梁 芳，許申平，蔣素華，袁秀云，崔 波，張 靜

（1.鄭州師范學院生物工程研究所，河南鄭州 450044；2.皂市高級中學，湖北天門 431703）

菊花MADS-box基因的克隆與表達載體構(gòu)建

梁 芳1，許申平1，蔣素華1，袁秀云1，崔 波1，張 靜2

（1.鄭州師范學院生物工程研究所，河南鄭州 450044；2.皂市高級中學，湖北天門 431703）

為了給菊花CmFUL基因功能鑒定與遺傳改良奠定基礎(chǔ)，采用RT-PCR法從菊花葉片中克隆出1個MADS-box A類基因的編碼區(qū)序列，命名為CmFUL（GenBank登錄號KT894379）。CmFUL基因編碼區(qū)ORF片段長度為741 bp，編碼246個氨基酸。CmFUL蛋白屬于親水性蛋白，預測該蛋白內(nèi)含12個磷酸化位點和2個潛在的N-糖基化位點。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明，Cm FUL蛋白與CMD41蛋白的相似性為95.6%，同屬于AP1/FUL亞家族的FUL-like進化枝。實時熒光定量PCR分析表明，CmFUL基因在花期不同組織中均有表達，但表達豐度不一。在花蕾中表達量最高，其次是管狀花，根和舌狀花中痕量表達；同一朵花中管狀花的表達量約為舌狀花中的12倍。分析認為，CmFUL可能在促進開花及子房建成中起重要作用。將CmFUL基因連接到pCAMBIA1300載體上，成功構(gòu)建了高效植物表達載體。

菊花；FUL-like；基因克??；表達分析；生物信息學

花發(fā)育的第1步是花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變?；ǚ稚M織的誘導及花器官的形成受許多基因的聯(lián)合調(diào)控，參與花發(fā)育的絕大多數(shù)基因均屬于MADS-box基因。MADS-box基因是一個數(shù)量龐大且序列特異的調(diào)控基因家族，其編碼的蛋白為轉(zhuǎn)錄因子，與靶基因的順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控靶基因以特定的強度在特定的時間和空間表達。MADS-box基因廣泛存在于植物中，在動物及真菌中也有發(fā)現(xiàn)。MADS-box基因在某些序列具有高度保守性，所有已知功能的MADS-box基因都屬于TypeⅡ型，其編碼的蛋白由保守程度不一的M（MADS）、I（Intervening）、K（Keratin-like）和C（C-teminal）4個不同的結(jié)構(gòu)域組成［1］。其中MADS盒是由約60個氨基酸組成的高度保守結(jié)構(gòu)域，主要參與DNA的結(jié)合；K盒由約70個氨基酸組成，是植物MADS-box蛋白所特有的中度保守結(jié)構(gòu)域。大量研究表明，MADS-box蛋白在植物絕大多數(shù)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，包括控制營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變，從而控制開花時間、決定分生組織的分化［2］、決定花器官的形成、控制胚的發(fā)育［3］、促進根的形成［4］以及種子和果實的發(fā)育與成熟等［5-6］；此外，還與細胞的衰老和植物的冬眠有關(guān)［7-9］。

在解釋花器官發(fā)育的ABCDE模型中，控制花發(fā)育的同源異型基因絕大部分屬于MADS-box基因，APETALA1（AP1）、CAULIFLOWER（CAL）和FRUITFULL（FUL）同屬于MADS-box的AP1/FUL亞家族的A類基因，且三者在控制花分生組織特異性發(fā)育的功能方面具有冗余性［10］。AP1是花序分生組織特征基因，調(diào)控花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變，同時也是花器官特征基因，是花瓣和萼片的正常發(fā)育所必須的［11］。CAL是AP1的旁系同源基因，只在花發(fā)育過程中促進花分生組織的形成［12］。相比AP1和CAL，F(xiàn)UL基因具有非常廣泛的功能。FUL基因是開花途徑中的下游基因之一。在模式植物擬南芥中，F(xiàn)UL基因也被稱為AGL8，在花序、莖生葉及心皮發(fā)育中發(fā)揮重要的作用［13］。FUL不僅與SOC1一起參與控制開花時間，而且對于維持花序分生組織繼續(xù)發(fā)育成花，抑制其逆轉(zhuǎn)為營養(yǎng)分生組織起到重要作用［14-15］；此外，F(xiàn)UL還能影響葉片的發(fā)育［16］、角果的伸長［17］及裂片細胞的發(fā)育［5］。Xu等［18］將桃的FUL同源基因PpMADS6轉(zhuǎn)入擬南芥中過表達，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出提前開花及花瓣、雄蕊和心皮數(shù)目增加的現(xiàn)象，表明FUL同源基因可能還具有調(diào)節(jié)花器官數(shù)目的功能。GhMADS22在棉花的莖尖、苞片和萼片中高表達，過表達該基因?qū)⒀舆t花器官的衰老與脫落［19］。Jia等［20］的研究表明大豆中Gm FULa的表達受短日照的誘導及長日照的抑制，并推測在根冠中表達量的比值決定了營養(yǎng)生長是否向生殖生長轉(zhuǎn)變。

菊花的MADS-box基因已有部分研究。Shchennikova等［21］從菊花中分離出4個MADS-box基因，序列比對分析表明CDM111屬于AP1類基因，CDM8和CDM41屬于FUL類基因，CDM44屬于SEP3類基因。將CDM41轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草提前20 d開花，與野生型相比莖長度減小36.7 cm，葉片數(shù)減少16片［22］。Wang等［23］從菊花中克隆了一個MADS-box基因CIM8，該基因在擬南芥中過表達則表現(xiàn)提早開花及花序結(jié)構(gòu)異常現(xiàn)象。近年來，利用基因工程手段培育植物新品種已成為現(xiàn)代遺傳育種的重要途徑。本試驗以菊花（Chrysanthemum morifolium）黃色晚花品種獅子頭為材料，利用RTPCR技術(shù)克隆了MADS-box基因的同源基因，并對該基因進行生物信息學分析；采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法對花期不同組織器官中該基因的表達量進行了定量分析；構(gòu)建了高效植物表達載體。旨在為后續(xù)通過基因工程技術(shù)改變花的外觀形態(tài)及進行花期調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為菊花黃色大花品種獅子頭。在盛花期，分別取健康植株的葉片、根、莖、花蕾、管狀花及舌狀花，迅速用液氮冷凍，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成 將菊花不同組織在液氮中充分研磨成粉狀，用TRIzol（Invitrogen公司）試劑分別提取總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，并利用Quawell Q5000微量分光光度計測定其所提RNA的A260/280及A260/230值，計算RNA的濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄參照RevertAid TM First strand cDNA synthesis Kit試劑盒說明書合成普通PCR的cDNA第1鏈，作為PCR模板進行目的基因的克??；用PrimeScriptRT reagent Kitwith gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于RT-qPCR檢測。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI上已登陸的菊花AP1/FUL亞家族（GenBank：AY173055）基因序列，運用Primer Premier 5.0和DNA MAN軟件分別設(shè)計1對引物擴增目的基因編碼區(qū)序列。為構(gòu)建真核表達載體，在引物的5′端分別加上酶切位點。FULF：5′-TCTAGAATGGGTAGAGGAAGAGTTCAGAT-3′，F(xiàn)UL-R：5′-CCCGGGATTGGTTAAGGTGGCGAATC-3′。下劃線部分分別為XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點。

1.2.3 目的基因的克隆 以葉片的cDNA為模板，利用設(shè)計合成的引物進行PCR擴增反應。各個反應體系為20.0μL：10×PCR Buffer 2.0μL、dNTP 150.0μmol/L、引物各0.5μmol/L、cDNA 1 000～2 000 ng、r Taq DNA聚合酶1.0 U。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性35 s，55℃退火35 s，72℃延伸35 s，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測及回收。將回收的目的片段連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)抗性篩選及菌落PCR鑒定，陽性克隆菌送出測序，測序由上海英駿生物技術(shù)公司完成。

1.2.4 在不同組織中的表達分析 根據(jù)克隆測序獲得的菊花FUL基因序列，重新設(shè)計實時熒光定量PCR引物：qRT-FUL-F：5′-CATTAAGCCTTAGGGA TCTTCAG-3′和qRT-FUL-R：5′-CATTAAGCCTTAGG GATCTTCAG-3′。以菊花肌動蛋白基因Actin作為內(nèi)參基因，引物為：Actin-F：5′-ACTCAGCACCTTCC AACAGA-3′和Actin-R：5′-CTCTGGCAACAATCGA CAA-3′。

采用SYBR Prem ix Ex TaqTMⅡkit（TaKaRa）進行RT-qPCR，反應體系為25μL，反應條件為：95℃15 s，58℃15 s，72℃15 s（40個循環(huán)）。反應在Eppendorf Mastercycler熒光定量PCR儀上進行，每個樣品重復3次，同時做陰性對照。通過溶解曲線和擴增曲線確定引物的特異性。目的基因相對表達量Rel.Exp=2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct（Cm FUL）-Ct（ACTIN），ΔΔCt=（各組織ΔCt）-（根ΔCt）。

1.2.5 高效植物表達載體的構(gòu)建 將測序正確的菌液擴搖并進行PCR擴增，提取陽性質(zhì)粒pGEMFUL，分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ消化后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的基因，通過T4連接酶16℃過夜處理，將目的片段定向連接到經(jīng)同樣處理的植物表達載體pCAMBIA1300中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，在含有卡那霉素（Kan 100 mg/L）的LB平板上篩選陽性菌落，重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300-FUL，提取質(zhì)粒后進行PCR檢測及酶切鑒定，均為陽性者再進行測序鑒定。

1.2.6 基因的生物信息學分析 利用ProtParam工具對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析，SMART分析蛋白的結(jié)構(gòu)功能域，運用在線分析軟件TargetP 1.1 Server對蛋白進行亞細胞定位預測。NetPhos 2.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server分別分析磷酸化位點和N-糖基化位點。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測采用ExPASy網(wǎng)站上的GOR Protein secondary structure prediction方法，氨基酸同源序列的多重比對利用DNAMAN軟件生成比對結(jié)果，系統(tǒng)進化樹使用MEGA 5.0軟件中的NJ法建成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花FUL基因的ORF克隆

采用帶有不同酶切位點的引物，進行PCR擴增菊花FUL基因的編碼區(qū)序列，得到1個約750 bp的片段（圖1）。將回收純化的克隆片段連接到pGEMT Easy克隆載體上，經(jīng)過菌落PCR篩選和雙酶切鑒定，獲得陽性重組質(zhì)粒pGEM-FUL。測序結(jié)果表明FUL基因長為741 bp，編碼246個氨基酸，經(jīng)過BlastN和BlastX在線分析，該基因與已登錄的菊花MADS-box基因AP1/FUL亞家族的CDM41基因同源性最高為95.6%，與CsAFT（AB839770）基因同源性為77.8%，確定克隆目的基因成功，該基因命名為Cm FUL（GenBank登錄號KT894379）。

圖1 菊花Cm FUL基因的PCR擴增產(chǎn)物檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR am p licons of Cm FUL gene in Chrysanthem um m orifolium

2.2 氨基酸的基本性質(zhì)分析及二級結(jié)構(gòu)預測

通過對Cm FUL基因的氨基酸序列進行分析（圖2），表明該氨基酸序列屬于植物特有的MIKC型MADS-box基因家族序列。SMART結(jié)果也表明，Cm FUL蛋白在1～60位是個高度保守的MADS結(jié)構(gòu)功能域，即MADS家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域，在81～173位是個中度保守的結(jié)構(gòu)功能域K-box。

經(jīng)蛋白質(zhì)親疏水性分析表明，該CmFUL蛋白屬于親水性蛋白。利用ProtParam工具對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明：Cm FUL的分子質(zhì)量約為28.49 kDa、理論等電點p I為9.49，分子式為C1242H2020N368O379S10；負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為32，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為40。在組成Cm-FUL蛋白的20種氨基酸中，谷氨酸（Glu）和亮氨酸（Leu）所占的比例最高，均為10.6%，半胱氨酸（Cys）所占比例最低，為0.4%。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為60.69，脂肪指數(shù)為73.78，根據(jù)Guruprasad方法表明Cm FUL蛋白不穩(wěn)定。運用在線分析軟件TargetP 1.1 Server對該蛋白進行亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白有可能定位于線粒體，預測剪切位點序列 為99個氨基酸。

圖2 菊花Cm FUL蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Cm FUL conservative protein dom ain structure

NetPhos 2.0 Server預測表明，CmFUL蛋白有9個Ser磷酸化位點（Ser22、Ser61、Ser62、Ser74、Ser121、Ser167、Ser 169、Ser179、Ser211），2個Thr磷酸化位點（Thr141、Thr160）和1個Tyr磷酸化位點（Tyr203）。NetNGlyc 1.0 Server預測表明CmFUL蛋白存在2個潛在的N-糖基化位點：Asn85和 Asn148。此結(jié)果表明蛋白翻譯后修飾對CmFUL蛋白功能的實現(xiàn)起著重要的作用。

由GOR4進行二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，該蛋白二級結(jié)構(gòu)由 α螺旋、伸展鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中α螺旋（Hh）占61.79%，伸展鏈（Ee）占9.35%，無規(guī)則卷曲（Cc）占28.86%（圖3）。

圖3 Cm FUL蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)預測Fig.3 Pu tative resu lt of Cm FUL p rotein secondary structure from Ch rysanthem um m orifolium

2.3 氨基酸序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

圖4 氨基酸序列比對Fig.4 Com parison of the am ino acid sequence of Cm FUL

序列比對分析表明（圖4），CmFUL的氨基酸序列與AY173055（CDM41）的同源性為95.6%，與AB839770（CsAFT）的同源性為75.9%，三者具有共同的eu FUL基序。為進一步分析CmFUL基因與菊科其他MADS-box基因的關(guān)系，將NCBI上已登陸的菊科MADS-box基因進行分析，構(gòu)建了菊科控制花發(fā)育的MADS-box基因的系統(tǒng)進化樹。從圖5可以看出，菊科MADS-box基因分為4個大進化枝，分屬于花發(fā)育模型中的A、B、C、E類基因。其中，第1個大進化枝為AP1/FUL亞家族的A類基因，CmFUL基因（KT894379）與AY173055和AB839770關(guān)系最近，同屬于MADS-box的FUL-like進化枝，與A類其他基因進化關(guān)系較遠。第2個進化枝為SEPALLATA亞家族基因，屬于花發(fā)育模型中的E類基因；第3個進化枝為AGAMOUS亞家族基因，屬于C類基因；第4個進化枝為AP3亞家族基因，屬于B類基因。

圖5 Cm FUL氨基酸的系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of Cm FUL am ino acid sequence

2.4 Cm FUL基因的表達分析

利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)對菊花花期的根、莖、葉、花蕾、管狀花和舌狀花的Cm-FUL基因的表達量進行了分析。結(jié)果表明，CmFUL基因在各個組織中均有表達，但表達豐度不一。在花蕾中表達量最高，其次是管狀花，在根和舌狀花中痕量表達。從圖6可以看出，同一朵花中間部位的管狀花和外緣的舌狀花Cm FUL的表達量差異很大，管狀花中的表達量約為舌狀花中的12倍。在花蕾中的表達量約為花瓣中表達量的3倍。表明CmFUL基因可能在促進開花及子房發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

圖6 Cm FUL的表達特性分析Fig.6 Analysis on the expression level of Cm FUL gene

2.5 植物表達載體的構(gòu)建

將測序成功的質(zhì)粒pGEM-FUL經(jīng)XbaⅠ和SmaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切消化后，得到2個目的片段，分別約為750，3 000 bp（圖7），切膠回收小片段；質(zhì)粒pCAMBIA1300經(jīng)XbaⅠ和SmaⅠ酶切消化后，切膠回收大片段。將回收的pCAMBIA1300大片段與pGEM-FUL的小片段用T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定，得到了1條約750 bp的小片段和1條約10 000 bp的pCAMBIA1300載體片段（圖8），測序驗證結(jié)果表明，成功構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA1300-FUL。

圖7 pGEM-FUL的雙酶切鑒定Fig.7 Restriction enzym e digestion of pGEM-FUL

圖8 pCAMBIA1300-FUL的雙酶切鑒定Fig.8 Restriction enzym e digestion of pCAM BIA1300-FUL

3 結(jié)論與討論

本試驗通過RT-PCR的方法從菊花中克隆了1個MADS-box基因，命名為CmFUL，該基因編碼246個氨基酸，通過Blast分析具有典型的MADS-box蛋白超家族的MADS-MEF2-like結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對分析表明，該基因?qū)儆贏PETALA1/FRUITFULL（AP1/FUL）亞家族，與CDM41（AY173055）基因具有95.6%的同源性，與CsAFT（AB839770）基因具有77.8%的同源性。

大量的系統(tǒng)進化研究表明，隨著核心雙子葉植物的進化，AP1/FUL-like基因至少經(jīng)歷了2次基因復制事件，產(chǎn)生了3個大的進化枝：eu AP1、eu FUL和FUL-like（AGL79）。與此相比，在基部被子植物和單子葉植物的A類基因則只有FUL-like進化枝［24-25］。eu AP1類基因編碼的氨基酸序列在C末端具有典型的eu AP1基序，常以CFAA結(jié)尾；eu FUL和FUL-like類則具有相同的paleo AP1（eu FUL）基序，常具有L/MPPWML結(jié)構(gòu)。本試驗通過系統(tǒng)發(fā)育分析表明，已登陸的菊花A類基因可分為3類，分屬于3個大的進化枝，Cm FUL基因與AY173055和AB839770基因進化關(guān)系最近，屬于MADS-box基因AP1/FUL亞家族中的FUL-like進化枝，與其他菊花A類基因進化關(guān)系較遠，反映了菊花Cm FUL基因可能屬于較為原始的類型。

本試驗利用熒光定量PCR技術(shù)對菊花花期的各組織器官進行了CmFUL表達分析，結(jié)果表明Cm-FUL在花蕾中高表達，反映了A類基因在促進開花方面的功能，在莖、葉和管狀花中少量表達。此結(jié)果與CDM41的功能不完全一致［21］，表明相似的基因序列不一定代表具有相似的基因功能。本試驗首次對菊花盛花期的管狀花和舌狀花中CmFUL基因的表達量進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)同一朵花中管狀花中的表達量遠遠高于舌狀花。菊花具有典型的頭狀花序，中間是兩性的管狀花，外緣是雌性的舌狀花?，F(xiàn)有的栽培品種經(jīng)過數(shù)代雜交后，花器官的形態(tài)及功能發(fā)生了很大的變化，基因的多次重組也使得基因功能更加復雜化。管狀花中CmFUL基因的高表達而在舌狀花中的痕量表達，表明Cm FUL基因功能較為復雜。為了進一步研究CmFUL的功能，構(gòu)建了高效植物表達載體，擬轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中。

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Cloning，Exp ression and Vector Construction of a MADS-box Gene in Chrysanthemum morifolium

LIANG Fang1，XU Shenping1，JIANG Suhua1，YUAN Xiuyun1，CUIBo1，ZHANG Jing2
（1.Institute of Bioengineering，Zhengzhou Normal University，Zhengzhou 450044，China；2.Zaoshi High School of Tianmen City，Tianmen 431703，China）

In order to research the identification of gene function and genetic improvement in Chrysanthemum，a MADS-box fam ily class A gene was isolated from the leaf of Chrysanthemum morifolium by using RT-PCR method，which was designated CmFUL gene（The accession number in GenBank：KT894379）.The coding region of this gene（ORF）was 741 bp and encoded 246 putative am ino acid residues.Encoding product of Cm FUL gene was a kind of hydrophilic protein and predicted that the protein contained 12 phosphorylation sites and 2 potential N-Glycosylation sites.Sequence and phylogenic analyses revealed that Cm FUL was close to CDM41 with 95.6%sequence similarity which both belonged to the FUL-like clade of AP1/FUL subfamily.The expression analyses of CmFUL by Real-time fluorescent quantitative PCR indicated that this gene was expressed in different parts in bloom stage，but the expression abundance was varied widely.The highest amount of expression was observed in buds，followed by in tubiform florets.The expression level in roots and lingulate florets were lowest.It was worth noting that the level expressed in tubiform florets was 12 times of that in lingulate florets between a same flower.The results implied that CmFUL m ight play an important role in promoting flowering and ovary development.CmFUL was linked to pCAMBIA1300 vector and the plant expression vector was constructed successfully.

Chrysanthemum morifolium；FUL-like；Gene cloning；Expression analysis；Bioinformatics

Q949.71+8.43 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0025-07

10.7668/hbnxb.2016.03.004

2015-12-03

鄭州市重大科技專項（141PZDGG189）；河南省科技攻關(guān)項目（524050005）

梁 芳（1982-），女，湖北鄖西人，講師，博士，主要從事植物生物技術(shù)研究。

崔 波（1962-），男，河南泌陽人，教授，博士，主要從事植物分子生物學研究。