肖定?！＄姟〖选⑦M(jìn)輝　李文平*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128)

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*同等貢獻(xiàn)作者

殼寡糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)豬空腸上皮細(xì)胞氧化損傷的作用

肖定福1鐘佳2*劉進(jìn)輝2李文平2**

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128)

摘要：本試驗(yàn)旨在通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)豬空腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)來(lái)建立氧化應(yīng)激模型，探討殼寡糖(COS)的抗氧化作用效果。采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)LPS和COS對(duì)IPEC-J2作用12、24、48 h后細(xì)胞增殖活性的變化；選擇適宜濃度LPS(1.0 μg/mL)和COS(200 μg/mL)作用于IPEC-J2，分為對(duì)照組、LPS組、COS組、LPS+COS組。采用Western Blot法檢測(cè)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表達(dá)；試劑盒檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果表明： 1.0 μg/mL的LPS對(duì)IPEC-J2作用24 h，細(xì)胞增殖的抑制率為41.6%，為造模的最適濃度和作用時(shí)間；COS在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)IPEC-J2有增殖作用，其濃度為200 μg/mL時(shí)效果最佳，作用時(shí)間為24 h時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)到126.3%。LPS+COS組較對(duì)照組的SOD、CAT活性和MDA含量差異不顯著(P>0.05)，Nrf2和HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；LPS+COS組較LPS組的Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，HO-1有升高趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，SOD、CAT活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。由此可見(jiàn)，LPS誘導(dǎo)IPEC-J2氧化應(yīng)激，而COS可進(jìn)一步促進(jìn)Nrf2和HO-1蛋白的高表達(dá)，并提高抗氧化酶的活性，降低氧化產(chǎn)物含量，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力，起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：殼寡糖；脂多糖；豬空腸上皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；抗氧化作用

氧化應(yīng)激是機(jī)體自由基生成增加或(和)清除能力降低，導(dǎo)致機(jī)體氧化和抗氧化兩者失衡，自由基大量累積造成機(jī)體損傷[1]。腸道黏膜是宿主防御病原微生物的第1道防線，而腸上皮細(xì)胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分，腸上皮細(xì)胞的損傷是腸功能障礙的重要病理基礎(chǔ)。在多種生理、病理、飲食或環(huán)境不當(dāng)?shù)惹闆r下，腸上皮細(xì)胞都能產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，過(guò)多的自由基的累積可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞受損，從而發(fā)生腸功能障礙[2]。殼寡糖(chitooligosaccharide,COS)是殼聚糖(chitosan,CTS)生物降解后的產(chǎn)物，水溶性好，具有多種生物功效，如抗癌[3]、增強(qiáng)免疫[4-5]、抗氧化[6-8]、促生長(zhǎng)[9]和抑菌[10]等，是一種具有廣闊前景的天然產(chǎn)品。本項(xiàng)目研究通過(guò)建立豬空腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，來(lái)探討COS的抗氧化活性及作用機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑

豬空腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)由中科院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供；COS(90%脫乙酰度，平均分子質(zhì)量<5 000 u)由中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)[大腸桿菌(Escherichiacoli)O55∶B5]購(gòu)于Sigma公司，10 mg/支；核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)抗體(C-20)、血紅素氧合酶-1(HO-1)抗體(C-105)均購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

IPEC-J2于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM basic(1×)培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、90%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IPEC-J2調(diào)整至5×104/孔接種于96孔板中，每孔200 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換無(wú)血清培養(yǎng)基，并分別加不同濃度的LPS(0、0.1、1.0、10.0 μg/mL)或COS(0、50、100、200、400 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，到時(shí)間點(diǎn)后分別加5 mg/mL的MTT 20 μL繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，每孔加150 μL 二甲基亞砜(DMSO)室溫?fù)u晃15 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞樣品收集

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IPEC-J2調(diào)整至1×106/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右，進(jìn)行加樣作用24 h，試驗(yàn)分為對(duì)照組(不加LPS和COS)、1.0 μg/mL LPS組、200 μg/mL COS組、1 μg/mL LPS+200 μg/mL COS組，作用完后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮棒刮取細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，用二辛可寧酸(BCA)法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取蛋白樣品，用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分離蛋白，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到偏二氟乙烯(PVDF)膜上，再用5%的脫脂奶粉室溫緩慢搖蕩封閉2 h，分別加入兔抗Nrf2、HO-1(1∶1 000稀釋)于4 ℃下孵育過(guò)夜，經(jīng)磷酸鹽吐溫緩沖液(TBST)洗滌3次(5 min/次)后，再用辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，經(jīng)TBST洗滌3次(5 min/次)，與化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)1 min，在Image Quant LAS 4 000 mini化學(xué)發(fā)光成像儀下顯示并記錄結(jié)果。試驗(yàn)以β微管蛋白(β-tubulin)作為內(nèi)參，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的檢測(cè)

取細(xì)胞樣品，采用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)丙二醛(MDA)含量，鉬酸銨比色法檢測(cè)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，黃嘌呤氧化酶比色法檢測(cè)超氧化物岐化酶(SOD)活性，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其試驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的t檢驗(yàn)法進(jìn)行單因素方差分析比較，以P<0.05為差異顯著，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2結(jié)果與分析

2.1LPS對(duì)IPEC-J2增殖的抑制作用

由表1可見(jiàn)，不同濃度的LPS對(duì)IPEC-J2增殖的抑制作用有一定的差異，且具有一定的時(shí)間依賴(lài)性。LPS濃度在0.1 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用較低，作用12、24 h時(shí)與對(duì)照組(不加LPS)無(wú)顯著差異(P>0.05)；LPS濃度在1.0 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，作用24、48 h時(shí)與對(duì)照組差異分別顯著和極顯著(P<0.05和P<0.01)，作用24 h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為41.6%，為造模的最佳作用濃度和時(shí)間；LPS濃度為10.0 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞的損傷嚴(yán)重，細(xì)胞活率很低，與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。

2.2COS對(duì)IPEC-J2增殖的促進(jìn)作用

由表2可見(jiàn)，不同濃度的COS對(duì)IPEC-J2增殖活性的促進(jìn)作用不同，而同一濃度的COS對(duì)細(xì)胞的增殖作用也具有一定的時(shí)間依賴(lài)性。與對(duì)照組相比，COS濃度為50 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的影響不顯著(P>0.05)；COS濃度為100 μg/mL時(shí)，作用24、48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的影響顯著(P<0.05)；COS濃度為200和400 μg/mL時(shí)，作用24、48 h時(shí)細(xì)胞的增殖率顯著提高(P<0.05)，且在COS濃度為200 μg/mL時(shí)相對(duì)效果更好。

表1　LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響Table 1　Effects of LPS on IPEC-J2 proliferation (n=6)

*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。表2同。

* means significant difference compared with the control group (P<0.05); ** means extremely significant difference compared with the control group (P<0.01). The same as Table 2.

表2　COS對(duì)IPEC-J2增殖的影響Table 2　Effects of COS on IPEC-J2 proliferation (n=6)

2.3Nrf2和HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量

由表3得知，LPS組的Nrf2和HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組都有顯著提高(P<0.05)；LPS+COS組的Nrf2和HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量較LPS

組進(jìn)一步提高，且Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于LPS組(P<0.05)，但HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量與LPS組差異不顯著(P>0.05)。

表3　Nrf2和HO-1蛋白在各細(xì)胞組中的相對(duì)表達(dá)量Table 3　The relative expression levels of Nrf2 and HO-1 protein in each cell group (n=5)

a表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；b表示與LPS組比較差異顯著(P<0.05)。下表同。

a means significant difference compared with the control group (P<0.05); b means significant difference compared with the LPS group (P<0.05). The same as below.

2.4SOD、CAT活性和MDA含量

由表4可知，LPS組較對(duì)照組的SOD、CAT活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；LPS+COS組較LPS組的SOD、CAT活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，較對(duì)照組各項(xiàng)差異不顯著(P>0.05)。

3討論

如今，天然活性物質(zhì)越來(lái)越受到各行各業(yè)的關(guān)注，已成為“高效、綠色、安全”的代名詞。COS來(lái)源豐富，廣泛存在于低等動(dòng)植物中，如甲殼動(dòng)物外殼、藻類(lèi)的細(xì)胞壁等[11]。在體外和體內(nèi)的大量研究報(bào)道，COS在抗氧化方面發(fā)揮著重要的作用，具有清除氧自由基、降低氧化產(chǎn)物含量、提高抗氧化酶活性等功能[12-17]。本研究除了進(jìn)一步驗(yàn)證COS對(duì)抗氧化酶活性及氧化產(chǎn)物含量的影響，也探討了COS對(duì)抗氧化反應(yīng)信號(hào)通路Keap1-Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)中的核心成員Nrf2及其下游因子HO-1的作用，從而揭示COS抗氧化作用的可能信號(hào)通路或靶點(diǎn)。

表4　各細(xì)胞組中SOD、CAT活性和MDA含量的檢測(cè)結(jié)果Table 4　The test results of SOD, CAT activities and MDA content in each cell group (n=6)

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的成分，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞壁被破壞而釋放出來(lái)，是內(nèi)毒素中的一種，也是一種典型的腸毒素。LPS能刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧自由基，從而導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥等一系列反應(yīng)。用LPS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型具有實(shí)際意義，在許多研究中得到應(yīng)用和探討，如王曉等[18]用LPS成功建立了大鼠胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，進(jìn)一步探討了α-硫辛酸的抗氧化和抗凋亡的作用機(jī)制；又如齊策等[19]用LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而探究了維生素C-磷脂復(fù)合物的抗氧化作用。

Nrf2在機(jī)體絕大部分組織中表達(dá)，是調(diào)控機(jī)體細(xì)胞、組織及器官中氧化還原平衡的主要組成部分，當(dāng)Nrf2被活化入核后，能與ARE識(shí)別并結(jié)合，然后啟動(dòng)下游一系列解毒和抗氧化因子的基因表達(dá)，如醌氧化還原酶-1(NQO1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、SOD、CAT、還原性谷胱甘肽(GSH)等，而這些基因的表達(dá)都與機(jī)體的抗氧化活性有極其重要的關(guān)聯(lián)，對(duì)機(jī)體的氧化還原平衡有關(guān)鍵性的作用[20-21]。HO-1又稱(chēng)為熱休克蛋白32，可以被多種物質(zhì)或刺激因素誘導(dǎo)表達(dá)，如熱休克、缺血、輻射、低氧、高氧、重金屬鹽等，發(fā)揮強(qiáng)大的細(xì)胞保護(hù)作用，HO-1的細(xì)胞保護(hù)作用主要與它的催化分解產(chǎn)物一氧化碳、膽綠素、膽紅素、亞鐵離子有關(guān)，其中，膽綠素、膽紅素、亞鐵離子與抗氧化的作用有緊密聯(lián)系[22]，而研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2是調(diào)控HO-1表達(dá)的一種重要的蛋白合成信號(hào)因子[23-24]。

從試驗(yàn)結(jié)果分析，LPS誘導(dǎo)IPEC-J2氧化應(yīng)激，Nrf2被激活，并進(jìn)一步誘導(dǎo)下游HO-1的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，但這種保護(hù)作用不足以抵抗細(xì)胞的氧化損傷，細(xì)胞的抗氧化酶(SOD、CAT)活性降低，抗氧化產(chǎn)物(MDA)增多；而COS能進(jìn)一步促使Nrf2高表達(dá)，并誘導(dǎo)下游基因HO-1表達(dá)，提高抗氧化酶( SOD、CAT)活性，同時(shí)降低抗氧化產(chǎn)物(MDA)含量，增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受能力，從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)能力。所以，從試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)COS的抗氧化作用與抗氧化反應(yīng)信號(hào)通路Nrf2/ARE及HO-1有一定的關(guān)聯(lián)。

4結(jié)論

LPS誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞氧化應(yīng)激，而COS可進(jìn)一步促進(jìn)Nrf2和HO-1蛋白的高表達(dá)，并提高抗氧化酶的活性，降低氧化產(chǎn)物含量，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力，起到保護(hù)作用。

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*Contributed equally

**Corresponding author, professor, E-mail： liwenping7222@163.com

(責(zé)任編輯武海龍)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.013

收稿日期：2016-01-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31301985)；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2014M562111，2015T80871)；湖南省科技廳項(xiàng)目(2015RS4035)

作者簡(jiǎn)介：肖定福(1977—)，女，湖南婁底人，副教授，博士，研究方向?yàn)閱挝竸?dòng)物營(yíng)養(yǎng)。E-mail： xiaodingfu2001@163.com **通信作者：李文平，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： liwenping7222@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S811.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)07-2090-06

Effects of Chitooligosaccharide on Lipopolysaccharide Induced Oxidative Damage in Epithelial Cells of Pig Jejunum

XIAO Dingfu1ZHONG Jia2*LIU Jinhui2LI Wenping2**

(1. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Abstract:This study was designed to investigate the effect of chitooligosaccharide (COS) on oxidative stress and used lipopolysaccharide (LPS) induced epithelial cells of pig jejunum (IPEC-J2) as an in vitro model of oxidative stress. The IPEC-J2 were incubated with LPS and COS for 12, 24 and 48 h,and then used methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) method to detect the activity of cell proliferation; the appropriate concentrations of LPS (1.0 μg/mL) and COS (200 μg/mL) were chosen in the IPEC-J2 cells, divided into control group, LPS group, COS group and LPS+COS group, and then detected the expression of NF-E2-related factor 2 (Nrf2)and heme oxygenase 1 (HO-1) by Western Blot; and detected superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) activities and malonaldehyde (MDA) content by the kit. The results showed that the optimum concentration of LPS and incubated time for model was 1.0 μg/mL and 24 h, the inhibition of cell proliferation was 41.6%; COS promoted the proliferation of IPEC-J2, worked the best when its concentration was 200 μg/mL and incubated 24 h, the cell proliferation rate was 126.3%. Compared with the control group, LPS+COS group was not significantly different in SOD, CAT activities and MDA content (P>0.05), but Nrf2 and HO-1 protein expression was significantly increased (P<0.05); compared with LPS group, Nrf2 protein expression of LPS+COS group was significantly higher (P<0.05), and there was an increasing trend of HO-1 protein expression, but the difference was not significant (P>0.05), moreover, SOD, CAT activities were significantly increased and MDA content was significantly reduced (P<0.05). It is concluded that LPS induce oxidative stress of IPEC-J2, but COS can induce high expression of Nrf2 and HO-1 protein, and improve the activity of antioxidant enzymes, reduce the content of oxidative products, so increase cellular resistance to oxidative stress, and play a protective role.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2090-2095]

Key words:chitooligosaccharide; lipopolysaccharide; IPEC-J2; oxidative stress; antioxidant