng)與免疫基礎(chǔ)研究。E-mail: limeiquan2010@163.com **通信作者：郭榮富，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: rongfug@163.com

中圖分類號(hào)：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)07-2096-10

The Expression of β-Defensins Genes in Tissues ofWujinandYuedawuPigs and Effect of Locust Antibacterial Active Substances on Expression of β-Defensins Genes

LI MeiquanLIU Hong*ZHANG ChunyongAN QingcongLUO XueCHEN KelinGUO Rongfu**

(Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science of Yunnan Province， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China)

Abstract:This experiment was aimed to investigate the expression of β-defensin-1 (pBD-1), β-defensin-2 (pBD-2) and β-defensin-3 (pBD-3) genes in different tissues of Wujin pigs and Yuedawu pigs with the blood of Wujin pigs, and also investigate the effect of locust antibacterial active substances (LAAS) on the immune stress parameters and expression of β-defensins (pBDs) in procine fetal skin fibroblasts (PFSF). The expression differences of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes were determined by real-time PCR in 12 tissues such as heart, liver, lung, kidney, jejunum, ileum, duodenum, skin, muscle, pancreas, testis and ovary of 2-month-old Wujin and Yuedawu pigs. The cultured 4th to 5th generations of PFSF were used, and immune stress model was induced by lipopolysaccharides (LPS). Adding different concentrations (0, 75, 150, 300, 600 and 1 200 μg/mL) of LAAS in DMEM/F12 culture medium, and the effect of LAAS on the immune stress parameters and expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes in PFSF were studied. The results showed as follows: 1) the serum lysozyme (LSZ) activity and immunoglobulin G (IgG) content of Wujin pigs were significantly higher than those of Yuedawu pigs (P<0.05), and serum nitric oxide (NO) content of Wujin pigs was extremely significantly lower than that of Yuedawu pigs (P<0.01). 2) The expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes in most tissues of Yuedawu pigs were higher than those of Wujin pigs. The expression of pBD-1 and pBD-3 genes in skin and ovary of two breeds pigs were higher than those in other tissues, and the expression of pBD-2 gene in liver and kidney of two breeds pigs was higher than that in other tissues. 3) The supplementation of 300 μg/mL LAAS extremely significantly decreased lactate dehydrogenase (LDH) activity in culture medium (P<0.01). LAAS could extremely significantly increased NO content in culture medium except for the 75 μg/mL LAAS group in normal cells (P<0.01), and that in normal cells and stressed cells both reached the highest when LAAS concentration was 600 μg/mL. When LAAS concentrations were 0, 75 and 150 μg/mL, nitric oxide synthase (NOS) activity in stressed cells was significantly higher than that in normal cells (P<0.05 or P<0.01). The supplementation of 1 200 μg/mL LAAS extremely significantly decreased LSZ activity in culture medium (P<0.01). When LAAS concentrations were 150, 300, 600 and 1 200 μg/mL, LSZ activity had significant differences in normal cells and stressed cells (P<0.05 or P<0.01). 4) The expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes in stressed cells were higher than those in normal cells. When LAAS concentration was 150 μg/mL, the expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes all reached the highest. The results indicate that there are significant differences in species and tissues specificity of the expression of pBDs genes in Wujin and Yuedawu pigs. The proper concentration of LAAS can decrease LDH activity, but increase NO content and the activities of NOS and LSZ in PFSF, and up-regulate the expression of pBDs in both stressed cells and normal cells.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2096-2105]

Key words:Wujin pigs; Yuedawu pigs; β-defensins; immune stress; locust antibacterial active substances