祁媛媛 洪 達(dá) 王慧君 張曉波 王立波 金婷婷 錢莉玲

·論著·

CCDC39基因突變致原發(fā)性纖毛運動障礙1例及其遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷

祁媛媛1洪 達(dá)1王慧君 張曉波 王立波 金婷婷 錢莉玲

目的 探討對原發(fā)性纖毛運動障礙(PCD)患兒進(jìn)行基因檢測對指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育的意義。方法 對1例臨床診斷Kartagener綜合征并隨訪4年的患兒進(jìn)行家系全外顯子組測序(WES)，經(jīng)高通量測序數(shù)據(jù)分析及臨床診斷流程確定致病基因突變，根據(jù)基因診斷結(jié)果行針對性遺傳咨詢后對患兒母親第2胎行羊水穿刺，分離羊水脫落細(xì)胞，提取基因組DNA并PCR 擴增羊水脫落細(xì)胞相應(yīng)基因突變所在外顯子，行直接Sanger測序。結(jié)果 臨床隨訪發(fā)現(xiàn)患兒肺功能較診斷時明顯下降，胸部CT支氣管擴張較前加重。WES患兒中檢測到CCDC39基因c.1819A>A/T, p.K607X無義突變和c.2447_2448het_delCA, p.T816Kfs*3移碼突變，2個突變均為未報道的新突變，均經(jīng)功能預(yù)測工具M(jìn)utationTaster預(yù)測為致病突變，分析父母突變來源確定為復(fù)合雜合突變。同時結(jié)合患兒支氣管黏膜活檢電鏡特征性的纖毛結(jié)構(gòu)異常，認(rèn)定該復(fù)合雜合突變?yōu)榛純旱闹虏⊥蛔??；純耗赣H第2 胎羊水細(xì)胞CCDC39基因2個突變位點所在外顯子的Sanger測序結(jié)果顯示，胎兒攜帶母親來源的移碼突變，無父親的無義突變，為單雜合突變攜帶者。結(jié)論 采用WES檢測有助于明確PCD患兒的遺傳病因，在此基礎(chǔ)上對患兒家庭行遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷，可以指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。

原發(fā)性纖毛運動障礙； 全外顯子組測序； 遺傳咨詢； 產(chǎn)前診斷

1 病例資料

1.1 臨床資料 患兒，女，12歲，因“反復(fù)咳嗽1年余伴膿涕”于2012年10月首次至復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)就診。患兒系G1P1足月順產(chǎn)，生后曾因“呼吸困難”轉(zhuǎn)入我院新生兒科，X線胸片檢查示肺炎，右位心。入院后予機械通氣4 d后好轉(zhuǎn)，改為鼻導(dǎo)管吸氧治療1周后停氧，住院23 d好轉(zhuǎn)出院。出院后患兒一般情況可，但易流膿涕，未予重視。入院前1年余，頻繁呼吸道感染。入我院前1次門診X線胸片示肺炎。入院查體：神志清楚，呼吸平，咽充血，兩肺呼吸音粗，可聞及少許濕性啰音，心音有力，律齊，未聞及雜音，無杵狀指。入院后肺部CT示，肺炎伴部分實變不張、支氣管擴張。肺功能輕度限制性病變伴有小氣道功能下降(表1)。心超顯示鏡像右位心，左位主動脈弓；腹部B超顯示肝脾反位?；純捍嬖诒歉]炎、支氣管擴張、合并內(nèi)臟轉(zhuǎn)位，考慮Kartagener綜合征，遂行支氣管鏡黏膜活檢，電鏡檢查示纖毛主桿排列紊亂，內(nèi)動力蛋白臂與輻條缺失(圖1)。確診為原發(fā)性纖毛運動障礙(PCD)。

表1 PCD診斷時(8歲)與12歲隨訪時肺功能比較

注 VC:肺活量；FVC:用力肺活量；FEV1:1 s用力肺活量；FEV1/VC:1 秒率； FEF25%(50%、75%):呼出25%(50%、75%)肺活量時的呼氣流速；MMEF:最大呼氣中期流量

圖1 支氣管黏膜電鏡結(jié)果

注 纖毛9+2結(jié)構(gòu)排列紊亂，箭頭處示內(nèi)動力蛋白臂缺失

患兒診斷后予長期治療及臨床隨訪。接受高滲生理鹽水霧化以及拍背物理治療1年余，2014年后因臨床癥狀好轉(zhuǎn)而自行停用。期間(2013年)因中耳炎行鼓膜置管手術(shù)治療，也因肺炎于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院多次住院治療。2015年起呼吸道感染次數(shù)減少，咳嗽、咳痰好轉(zhuǎn)。2016年隨訪肺功能結(jié)果顯示，F(xiàn)VC占預(yù)計值百分比(60.9 %vs 82.6%)及FEV1占預(yù)計值百分比(49.6% vs 77.2%)均較診斷PCD時顯著下降；1s率、最大呼氣中期流量等也較診斷PCD時明顯下降(表1)。胸部CT隨訪結(jié)果顯示，與診斷時相比，支氣管壁增厚及散在擴張均進(jìn)展，雙肺透亮度不均勻(圖2)。

患兒家屬有2胎要求，為進(jìn)一步明確致病基因及進(jìn)行遺傳咨詢，在獲得患兒家長知情同意下，對患兒及其父母進(jìn)行了全外顯子組測序(WES)，并根據(jù)基因檢測結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

圖2 胸部CT隨訪情況

注 與診斷PCD時(圖A和B)比較，2016年7月(圖C和D)胸部CT顯示肺透亮度不均勻，支氣管擴張較前加重

1.2 基因檢測及結(jié)果 用EDTA抗凝管分別采集患兒及父母靜脈全血2 mL，采用mini blood全血試劑盒(德國Qlagen公司)及其標(biāo)準(zhǔn)DNA抽提方法提取基因組DNA，用美國Thermo Fisher公司的NanoDrop紫外分光光度儀測定樣本的濃度及定量。參照SureSelect Human All Exon試劑盒(美國Agilent公司)說明書，基因組DNA經(jīng)過超聲打斷、末端修復(fù)、接頭連接、雜交捕獲。捕獲文庫采用Illumina HiSeq 2000平臺行WES檢測。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、比對形成包含變異位點基本信息的vcf文件。按照高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程(復(fù)旦流程)篩選致病性突變[1]。檢測變異采用ANNOVAR和VEP軟件參照HG19人類基因組參考序列進(jìn)行注釋，通過千人基因組計劃(1000 Genomes)、ExAC及內(nèi)部數(shù)據(jù)庫注釋突變頻率，運用SIFT、Polyphen2和MutationTaster在線軟件，預(yù)測氨基酸替換對蛋白質(zhì)功能的影響。對檢測到的候選突變，采用Primer3在線設(shè)計引物，使用Takara公司LA-Taq進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，Sanger雙向測序(3500 XL Genetic Analyzer, ABI)進(jìn)行驗證。

經(jīng)WES測序及數(shù)據(jù)分析，本文病例檢測到CCDC39基因c.1819A>A/T, p.K607X無義突變和c.2447_2448het_delCA, p.T816Kfs*3移碼突變，查閱文獻(xiàn)及OMIM和HGMD等人類疾病突變數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)2個突變均未見文獻(xiàn)報道，且2個突變在公共變異頻率數(shù)據(jù)庫1 000 genomes和ExAc中均不存在，提示為極其罕見的突變，經(jīng)功能預(yù)測工具M(jìn)utationTaster均為致病突變，其中CCDC39: c.1819A>A/T, p.K607X無義突變可使翻譯提前終止而致蛋白截短，CCDC39: c.2447_2448het_delCA, p.T816Kfs*3移碼突變可引起多肽鏈氨基酸序列的巨大改變。分析家系內(nèi)突變來源，CCDC39: c.1819A>A/T, p.K607X無義突變來自患兒父親，CCDC39: c.2447_2448het_delCA, p.T816Kfs*3移碼突變來自患兒母親，屬復(fù)合雜合突變，符合常染色體隱性遺傳模式(圖3)。在全基因組基因編碼區(qū)及周圍內(nèi)含子區(qū)未發(fā)現(xiàn)其他與患兒臨床表型相關(guān)的已知或可疑致病基因突變。

圖3 患兒CCDC39基因突變位點Sanger測序驗證及家系突變位點驗證

注 左圖CCDC39: c.1819A>A/T, p.K607X無義突變；右圖CCDC39: c.2447_2448het_delCA, p.T816Kfs*3移碼突變

1.3 遺傳咨詢及產(chǎn)前基因診斷 根據(jù)患兒檢測到的致病基因突變位點的情況向家屬介紹CCDC39基因突變所致PCD的臨床特征、遺傳模式等基因診斷和產(chǎn)前基因診斷的相關(guān)問題。從理論預(yù)測，母親再次懷孕胎兒攜帶復(fù)合雜合突變從而致病的概率為1/4，建議行胎兒產(chǎn)前診斷。建議父母的兄弟姐妹等攜帶致病基因突變的高危人群進(jìn)行遺傳咨詢及基因檢測。對于攜帶突變基因者，均應(yīng)進(jìn)行下一代基因檢測及孕前遺傳咨詢。告知PCD致病基因眾多，有可能其他致病基因自發(fā)突變，引起疾病，目前的產(chǎn)前診斷無法預(yù)測。經(jīng)過上述遺傳咨詢后，患兒母親要求孕20周前進(jìn)行該家系的2個突變位點的產(chǎn)前基因診斷。

產(chǎn)前基因診斷胎兒基因突變分析采用羊水細(xì)胞基因組DNA?；純耗赣H簽署知情同意書并獲得復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，于20 孕周至上海集愛遺傳與不孕診療中心行超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹羊水穿刺，留取羊水10 mL，3 000 rpm離心10min，分離脫落細(xì)胞，采用QIAGEN公司DNeasy Blood & Tissue試劑盒提取胎兒基因組DNA。使用LA-Taq酶PCR 擴增CCDC39基因2個突變位點所在的外顯子，Sanger雙向測序(3500 XL Genetic Analyzer, ABI)。結(jié)果顯示，胎兒攜帶母親來源的CCDC39: c.2447_2448het_delCA, p.T816Kfs*3移碼突變，而另一條染色體無父親的CCDC39: c.1819A>A/T, p.K607X無義突變，為雜合突變攜帶者，理論預(yù)測不會出現(xiàn)PCD的臨床表現(xiàn)(圖3)。

2 討論

本文采用WES明確了1例PCD病例的致病基因，發(fā)現(xiàn)CCDC39基因復(fù)合雜合突變，2個均為未報道的新突變，分別為無義突變和移碼突變，可導(dǎo)致編碼蛋白截短或氨基酸順序錯亂，對蛋白功能影響巨大。而CCDC39基因突變的病例電鏡下可呈現(xiàn)特征性的纖毛微管結(jié)構(gòu)紊亂和內(nèi)動力蛋白臂缺陷[2,3]?？擅鞔_該新突變?yōu)橹虏⊥蛔?，本文病例CCDC39基因突變致PCD診斷明確。

文獻(xiàn)報道的CCDC39基因突變占總PCD病例的4%～9%[4]。Merveille 等[5]研究顯示，22例CCDC39基因突變導(dǎo)致的PCD病例中，9例(41%)為內(nèi)臟正位，10例(45%)為內(nèi)臟轉(zhuǎn)位，3例(14%)為內(nèi)臟異位(其中2例為Ivemark綜合征)。本文病例表現(xiàn)為伴內(nèi)臟轉(zhuǎn)位的Kartagener綜合征。

PCD是一組遺傳異質(zhì)性疾病，多數(shù)認(rèn)為屬常染色體隱性遺傳病，也有性染色體遺傳的報道。臨床表現(xiàn)主要包括新生兒期的呼吸窘迫，兒童及成年期反復(fù)呼吸道感染、鼻竇炎、中耳炎、支氣管擴張和不孕等。PCD患兒中約50%合并內(nèi)臟轉(zhuǎn)位，稱為Kartagener綜合征。PCD?？稍斐刹豢赡嫘苑螕p傷，可能進(jìn)展為呼吸衰竭。PCD的診斷主要根據(jù)臨床表現(xiàn)和診斷性檢查，包括影像學(xué)、鼻黏膜NO水平、纖毛擺動頻率及電鏡下觀察纖毛的結(jié)構(gòu)異常及功能異常[6]。既往PCD的確診主要靠電鏡下觀察到典型的纖毛結(jié)構(gòu)異常[7]。隨著遺傳學(xué)診斷技術(shù)的進(jìn)步，二代測序Panel和WES的應(yīng)用[8]，新的PCD致病基因不斷被發(fā)現(xiàn)[9]。2016年歐洲呼吸學(xué)會最新的PCD的診斷指南中指出了基因診斷在PCD中的重要作用[10]。一方面，部分臨床表現(xiàn)典型而電鏡下纖毛結(jié)構(gòu)未見異常的病例存在PCD致病基因突變[11]，通過分子診斷與纖毛結(jié)構(gòu)分析相結(jié)合可以使診斷率從57%增加到69%[12]。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)電鏡下纖毛結(jié)構(gòu)異常與存在缺陷的致病基因密切相關(guān)[13,14]，而特定的基因類型與PCD肺部病變嚴(yán)重度及預(yù)后相關(guān)。與本研究結(jié)果一致，研究發(fā)現(xiàn)與外動力臂缺損及內(nèi)外動力臂同時缺損相關(guān)的基因異常相比，CCDC39及CCDC40基因突變的PCD患兒肺功能更差、胸部CT支氣管擴張更明顯[15-17]Marthin等[18]的一項74例PCD患兒的橫斷面縱向研究顯示，34%患兒肺功能下降10%以上，57%的患兒肺功能保持相對穩(wěn)定，還有10%的患兒肺功能有改善，且肺功能與診斷年齡及診斷時的基礎(chǔ)水平無明顯相關(guān)性。一項151例的成人PCD長期隨訪研究報道肺功能隨年齡而呈逐漸下降趨勢，F(xiàn)EV1每年下降0.49%，診斷年齡與肺功能下降呈正相關(guān)[19]。這些研究結(jié)果存在矛盾，可能與研究人群的基因異質(zhì)性有關(guān)。但這些研究均提示基因類型可作為疾病嚴(yán)重度評估和個體化干預(yù)治療的指導(dǎo)指標(biāo)。

遺傳咨詢在遺傳病的診療中起著不可或缺的作用，是理解遺傳病發(fā)生和預(yù)防再發(fā)的重要手段，主要內(nèi)容包括對疾病做出正常的診斷、分析發(fā)病原因和遺傳方式、家族中攜帶或再發(fā)疾病的風(fēng)險率、疾病的預(yù)后、治療方法等幾個問題。由于PCD無特效治療，且會累及多個系統(tǒng)，造成呼吸衰竭、不孕和腦積水等嚴(yán)重并發(fā)癥，國外推薦對PCD患者及親屬進(jìn)行遺傳咨詢[4]。因此，對于臨床診斷PCD的病例，進(jìn)行基因診斷來明確致病基因，對于遺傳咨詢是首要的環(huán)節(jié)，有重要意義。遺傳咨詢包括對明確基因診斷先證者的遺傳咨詢，以及對可能攜帶者的風(fēng)險咨詢及檢測，包括先證者父、母、兄弟、姐妹，先證者父母的兄弟和姐妹等[20]。孕前咨詢對發(fā)現(xiàn)高遺傳疾病風(fēng)險夫婦，提供孕前篩查等至關(guān)重要[21]，對降低遺傳性疾病的發(fā)生起著關(guān)鍵的作用。本研究在先證者臨床及基因診斷明確的基礎(chǔ)上，對家庭進(jìn)行了遺傳咨詢，并對孕婦進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，有益于優(yōu)生優(yōu)育。

PCD尚無特異性的治療手段，現(xiàn)有的治療方法借鑒于囊性纖維化及支氣管擴張的治療[22,23]。有研究收集DNAH11基因突變的PCD病例的纖毛細(xì)胞培養(yǎng)后，采用基因編輯技術(shù)對突變病例的纖毛細(xì)胞進(jìn)行位點特異性重組，結(jié)果顯示可以恢復(fù)突變細(xì)胞的功能[24]。這項研究為PCD的治療帶來了希望。

本文對PCD的基因診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷進(jìn)行了初探，隨著對罕見疾病的認(rèn)識和基因檢測、治療技術(shù)的發(fā)展，PCD的臨床診療將會進(jìn)一步規(guī)范，而遺傳咨詢的規(guī)范和普及將對優(yōu)生優(yōu)育起到重要作用。

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(本文編輯：張崇凡，孫晉楓)

GeneticcounselingandprenataldiagnosisforprimaryciliarydyskinesiainacasecausedbyCCDC39genemutations

QIYuan-yuan1，HONGDa1，WANGHui-jun，ZHANGXiao-bo，WANGLi-bo，JINTing-ting，QIANLi-ling

(Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China)

Corresponding Author：QIAN Li-ling，E-mail: llqian@126.com; JIN Ting-ting

ObjectiveTo identify the genetic defect in a child with primary ciliary dyskinesia and provide genetic counseling and prenatal diagnosis for the family. MethodsWhole exome sequencing (WES) was performed in a case with a clinical diagnosis of Kartagener syndrome as well as her asymptomatic parents. The data analysis pipeline of Children's Hospital of Fudan University was used to identify pathogenic mutations. Amniocentesis was conducted for the mother in her second pregnancy after a thorough genetic counseling. Genomic DNA was extracted from exfoliated amniotic fluid cells and Sanger sequencing was performed after PCR amplification. ResultsDuring follow-ups, the lung function of the patient deteriorated markedly and bronchiectasis shown in chest CT was aggravated. A heterozygous nonsense mutation (c.1819A>A/T, p.K607X) and a frameshift mutation (c.2447_2448het_delCA, p.T816Kfs*3) inCCDC39 gene were detected in this patient by WES. Both mutations were novel and predicted to be disease-causing. Mutational analysis of the parents demonstrated they were compound heterozygous mutations. These compound heterozygous mutations were consistent with ciliary structural abnormity revealed by electron microscope thus suggesting the pathogenic nature of these mutations. Sequencing of the amniotic fluid cells showed that the fetus only carried one heterozygous mutation which was inherited from the mother.ConclusionThe compound heterozygous mutations inCCDC39 gene detected by WES was the genetic cause of primary ciliary dyskinesia. Genetic counseling and prenatal diagnosis may be helpful to the family based on the basis of this genetic diagnosis.

Primary ciliary dyskinesia; Whole exome sequencing ; Genetic counseling; Prenatal diagnosis

上海市科委西醫(yī)引導(dǎo)項目：134119a7800、14411962102；上海市人才發(fā)展基金：滬人201450

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海，201102；1 共同第一作者

錢莉玲，E-mail: llqian@126.com；金婷婷，E-mail:super_jint t@163.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.06.009

2016-08-22

2016-12-13)