周朋君，馬巖巖2，王一飛2，陳宏遠

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人瘦素基因的原核表達載體構建及其蛋白結構分析

周朋君1，馬巖巖2，王一飛2，陳宏遠1

（1.廣東藥科大學基礎學院，廣東廣州510006；2.暨南大學基因工程藥物國家工程研究中心；廣東 廣州510632）

摘要：目的克隆人源Leptin的成熟肽編碼序列后基因并構建其原核重組表達菌株，對其產物進行純化鑒定；生物信息學分析其蛋白質結構并預測功能。方法提取人脂肪干細胞中的總RNA，經(jīng)RT-PCR反轉錄獲得cDNA序列，PCR擴增Leptin基因并將其克隆入表達載體pET-28a（+）原核質粒，構建該基因的重組原核表達載體pET-28a-Leptin。隨后進行雙酶切和測序鑒定。在E.coli BL21（DE3）中誘導表達目的蛋白，通過WB檢測Leptin蛋白的表達；利用在線網(wǎng)絡生物信息學相關數(shù)據(jù)庫和分析軟件對測序結果進行分析，并對重組蛋白結構及功能等進行驗證和預測。結果PCR擴增得到Leptin目標DNA片段；成功構建重組表達質粒pET-28a-Leptin，經(jīng)IPTG誘導表達后，目的蛋白在宿主E.coli BL21（DE3）中高效表達Leptin融合蛋白，相對分子質量18 000。生物信息學檢索該基因編碼蛋白的氨基酸序列與理化參數(shù)顯示，蛋白無跨膜區(qū)，有6個Ser、1個Thr可能為蛋白激酶磷酸化位點，第1～21位可能為信號肽區(qū)域。在Leptin氨基酸序列中：α-螺旋93處，無規(guī)則卷曲43處，延伸鏈17處，β-轉角14處，分別占總二級結構的55.69%、25.75%、10.18%和8.38%。結論成功克隆了人的Leptin基因。利用原核載體表達系統(tǒng)成功表達并進一步純化的Leptin蛋白具有免疫原性。其生物信息學分析及結合蛋白質結構與功能預測結果可為深入研究Leptin蛋白的活性作用提供有益借鑒。

關鍵詞：Leptin基因；分子克??；蛋白結構分析

1994年 Zhang［1］首次成功克隆 Leptin基因。Leptin蛋白是肥胖基因（OB）的表達產物，人類OB基因于 1995年被發(fā)現(xiàn)，位于人7號染色體長臂（q31.3）［2］，其編碼產物為一種分泌性蛋白，即Leptin，編碼這一蛋白的開放閱讀框高度保守［3］。

瘦蛋白受體屬于類細胞因子受體家族，瘦素與其受體相互作用，進而發(fā)揮廣泛的生物學效應。其主要生理功能包括：抑制攝食、增加能量消耗［4］，保護消化系統(tǒng)功能［5］，維持正常的血脂代謝［6］，調節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)［7］，調節(jié)生長發(fā)育［8］，促上皮細胞、血管生長［9-10］，調節(jié)炎癥反應、免疫功能［11-12］，調節(jié)神經(jīng)內分泌［13］及控制腫瘤生長［14］等。

本實驗擬對人瘦素基因進行克隆、構建及重組表達載體，并結合生物信息學分析研究該蛋白的結構與功能，以期獲得產量高、免疫原性好的活性表達蛋白，實驗結果將為該蛋白質的優(yōu)化表達及其活性研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞 感受態(tài)DH5α購自Promega公司，脂肪間充質干細胞由本實驗室分離提取、鑒定。

1.1.2 主要試劑、材料和儀器 E.coli BL21（DE3）、表達載體pET-28a（+）購于Novagen公司。成人脂肪間充質干細胞完全培養(yǎng)基購自賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司。Taq PCR Master Mix購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Prime START HS高保真酶、RT-PCR試劑盒、限制性內切酶QuickCut EcoRⅠ、XhoⅠ、質粒提取試劑盒及T4連接酶購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒購自 OMEGA公司；DNAMarker和蛋白Marker購自廣州賽哲生物技術有限公司；WB抗體購自CST公司；KTA Purifier層析系統(tǒng)系統(tǒng)，購自GE公司；核酸蛋白分析儀購自Beckman Coulter；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)Leptin基因序列［GeneBank NM_000230.2］以及pET-28a（+）的特性，設計合成人Leptin基因CDS序列特異性引物。上游引物序列：5′-GACGAATTC ATGCATTGGGGA ACCCTGTGCG-3′；下游引物序列：5′-ATTCTCGAG TCAGCACCCAGGGCTGAGGT-3′；引物由華大基因公司合成（劃線部分為酶切位點EcoRⅠ、XhoⅠ）。

1.2.2 Leptin基因的擴增 Trizol裂解法提取脂肪干細胞總RNA，檢測RNA純度和濃度。根據(jù)RTPCR試劑盒使用說明進行反轉錄，合成cDNA。以cDNA為模板進行 PCR擴增。PCR擴增體系：Primer STAR HS 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應條件：94℃，4 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，80 s；30個循環(huán)；72℃，10 min；4℃待機。瓊脂糖凝膠電泳進行分析鑒定，切膠回收，純化PCR產物，檢測其純度和濃度。

1.2.3 pET-28a（+）-Leptin重組表達載體的構建與鑒定 按照質粒提取試劑盒說明提取pET-28a（+）質粒。按照限制酶說明對PCR產物和pET-28a（+）載體用EcoRⅠ、XhoⅠ酶分別進行雙酶切，酶切產物分別進行切膠回收。連接體系：Leptin基因產物9 μL，pET-28a（+）載體1 μL，T4 Ligation Mix 10 μL。16℃連接過夜。熱休克法轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞。挑單克隆菌液態(tài)擴增培養(yǎng)12 h后進行菌落PCR、質粒PCR鑒定和重組質粒雙酶切鑒定，選擇陽性重組質粒進行測序。

1.2.4 重組質粒 pET-28a-Leptin在 E.coli BL21 （DE3）中的表達 重組質粒轉化 E.coli BL21 （DE3）。挑取單菌落接種于K+的LB培養(yǎng)基中，180 r/min，37℃搖床培養(yǎng)10～12 h。擴大培養(yǎng)后進行IPTG誘導表達。選取的溫度分別為：20、30、37℃。IPTG終濃度分別為：0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L。20℃時不同濃度IPTG誘導6、8、12 h；30℃時不同濃度IPTG誘導4、6、8、10 h；37℃時不同濃度IPTG誘導2、4、6、8 h。4℃、9 000 r/min、10 min離心收集菌體。稱量菌體濕質量，以1∶10的比例加入1× PBS緩沖液，使用振蕩器重懸菌體。低溫超聲破碎30 min。4℃、17 000 g、30 min離心，分別取沉淀、上清進行SDS-PAGE檢測。考馬斯亮藍染色后分析。

1.2.5 原核重組質粒pET-28a-Leptin表達后的純化純化瘦素的程序為：超聲破碎菌體-尿素溶解包涵體-蛋白復性-柱層析純化。菌體破碎后離心收集的沉淀，用含 2 mol/L尿素的 PBS洗滌沉淀，4℃、17 000 g，30 min離心收集沉淀。用含0.4%脫氧膽酸鈉的PBS洗滌，4℃、17 000 g，30 min離心收集沉淀。PBS洗滌2～3次，4℃、17 000 g，30 min離心收集沉淀。將沉淀溶于 PBS中，加終濃度為1 mmol/L的DTT，4℃攪拌過夜。4℃、9 000 r/min，20 min離心收集上清。NI-NTA填料裝柱，用純水洗2～3個柱體積之后，用pH8.0的PBS平衡柱子。將經(jīng)過平衡的填料于待測樣品冰浴攪拌3 h，2 h沉淀后裝柱。PBS洗至基線。用含30 mmol/L咪唑PBS洗脫雜蛋白，后用含400 mmol/L咪唑的PBS洗脫目的蛋白。脫咪唑后用BCA法測定蛋白濃度，取樣純化各個步驟的洗脫峰進行12%SDSPAGE電泳檢測。

1.2.6 免疫印跡法檢測重組 Leptin蛋白 采用Western blotting法，將純化的目的蛋白經(jīng)12%SDSPAGE分離后，轉膜，封閉，1×TBST洗滌3次，每次8 min，4℃孵育一抗過夜，用1×TBST洗滌3次，每次8 min，室溫孵育二抗（1∶8 000）1 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min，1×TBS洗滌1次，8 min，發(fā)光，顯影，定影，晾干，掃描記錄。

1.2.7 Leptin蛋白的生物信息學分析 利用在線工具對Leptin蛋白進行生物學分析。將測序得到的cDNA序列在 NCBI上進行同源性比對；采用ORFFinder分析確定Leptin基因的讀碼框；Leptin蛋白質一級結構分析：根據(jù)測序所得的cDNA序列，分析其相應的氨基酸組成，采用ProtParam在線軟件檢索Leptin蛋白理化參數(shù)；采用ProtScal程序分析Leptin蛋白疏水性；采用TMHMM Serve，V2.0預測Leptin蛋白的跨膜結構；采用NetPhos2.0 Server程序分析 Leptin蛋白磷酸化位點；采用 SignalP 4.1Server分析Leptin蛋白信號肽位點；采用SOPMA預測 Leptin蛋白的二級結構；采用 Swiss-Model workspace預測Leptin蛋白的三級結構。

2 結果

2.1 Leptin基因的PCR擴增

以cDNA為模板，進行PCR，得到504 bp的目的片段。構建重組質粒轉化感受態(tài)并培養(yǎng)后取菌液進行菌落PCR鑒定；提取陽性菌質粒進行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳得到載體條帶5 335 bp和目的基因條帶504 bp，實驗結果與預期結果相符，見圖1。

M.DNA分子標記 DL15000/2000；1.雙酶切產物；2.pET-28a（+）空載體；3.Leptin基因的PCR擴增產物。圖1 Leptin基因的PCR擴增產物及重組pET-28a-Leptin質粒限制性酶切分析Figure 1 　Recombinant plasmid pET-28a-Leptin identified by PCR and restriction enzyme digestion

2.2 重組質粒pET-28a-Leptin的酶切鑒定及測序分析

測序結果與GeneBank中CDS序列進行對比，匹配度為100%，見圖2。

圖2　pET-28a-Leptin部分測序結果圖Figure 2 　Partial sequencing results of pET-28a-Leptin

2.3 重組質粒pET-28a-Leptin在E.coli BL21（DE3）中的表達

對重組質粒進行誘導表達，SDS-PAGE電泳后進行考馬斯亮藍染色，相對分子質量18 000處有一明顯外源蛋白條帶（圖3A-E）。通過不同溫度、不同IPTG誘導濃度以及不同誘導時間優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)目的蛋白最優(yōu)表達條件為20℃、1.0 mmol/L IPTG誘導6 h。對誘導表達產物以及包涵體純化蛋白進行Western blotting分析，得到特異性條帶（圖3F）。2.4 生物信息學分析結果2.4.1 Leptin蛋白的一級結構分析 提交上述所得DNA測序結果，在線ProtParam軟件進行氨基酸序列組成分析，得到167個氨基酸，組成方式如下：

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVAL SRLQGSLQDMLWQLDLSPGC，與GenBank上列出的序列用Blast進行比對，匹配度為100%。運用生物信息學的方法對該氨基酸序列分析。用ProtParam軟件檢索蛋白質的理化參數(shù)，結果表明：目標蛋白的分子式C842H1333N217O245S7，原子組成2 644，理論分子量為18 640.5，理論等電點為5.88；蛋白質不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為47.52，證明該蛋白不穩(wěn)定?？偲骄H水性（GRAVY）為0.131，其中負電荷殘基總數(shù)（Glu+ Asp）14，正電荷殘基（Lys+Arg）11。脂溶性指數(shù)為110.84，消光系數(shù)33585/33460，該氨基酸序列分子的氨基端帶有由21個氨基酸殘基組成的信號肽序列，但不具有跨膜結構，具有分泌蛋白的特性。CDD程序分析表明，該蛋白有一個典型的瘦素超家族保守結構域，該保守結構分布在第22～167位氨基酸之間。磷酸化位點預測分析結果表明Leptin有6個

Ser，1個Thr，可能為蛋白激酶磷酸化的位點。信號肽區(qū)域第5位的信息肽評分（signal peptide score，S值）為0.971，在剪切位點第22位氨基酸殘基處裂解位點的評分（cleavage site score，C值）為0.862。聯(lián)合切割位點評分（combined cleavage site score，Y值）最大在第22位為0.897。D值（S-mean和Y-max的平均值）最大為0.916。第1～21位氨基酸可能為信號肽區(qū)域，平均S值為0.932，剪切位點在第21和22位氨基酸之間（圖4A-F）。

2.4.2 Leptin蛋白的二、三級結構分析 SOPMA分析結果顯示，在Leptin氨基酸序列中：α-螺旋93處，無規(guī)則卷曲43處，延伸鏈17處，β-轉角14處，分別占總二級結構的55.69%、25.75%、10.18%和8.38%。Swiss-Model workspace同源建模預測：對構建好的模型用全局法和局部法進行質量評估。全局法中用QMEANscore4計分值估算（圖5A）。蛋白質結構檢驗：PDBsumGenerate提交數(shù)據(jù)后顯示Ramachandran圖（圖5B）和G-factor參數(shù)根據(jù)構象的穩(wěn)定性，蛋白結構G-factor計分總平均值為-0.06。

2.4.3 Leptin蛋白質三維結構模型模擬 采用Swiss-PdbViewer 4.1對上述目標蛋白質分子建模，三維結構進行可視化顯示、分析和疊加Swiss-Model預測蛋白質三級結構圖（圖6A），立體化學質量參數(shù)（圖6B）。

M.蛋白分子標記；A.pET-28a（+）vector及pET-28a-Leptin轉染的E.coli BL21（DE3）的表達情況：1、2.空載體轉染菌液上清，3、4.空載體轉染破碎菌體，5.重組載體轉染菌液上清，6、7.重組載體轉染后未誘導破碎菌體，8.重組載體轉染后誘導后破碎菌體；B.20℃，1.0 mmol/L IPTG誘導不同時間表達情況：1.未誘導組，2～5.誘導2 h、6 h、8 h、12 h；C.37℃，1.0 mmol/L IPTG誘導不同時間表達情況：1～3.誘導6 h、8 h、12 h，4.未誘導組；D.表達產物的可溶性分析：1.全菌樣品，2～4.菌體破碎后離心上清，5～7.菌體破碎后沉淀；E.SDS-PAGE分析目的蛋白Leptin的純化：1.純化蛋白；F.目的蛋白Leptin的Western blotting分析：1.全菌樣品，2.菌體破碎后離心沉淀，3.菌體破碎后離心上清，4.包涵體溶解后離心上清。圖3 Leptin重組蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表達Figure 3 Expression of recombinant protein Leptin in E.coli BL21（DE3）

A.ProtScale預測Leptin的疏水性；B.TMHMM Server V2.0預測Leptin的跨膜區(qū)；C.NetPhos2.0 Server預測Leptin的磷酸化位點；D.Signal P 4.1 Server預測Leptin信號肽；E～F.SOPMA對Leptin的二級結構預測。圖4 Leptin蛋白的一級結構分析Figure 4 Analysis of the primary structure of Leptin

A.Leptin的Swiss-Model workspace模型評估結果；B.PROCHECK預測蛋白Ramachandran圖；C.PDBsum Generate預測模型蛋白質結構信息。圖5 Leptin蛋白的二、三級結構分析及結構檢驗Figure 5 Analysis and verification of the secondary and tertiary structure of Leptin

A.Swiss-Model預測蛋白質模型圖；B.Swiss-Model的Ramachandran圖。圖6 Leptin蛋白質三維結構模型模擬Figure 6 Three dimensional model simulations of Leptinstructure

3 討論

本研究根據(jù)GenBank公布的人源Leptin mRNA序列，以編碼區(qū)為模板設計特異性引物，從人脂肪間充質干細胞中克隆該基因，經(jīng)酶切及DNA測序驗證Leptin基因克隆成功。實驗設計的引物特異性好，經(jīng)逆轉錄擴增可獲得明顯的Leptin基因條帶。構建的 pET-28a-Leptin原核重組質粒在 E.coli BL21 （DE3）中經(jīng)IPTG誘導，表達良好。本實驗采用低溫條件誘導表達，最優(yōu)表達條件為20℃、1.0 mmol/L IPTG誘導6 h，與之前報道相比對溫度和誘導時間進行了進一步優(yōu)化［15］。pET表達體系是目前在原核細胞中克隆和表達目的蛋白的最佳體系之一。本實驗選用E.coli BL21（DE3）作為表達體系，誘導表達目的蛋白，操作簡便、成本低、周期短、表達蛋白可大量生產且易于純化［16］。通過WB檢測Leptin蛋白的表達，并在此基礎上對目的蛋白進行純化分離，探索了一種簡便、快速、高產的體外高效表達Leptin的方法。

為了提高瘦素蛋白的表達量及其蛋白活性作用，目前瘦素的研究大多以探討其表達條件優(yōu)化及相關作用為主，而缺少對其蛋白結構分析方面的分析。本實驗利用在線網(wǎng)絡生物信息學相關數(shù)據(jù)庫和分析軟件對測序結果進行分析，并對重組蛋白結構及功能等進行驗證和預測。利用在線工具對Leptin蛋白的一級結構分析數(shù)據(jù)顯示：成熟的Leptin前體為分泌性蛋白，帶有信號肽，N末端有21個氨基酸殘基組成的信號肽，該前體的信號肽在外周血中被剪切掉而成為146氨基酸，形成Leptin［17］。瘦素的初級結構及高級結構在哺乳動物中高度保守［18］。Leptin有6個Ser、1個Thr可能作為蛋白激酶磷酸化潛在作用位點而參與細胞信號傳導。對蛋白質的親疏水區(qū)域進行分析，結果能為二級結構預測、結構域與功能域的劃分提供參考。

利用在線工具進行Leptin蛋白的2、3級結構預測，所得數(shù)據(jù)將為Leptin蛋白的表達設計、定向遺傳改造、受體拮抗劑的開發(fā)及構效關系的研究等提供科學依據(jù)。

最近研究顯示，體內瘦素濃度與冠心病發(fā)病風險有關［19］，還參與下丘腦-垂體-性腺發(fā)育過程等［20］。目前，人類重組瘦素蛋白應用于肥胖患者的治療已經(jīng)進入Ⅰ期臨床實驗階段［21］。因此，采用本方法優(yōu)化表達的高產量瘦素蛋白將為其活性作用研究奠定良好基礎。

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（責任編輯：幸建華）

中圖分類號：Q786

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0355-07

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041205

收稿日期：2016-04-12

基金項目：廣東省科技計劃項目（2015A020211036）

作者簡介：周朋君（1989—），男，2013級碩士研究生；通信作者：陳宏遠（1973—），男，教授，博士，主要從事抗腫瘤免疫及其分子機制研究，Email：hychen@gdpu.edu.cn。

Construction of Leptin gene expression vector and analysis of its protein structure

ZHOU Pengjun1，MA Yanyan2，WANG Yifei2，CHEN Hongyuan1
（1.Department of Pathogen Biology and Immunology，School of Basic Course，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.National Engineering Research Center of Genetic Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

AbstractObjective To clone and express human Leptin gene and protein and then analyze and predict its protein structure and function by bioinformatics.Methods Leptin mRNA sequence was amplified by RTPCR from human adipose-derived mesenchymal stem cells.The product was cloned into pET-28a + prokaryotic plasmid to construct the recombinant expression vector pET-28a-Leptin.After determined by restriction enzyme digestion and sequencing pET-28a-Leptin was transformed in E.coli BL21 DE3 for protein expression.The purified Leptin protein was identified by western blotting.Leptin protein was further analyzed for prediction of its structure and function by bioinformatics-associated databases and software. Results Leptin fragment was successfully amplified by PCR and cloned into pET-28a + plasmid.The

網(wǎng)絡出版時間：2016-05-30 10：44 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1044.005.htmlrecombinant protein Leptin was highly expressed in E.coli BL21 DE3 when induced by IPTG and its molecular weight was about 18 000.Bioinformatics analysis of Leptin displayed that this protein had not transmembrane region six Ser and one Thr might be the potential sites of protein kinase phosphorylation and bits 1-21 might be a signal peptide region.The secondary structure analysis of Leptin showed that this protein was consisted of α-helix 93 random coil 43 extended chain 17 and β-angle 14 which accounted for 55.69% 25.75% 10.18%and 8.38% respectively.Conclusion Human Leptin gene and protein has been successfully cloned and expressed.Bioinformatics analysis and structure prediction of Leptin provide an evidence for further study of its bioactivity.

Key wordsLeptin gene molecular cloning protein structure analysis