張彭南，孫　紅，蔣紅元復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海　200090

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miR-483-5p在上皮性卵巢癌中的表達及其對順鉑敏感性的影響

張彭南，孫紅，蔣紅元
復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海200090

［摘要］背景與目的：順鉑是目前臨床上治療上皮性卵巢癌的一線化療藥物之一，但許多患者對鉑類藥物耐藥。miR-483-5p在肺癌中過表達，然而目前尚未見miR-483-5p在上皮性卵巢癌中的研究。該研究檢測miR-483-5p在上皮性卵巢癌組織和上皮性卵巢癌細胞系中的表達并探討其對上皮性卵巢癌細胞對順鉑敏感性的影響。方法：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測43例上皮性卵巢癌患者的腫瘤組織、8例正常卵巢組織和5種上皮性卵巢癌細胞系中miR-483-5p的表達情況；通過慢病毒上調(diào)或敲低卵巢癌細胞miR-483-5p表達，應(yīng)用CCK-8實驗檢測miR-483-5p對上皮性卵巢癌細胞系順鉑敏感性的影響。結(jié)果：上皮性卵巢癌組織中miR-483-5p表達明顯高于正常卵巢組織（P＜0.01）。此外，miR-483-5p在晚期上皮性卵巢癌組織中的表達水平顯著高于早期腫瘤組織（P＜0.05）。5種上皮性卵巢癌細胞系中SKOV3細胞表達miR-483-5p的量最低；miR-483-5p在上皮性卵巢癌順鉑耐藥A2780/CP細胞中表達量最高。上調(diào)SKOV3細胞中miR-483-5p的表達能夠降低上皮性卵巢癌細胞對順鉑的敏感性，并下調(diào)p21 及Bcl-2的表達；下調(diào)A2780/CP細胞miR-483-5p的表達能夠增加細胞對順鉑的敏感性，并上調(diào)p21及Bcl-2的表達。結(jié)論：miR-483-5p在上皮性卵巢癌組織中高表達并對順鉑耐藥，可以作為臨床預(yù)測上皮性卵巢癌對順鉑敏感性的生物標志物之一。

［關(guān)鍵詞］上皮性卵巢癌；miR-483-5p；順鉑；耐藥

卵巢癌的發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第3位，死亡率位居首位，上皮性卵巢癌是其主要類型。順鉑是治療上皮性卵巢癌最常用臨床藥物之一。近年來，越來越多的上皮性卵巢癌對順鉑耐受，嚴重影響了上皮性卵巢癌患者的預(yù)后［1］。探索、闡明卵巢癌的化療耐藥作用機制，提高卵巢癌對化療的敏感性是婦科腫瘤研究領(lǐng)域亟待解決的問題之一。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細胞的增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育等方面。近年來研究證實，異常的miRNA表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p肺癌中過表達，具有癌基因的功能［4］。本研究旨在檢測miR-483-5p在上皮性卵巢癌及正常組織中的表達，并在上皮性卵巢癌細胞中檢測其表達對順鉑敏感性的影響。

1　材料和方法

1.1組織、細胞系及主要實驗試劑

組織標本取自復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院2013年1月—2013年6月經(jīng)手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者43例，正常卵巢組織8例（均為因患子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮加雙側(cè)卵巢、輸卵管切除的患者）。術(shù)中取材后，標本立即放入液氮中速凍后并于-80℃條件下保存以提取RNA。所有組織均由病理診斷證實。上皮性卵巢癌患者年齡41～69歲。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期23例。所有卵巢癌患者術(shù)前均未經(jīng)任何治療，其中漿液性囊腺癌22例，黏液性囊腺癌18例，其他類型3例。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員批準，且均在患者知情的情況下取得標本。人上皮性卵巢癌細胞SKOV3、CAOV3、A2780、Hey和A2780/CP由本實驗室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、Optim-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。TRIzol、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。miR-483-5p過表達及干擾慢病毒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。P21、Bcl-2及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國Santa公司。

1.2方法

1.2.1組織及細胞RNA提取

從超低溫冰箱（-80℃）中取出組織，放入預(yù)冷的研缽中進行研磨，期間不斷地加入液氮保持低溫直至研磨成粉末。取0.25g組織粉到EP管中，加入1mL TRIzol混勻，在室溫下裂解組織粉末15min。常規(guī)培養(yǎng)各細胞，待細胞生長至培養(yǎng)瓶約80%時，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞2次，加入1mL TRIzol，移液槍輕輕吹打瓶壁，裂解細胞，待充分勻漿后轉(zhuǎn)入1.5mL EP管中，室溫靜置15min。在上述細胞或組織裂解液的EP管中加入氯仿200μL，漩渦儀上振蕩30s，室溫放置10min后，于12000×g（4℃）條件下離心15min。取上層水置于新EP管中，加入500μL異丙醇，顛倒混勻后冰浴10min，12000×g （4℃）離心10min。棄上清液，加入預(yù)冷無RNA酶的75%乙醇1mL，渦旋混合，于7500×g （4℃）條件下離心5min，棄上清液，空氣中干燥RNA10min。加入適量無RNA酶的去離子水溶解RNA。電泳檢測RNA質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳觀察5S、18S及28S條帶，紫外分光光度計檢測260nm及280nm處吸光度（D）值，計算RNA濃度。放置-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2RTFQ-PCR檢測

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對于組織和各細胞系所提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。RTFQ-PCR引物按說明書進行稀釋，操作按試劑盒說明書進行。反應(yīng)結(jié)束后確認RTFQ-PCR的擴增曲線和融解曲線，相對miRNA表達采用Ct值精確計算。U6snRNA為內(nèi)參。

1.2.3CCK-8實驗檢測上皮性卵巢癌細胞對順鉑的敏感性

消化后的上皮性卵巢癌細胞以每孔2000個細胞接種到96孔板中常規(guī)培養(yǎng)過夜。隨后分別加入0.2、1、5、25和125μmol/L順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)72h，更換新鮮培養(yǎng)基，加入100μL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2h，應(yīng)用酶標儀測定D450nm值。抑制率=（1-D藥物處理組/D對照組）×100%，計算IC50值。

1.2.4蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測

收集指數(shù)生長期細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解1h。12000×g離心15min，取上清液，采用BCA法蛋白定量。每孔總蛋白上樣量30μg，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯氨酸凝膠電泳2h后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，加入l∶1000稀釋的一抗4℃溫育24h，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（10%吐溫-20）洗滌后，與1∶1000稀釋的熒光二抗在室溫下溫育2h。按照SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（美國Pierce公司）說明書等比例混合底物和增強劑，壓片后顯影。于FR-200A全自動成像系統(tǒng)掃描，以GAPDH作為內(nèi)參對照。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1miR-483-5p在上皮性卵巢癌組織中的表達

RTFQ-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-483-5p在上皮性卵巢癌組織中表達水平顯著高于正常卵巢組織（P＜0.01，圖1）。

此外，miR-483-5p在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌組織中表達水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期卵巢組織（P＜0.05，圖1）。

2.2miR-483-5p在上皮性卵巢癌細胞中的表達

本研究采用RTFQ-PCR檢測了5株上皮性卵巢癌細胞系中的miR-483-5p表達水平。結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780/CP 中miR-483-5p表達水平顯著高于其他4株細胞（P＜0.01，圖2）。

圖1　miR-483-5p在上皮性卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達Fig.1　The expressions of miR-483-5p in epithelial ovarian cancer and normal ovarian tissues detected by RTFQ-PCR

圖2　miR-483-5p在上皮性卵巢癌細胞中的表達Fig.2　The expressions of miR-483-5p in 5 cell lines of epithelial ovarian cancer detected by RTFQ-PCR

2.3上調(diào)miR-483-5p表達誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細胞對順鉑耐藥

上述研究結(jié)果顯示，miR-483-5p在上皮性卵巢癌順鉑耐藥細胞株A2780/CP中表達顯著高于其他細胞。因此，我們推測miR-483-5p過表達可能參與上皮性卵巢癌對順鉑耐藥。本研究通過慢病毒上調(diào)上皮性卵巢癌SKOV3細胞中的miR-483-5p表達（P＜0.01，圖3A）。進一步通過CCK-8實驗檢測上調(diào)miR-483-5p表達后，細胞對順鉑敏感性的變化。結(jié)果顯示，miR-483-5p過表達細胞和陰性對照細胞（negative control，NC）對順鉑的IC50值分別為17.81±1.20 和7.78±0.43（P＜0.05，圖3B）。提示上調(diào)miR-483-5p表達，SKOV3細胞對順鉑的敏感性顯著降低。

2.4下調(diào)miR-483-5p增加上皮性卵巢癌細胞對順鉑的敏感性

為了進一步證實miR-483-5p過表達與上皮性卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)。我們通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲低上皮性卵巢癌細胞A2780/CP中的miR-483-5p表達（P＜0.01，圖4A）。進一步通過CCK-8實驗檢測下調(diào)miR-483-5p表達后，細胞對順鉑敏感性的變化。結(jié)果顯示，miR-483-5p敲低細胞和陰性對照細胞（NC）對順鉑的IC50值分別為9.59±1.02和24.19±2.88（P＜0.01，圖4B）。提示下調(diào)miR-483-5p表達，A2780/CP細胞對順鉑的敏感性顯著增加。

2.5miR-483-5p可能通過調(diào)節(jié)p21及Bcl-2在上皮性卵巢癌中對順鉑耐藥

為了進一步研究miR-483-5p在上皮性卵巢癌中對順鉑耐藥的相關(guān)機制，我們在SKOV3細胞中上調(diào)miR-483-5p表達，在A2780/CP細胞中下調(diào)miR-483-5p的表達，然后檢測p21及Bcl-2的蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：上調(diào)miR-483-5p后，p21及Bcl-2的蛋白表達增加；下調(diào)miR-483-5p后，p21及Bcl-2的蛋白表達降低（圖5）。

圖3　上調(diào)miR-483-5p表達誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細胞對順鉑耐藥Fig.3　Forced miR-483-5p expression in SKOV3 cells reduced their sensitivity to cisplatin

圖4　下調(diào)miR-483-5p增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性Fig.4　Reduced miR-483-5p expression in A2780/CP cells increased their sensitivity to cisplatin

圖5　Western blot檢測上調(diào)或下調(diào)miR-483-5p對p21及Bcl-2蛋白表達的影響Fig.5　The expressions of p21 and Bcl-2 detected by Western blot with forced or reduced miR-483-5p

3　討　論

上皮性卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，病死率居各類婦科腫瘤的首位［5］。鉑類藥物是目前臨床上治療上皮性卵巢癌的一線化療藥物之一。遺憾的是，許多患者對鉑類藥物耐藥。因此，深入探討上皮性卵巢癌的化療耐藥機制，尋找更為有效的治療靶點是上皮性卵巢癌治療亟待解決的問題之一。

Boren等［6］利用化療藥物對化療耐受的卵巢癌細胞株進行處理后，隨后檢測了其中335種miRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有27種miRNA的表達水平在藥物處理前后表達水平發(fā)生變化，該變化至少與1種或多種化療藥物的反應(yīng)性有關(guān)［6］。miR-106a異常表達與卵巢癌對紫杉醇耐藥相關(guān)［7］。隨著miRNA在卵巢癌中的研究不斷深入，異常表達的miRNA可為卵巢癌的治療提供新靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p在上皮性卵巢癌組織中高表達，且在Ⅲ～Ⅳ期腫瘤組織中表達水平高于Ⅰ～Ⅱ期腫瘤組織。此外，我們發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p在上皮性卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780/CP中的表達顯著高于其他細胞，并通過實驗進一步證實miR-483-5p過表達在上皮性卵巢癌對順鉑耐藥中具有重要作用。p21基因表達涉及數(shù)種癌癥的耐藥［8］。研究結(jié)果表明，原癌基因Bcl-2的過度表達延遲誘導(dǎo)細胞凋亡［9］，Bcl-2表達的下調(diào)可以恢復(fù)癌細胞對抗癌藥物的敏感性［10］。本研究發(fā)現(xiàn)：上調(diào)miR-483-5p表達后，p21及Bcl-2蛋白的表達增加；下調(diào)miR-483-5p表達后，p21及Bcl-2的蛋白表達降低。因此miR-483-5p可能通過調(diào)節(jié)p21及Bcl-2在上皮性卵巢癌中對順鉑耐藥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-483-5p在上皮性卵巢癌組織中高表達，并且與臨床分期相關(guān)；其過表達與上皮性卵巢癌對順鉑耐藥相關(guān)。因此miR-483-5p可能參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的過程。

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DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.05.007

中圖分類號：R737.31

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）05-0394-05

收稿日期：（2015-11-15修回日期：2016-01-18）

通信作者：蔣紅元E-mail：jianghy@fudan.edu.cn

Expression of miR-483-5p in epithelial ovarian cancer and its effects on cisplatin resistance in epithelial ovarian cancer cells

ZHANG Pengnan， SUN Hong， JIANG Hongyuan
（Department of Gynecology， Obstetrics and Gynecology Hospital， Fudan University， Shanghai 200090， China）Correspondence to： JIANG Hongyuan E-mail： jianghy@fudan.edu.cn

［Abstract］Background and purpose： Although cisplatin-based chemotherapies are used as the first-line treatment for ovarian cancers， the majority of patients eventually progress with platinum-resistant disease. miR-483-5p is overexpressed in lung cancer. However， the research on miR-483-5p in epithelial ovarian cancer （EOC） is still unclear. This study aimed to investigate the expression of miR-483-5p in EOC and its effects on cisplatin resistance in EOC cells. Methods： This study analyzed the expression of the miR-483-5p by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR） in EOC tissues， normal ovarian tissues， and EOC cells. The role of miR-483-5p in EOC was evaluated in vitro by lentivirus-mediated knockdown of miR-483-5p or overexpression of miR-483-5p in EOC cell lines. Drug sensitivity assay was carried out by CCK-8 kit. Results： miR-483-5p was upregulated in EOC tissues as compared with normal tissues （P＜0.01）. Furthermore， miR-483-5p expression in advanced stage （Ⅲ-Ⅳ）EOC was significantly higher than that in early stage （Ⅰ-Ⅱ） EOC （P＜0.05）. Interestingly， miR-483-5p expression was higher in cisplatin-resistant A2780/CP cells than other cells. Increased miR-483-5p expression caused EOC cell resistance to cisplatin and downregulated the expression of p21 and Bcl-2， whereas reduced miR-483-5p expression induced its sensitivity and upregulated the expression of p21 and Bcl-2. Conclusion： The results suggest that miR-483-5p is highly expressed in EOC and contributes to cisplatin resistance. Thus， miR-483-5p is a potential therapeutic target for ovarian cancer.

［Key words］Epithelial ovarian cancer； miR-483-5p； Cisplatin； Drug resistance