王洋,羅麗,李曉泓,趙鵬飛,章慶慶,朱世鵬,張玲,申松希,齊丹丹,楊佳敏,沈小雨,郭孟瑋,趙雅芳,嵇波,任曉暄,張露芬,朱江,李凱歌,譚莉華(.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京 0009;.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,瀘州 646000;3.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 0009;4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 0003;.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,南京 0046)

?

針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠扭體反應(yīng)和血管舒縮物質(zhì)的影響

王洋1,羅麗2,李曉泓1,趙鵬飛3,4,章慶慶1,朱世鵬5,張玲1,申松希1,齊丹丹1,楊佳敏1,沈小雨1,郭孟瑋1,趙雅芳1,嵇波1,任曉暄1,張露芬1,朱江1,李凱歌1,譚莉華1
(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京 100029;2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,瀘州 646000;3.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053;5.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,南京 210046)

【摘要】目的觀察針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)及血管舒縮物質(zhì)的影響。方法本實(shí)驗(yàn)用注射苯甲酸雌二醇和縮宮素再結(jié)合全身冷凍的方法制備寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型,觀測大鼠扭體反應(yīng)(扭體潛伏期、扭體次數(shù)、扭體評分),并用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿TXB2和6-keto-PGF1a含量。結(jié)果與鹽水組比較,模型組扭體潛伏期明顯縮短,扭體次數(shù)明顯增多,扭體評分明顯升高(P＜0.01);與寒凝證類痛經(jīng)模型組比較,針刺組扭體潛伏期均明顯延長,扭體次數(shù)均明顯減少,扭體評分均明顯降低(P＜0.05,P＜0.01)。與鹽水組比較,模型組血漿6-keto-PGF1a含量明顯降低(P＜0.05);血漿TXB2含量有上升趨勢(P ＞0.05)。與模型組比較,針刺(關(guān)元)組血漿6-keto-PGF1a含量有升高趨勢(P＞0.05);血漿TXB2含量有降低趨勢(P＞0.05)。結(jié)論寒凝證類痛經(jīng)大鼠血液中血管舒縮物質(zhì)出現(xiàn)明顯紊亂。針刺關(guān)元穴可在改善痛經(jīng)大鼠扭體反應(yīng)緩解痛經(jīng)程度的同時,良性調(diào)節(jié)TXB2及6-keto-PGF1a。血管舒縮物質(zhì)可能是針刺防治痛經(jīng)的重要物質(zhì)之一。

【關(guān)鍵詞】針刺;穴,關(guān)元;寒凝證;痛經(jīng);扭體反應(yīng);血管舒縮物質(zhì);大鼠

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為痛經(jīng)的核心病機(jī)是胞宮“瘀”阻,其中寒凝“瘀”阻占據(jù)比例較高,針灸具有活血化瘀作用,治療痛經(jīng)有良效。大量研究已發(fā)現(xiàn),“瘀”阻與血管舒縮物質(zhì)密切相關(guān)[1]。雖然我們前期的研究已證明針刺對寒凝證類痛經(jīng)的防治作用[2],但確切的機(jī)制尚不完全清楚。本研究試圖從血管舒縮物質(zhì)的角度,探尋寒凝造成胞宮“瘀”阻痛經(jīng)狀態(tài)下大鼠子宮的痛經(jīng)程度及針刺關(guān)元穴對其的影響,揭示針刺對寒凝證類痛經(jīng)鎮(zhèn)痛效應(yīng)的部分機(jī)制,以期為寒凝型痛經(jīng)的針刺治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物與分組

采用清潔級SD大鼠,雌性,鼠齡3個月,體重(240 ±20)g,性成熟未交配,由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供,合格證號為SCXK2007-004(軍)。飼養(yǎng)條件為室內(nèi)溫度(23±1)℃,濕度(45±5)%,日光燈光照,普通清潔級鼠飼料,自由飲用自來水。

在飼養(yǎng)過程中,通過陰道涂片[3]法,每日定時用細(xì)棉簽蘸以生理鹽水濕潤后輕輕插入大鼠陰道約0.5 cm,稍微轉(zhuǎn)動后取出,將帶有陰道內(nèi)容物的細(xì)棉簽在載玻片上均勻轉(zhuǎn)動涂片,在空氣中干燥。美蘭染色10 min,用清水將美蘭輕輕沖掉,然后在顯微鏡下觀察陰道涂片的組織學(xué)變化,根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、種類及數(shù)量篩選出處于動情間期的3月齡SD雌性大鼠24只,采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為鹽水對照組(簡稱鹽水組)、寒凝證類痛經(jīng)模型組(簡稱模型組)、針刺組,每組8只。

1.2主要試劑和儀器

儀器包括TX51顯微鏡(日本Olympus公司);H8-202顯微鏡(日本尼康);BC/BD-379HB臥式冰柜(青島海爾集團(tuán));BT223S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);MDF-u50A型超低溫冰箱(日本三洋公司);5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);針灸針(規(guī)格0.25 mm×40 mm,北京中研太和醫(yī)療器械有限公司);秒表。

試劑包括苯甲酸雌二醇注射液(寧波市三生藥業(yè)有限公司,批號120207);縮宮素注射液(上海禾豐制藥廠生產(chǎn),批號120302);自制美蘭染色溶液。

1.3寒凝證類痛經(jīng)模型制備

首先用陰道涂片法篩選出處于動情間期的3月齡SD雌性大鼠,依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4]并加以改進(jìn),采用較公認(rèn)的苯甲酸雌二醇和縮宮素聯(lián)合制備法制備類痛經(jīng)大鼠模型,再結(jié)合全身冷凍法制備寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型。模型組、針刺關(guān)元組采用全身冷凍法結(jié)合苯甲酸雌二醇注射法造模,每日給予大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,連續(xù)10 d,第1天及第10天日注射0.5 mg/只,第2～9天每日0.2 mg/只,末次給藥后1 h后,腹腔注射縮宮素2 U/只,第1～5天每日在給藥后放入﹣25℃冰柜冷凍4 h,中途在2 h打開冰柜換氣5 s。鹽水組每日注射同等劑量的生理鹽水。降低 (P＜0.05);血漿TXB2含量無明顯變化 (P＞0.05)。與模型組比較,針刺關(guān)元組血漿6-keto-PGF1a和TXB2含量均無明顯變化 (P＞0.05)。詳見表2。

1.4處理方法

第10天注射縮宮素模型制備成功后,針刺組給予相應(yīng)的針刺處理,模型組和鹽水組不做處理,觀察各組大鼠的扭體反應(yīng)情況20 min。

1.5針刺方法

關(guān)元穴位于大鼠兩后肢根部連線的中點(diǎn)[5]。針刺深度4～5 mm,在刺入即刻和留針10 min時分別施平補(bǔ)平瀉手法30 s,留針20 min,再緩慢平和地將針退出。

1.6取材及檢測

1.6.1大鼠扭體反應(yīng)

采用Schmauss提出的行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[6],將扭體行為分為0～3四個等級,0級為正常姿勢(手爪平放盒底或正常探查行為);1級為身體斜向一邊;2級為后肢伸展,后爪背屈,軀體伸展伴頻繁的盆骨側(cè)向旋轉(zhuǎn);3級為腹部肌肉收縮,后肢后伸。記錄20 min內(nèi)扭體反應(yīng)的潛伏期和扭體評分。扭體潛伏期為注射縮宮素后至出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間(min);扭體評分=0級(次數(shù)) ×0分＋1級(次數(shù))×1分＋2級(次數(shù))×2分＋3級(次數(shù))×3分。

1.6.2血漿TXB2及6-keto-PGF1a含量

大鼠在觀察扭體反應(yīng)后,即刻快速去冠取血,每只取3 ml置于肝素抗凝管(30mL EDTA,40mL抑肽酶)中,待血液靜置30 min后用低溫離心機(jī)在4℃、3500 r/min條件下離心15 min,取血漿,﹣20℃保存?zhèn)錅y。采用ELISA方法檢測血漿6-keto-PGF1a、TXB2含量,由寰宇金科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司完成。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用方差分析(ANOVA),兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1扭體反應(yīng)比較

與鹽水組比較,模型組扭體潛伏期明顯縮短,扭體次數(shù)明顯增多,扭體評分明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,針刺組扭體潛伏期明顯延長,扭體次數(shù)減少,扭體評分降低(P＜0.05,P＜0.01)。結(jié)果見表1。

2.2針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠血漿6-keto-PGF1a、TXB2含量的影響

與鹽水組比較,模型組血漿6-keto-PGF1a含量明顯

表1　針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠扭體行為的影響

表1　針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠扭體行為的影響

注:與鹽水組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別　n　　潛伏期(min)　扭體次數(shù)(次)　　扭體總分(分)鹽水組　8　2.63±1.19　6.13±4.39　7.13±5.94模型組　8　0.13±0.351)　25.88±4.521)　45.75±14.781)針刺組　8　1.50±1.282)　11.25±4.233)　18.25±9.713)

表2　針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠血漿6-keto-PGF1a、TXB2含量的影響

表2　針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠血漿6-keto-PGF1a、TXB2含量的影響　

注:與鹽水組比較1)P＜0.05

組別　n　6-keto-PGF1a　TXB2鹽水組　8　25.29±2.94　101.82±27.75模型組　8　19.28±3.071)　122.78±22.54針刺組　8　21.73±3.26　98.82±27.24

3　討論

PGI2和TXA2均是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物。PGI2是迄今活性最強(qiáng)的血小板聚集內(nèi)源性抑制劑[7],可通過抑制血小板堆積及強(qiáng)烈的舒張平滑肌的擴(kuò)張血管作用。TXA2主要由血小板線粒體合成和釋放,有促進(jìn)血小板聚集并且誘發(fā)血栓形成的作用。在生理狀態(tài)下,PGI2和TXA2作用相反,二者的含量維持在正常水平從而保證血管壓力以及血液循環(huán)暢通,在循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。而子宮體內(nèi)含有豐富的血管,子宮血管平滑肌的舒縮功能有賴于PGI2和TXA2二者含量的穩(wěn)定。

感受寒冷刺激,使血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌縮血管物質(zhì)(TXA2)和舒血管物質(zhì)(PGI2)含量異常,子宮血管平滑肌劇烈收縮,子宮血管痙攣,導(dǎo)致局部組織缺血、缺氧、炎癥;血小板聚集,使血液處于高凝狀態(tài),出現(xiàn)寒凝證痛經(jīng)中“凝”,是寒凝證痛經(jīng)的主要原因之一[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造類痛經(jīng)模型,再結(jié)合全身冷凍法,制造寒凝證類痛經(jīng)模型[9-11]。雌激素可以使非妊娠大鼠子宮肌層縮宮素受體含量提高[12-13],腹腔注射縮宮素后,縮宮素與子宮肌層的縮宮素受體結(jié)合,可以引起子宮平滑肌劇烈收縮,而平滑肌收縮也符合中醫(yī)學(xué)“寒性收引”的特點(diǎn),最終“不通則痛”導(dǎo)致痛經(jīng)的發(fā)生,表現(xiàn)為大鼠的扭體反應(yīng)加強(qiáng)[14]以及PGI2和TXA2含量的異常。而PGI2、TXA2半衰期很短,故實(shí)驗(yàn)中常測定其穩(wěn)定產(chǎn)物6-keto-PGF1a和TXB2以反映PGI2和TXA2的水平[15]。扭體反應(yīng)是目前應(yīng)用最廣的內(nèi)臟痛模型之一,長期以來一直用來檢測中樞及外周的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[16],在痛經(jīng)的防治和機(jī)理研究中運(yùn)用較多。

我們的研究結(jié)果顯示,針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠疼痛反應(yīng)、TXB2與6-keto-PGF1a的含量均有一定影響。針刺關(guān)元穴能較迅捷地緩解寒凝證痛經(jīng)的扭體反應(yīng),緩解痛經(jīng)程度。針刺關(guān)元穴鎮(zhèn)痛效應(yīng)與其改善造模后寒冷和疼痛的雙重刺激使全身尤其是子宮血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,血管舒張和收縮物質(zhì)含量異常有關(guān)。針刺關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠血漿TXB2與6-keto-PGF1a含量存在一定程度的良性調(diào)節(jié)作用,表現(xiàn)為增加6-keto-PGF1a合成,同時使血小板內(nèi)TXB2合成減少,而抑制血小板聚集,恢復(fù)6-keto-PGF1a和TXB2正常含量,從而改善血管瘀滯及痙攣狀態(tài)而緩解疼痛。

本研究結(jié)果表明,針刺關(guān)元穴能緩解寒凝證痛經(jīng)的疼痛反應(yīng),并改善TXB2和6-keto-PGF1a的水平。針刺可能通過增加PGI2合成、抑制TXA2合成,從而抑制血小板聚集、減少血管收縮痙攣而治療痛經(jīng),體現(xiàn)了針刺活血祛瘀的治療作用。

參考文獻(xiàn)

[1]武哲麗,陳群,劉梅,等.肝病患者不同血瘀證TXB2/6-keto-PGF1a的臨床實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,6(8):1879-1880.

[2]張玲,郭盂瑋,申松希,等.不同針刺刺激量對寒凝證類痛經(jīng)大鼠疼痛及子宮m受體的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2014,42(2):9-10.

[3]施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2000: 330-332.

[4]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1582-1587.

[5]林文注,王佩.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999: 289-299.

[6]Schmauss C,Yaksh TL.In vivo studies on spinal opiate receptor systemsmediatingantinociception.II.Pharmacologicalprofiles suggesting a differential association of mu,delta and kappa receptors with visceral chemical and cutaneous thermal stimuli in the rat[J].J Pharmacol Exp Ther,l984,228(1):1-12.

[7]Sun CY.ACS and TXA2[J].Chin J Prev Contr Chron Non-commun Dis,2007,15(6):571-572.

[8]彭芝配,滕久祥,黨海珍,等.理氣活血止痛法對痛經(jīng)大鼠血液流變性和前列腺素變化的影響研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2002,9(2):95-97.

[9]朱世鵬,張玲,申松希,等.寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型建立的探討[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(11):2417-2419.

[10]申松希,張玲,朱世鵬,等.寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型血液流變學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察[J].吉林中醫(yī)藥,2013,33(4):395-397.

[11]張玲,申松希,朱世鵬,等.寒凝證動物模型的建立[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,37(3):248-250.

[12]吳清和,李育浩,梁頌名,等.女金丹雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,1996,2(4):28-31.

[13]劉超斌,王梅英,李東舫.催產(chǎn)素的研究進(jìn)展[J].中華婦產(chǎn)科雜志,1999,34(5):312-314.

[14]楊雅琴,黃光英.針刺對痛經(jīng)小鼠止痛作用及其機(jī)制的研究[J].中國針灸,2008,28(2):119-121.

[15]Inbar M,Larnicol N,Jasmin C,et al.A method for the quantitative detection of human acute lymphatic leukemia[J].European Journal of Cancer(1965),1977,13(11):1231-1236.

[16]Koster R,Anderson M,DeBeer EJ.Acetic acid for analgesic screening[J].J Fed Proc,1959,(18):418-420.

【中圖分類號】R2-03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.06.0636

文章編號:1005-0957(2016)06-0636-03

收稿日期2015-12-20

基金項(xiàng)目:國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項(xiàng)目(2012CB518506,2006CB504 503,2005CB523308);國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(3097379 3);教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20090013110005)

作者簡介:王洋(1989-),男,2013級碩士生

通信作者:李曉泓(1960-),女,教授,博士,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)獒樉呐c治未病,Email:xiaohong_li@sina.com

Effect of Acupuncture at Guanyuan(CV4)on Writhing Response and Vasomotor Substances in Rats with Dysmenorrhea Due to Coagulated Cold Syndrome

WANG Yang1,LUO Li2,LI Xiao-hong1,ZHAO Peng-fei3,4,ZHANG Qing-qing1,ZHU Shi-peng5, ZHANG Ling1,SHEN Song-xi1,QI Dan-dan1,YANG Jia-min1,SHEN Xiao-yu1,GUO Meng-wei1,ZHAO Ya-fang1,JI Bo1,REN Xiao-xuan1,ZHANG Lu-fen1,ZHU Jiang1,LI Kai-ge1,TAN Li-hua1.
1.School of Acupuncture-moxibustion and Tuina,Beijing UniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou 646000,China;3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;4.Guang’anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China;5.Second School of Clinical Medicine of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

[Abstract]ObjectiveTo observe the analgesic effect of acupuncture at Guanyuan(CV4)and its effect on vasomotor substances in rats with dysmenorrhea due to coagulated cold syndrome.MethodThe coagulated-cold dysmenorrhea rat model was developed by Estrodiol benzoate and Oxytocin injectin plus physical freezing.The writhing response(writhing latency,writhing frequency,and writhing score)was observed,and the contents of TXB2and 6-keto-PGF1awere detected by using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultCompared with the saline water group,the writhing latency was significantly shortened,the writhing frequency was significantly increased,and the writhing score was more significantly increased in the model group(P＜0.01); compared with the model group,the writhing latency was significantly prolonged,the writhing frequency was decreased,and the writhing score was significantly lower in the acupuncture group(P＜0.05,P＜0.01).Compared with saline water group,the content of plasma 6-keto-PGF1awas significantly lower(P＜0.05)and the content of plasma TXB2showed an increasing tendency(P＞0.05) in the model group.Compared with the model group,the content of plasma 6-keto-PGF1ashowed an increasing tendency(P＞0.05) and the content of plasma TXB2showed a decreasing tendency(P＞0.05)in the acupuncture group.ConclusionThe vasomotor substances are obviously disordered in the blood of cold-coagulated dysmenorrhea rat models.Acupuncture at Guanyuan can improve the writhing response and release pain,and meanwhile positively regulate the vasomotor substances such as TXB2and 6-keto-PGF1a.The vasomotor substances are plausibly one of the major substances in the action of acupuncture in preventing and treating dysmenorrhea.

[Key words]Acupuncture;Point,Guanyuan(CV4);Coagulated cold syndrome;Dysmenorrhea;Writhing response;Vasomotor substance;Rats