周婷婷，謝春蘭，張改云，楊全

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深海放線菌Streptomyces sp.WP6次生代謝產(chǎn)物的研究

周婷婷1，2，謝春蘭1，2，張改云2，楊全1

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生物資源遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén)361005）

摘要：目的研究深海來(lái)源鏈霉菌Streptomyces sp.WP6具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。方法采用正相硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、TLC薄層制備層析色譜、中壓快速制備層析色譜和高壓液相色譜等方法分離純化次生代謝產(chǎn)物，采用13C NMR、1H NMR、HMBC、HSQC、1H-1H COSY、LC-MS等波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)。結(jié)果從該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物，分別鑒定為：鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（1）、N-乙?；野罚?）、脯氨酸-亮氨酸（3）、N-乙酰色胺（4）、吲哚-3-甲酸（5）、苯乙酸（6）、環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）（7）、（4S）-4，10二羥基-10甲基-2烯-1，4內(nèi)酯（8）。結(jié)論首次從Streptomyces sp.WP6發(fā)酵產(chǎn)物中分離到上述8個(gè)次生代謝產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：放線菌；鏈霉菌；生物活性；次級(jí)代謝產(chǎn)物

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-23 16：28 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160523.1628.004.html

放線菌是最重要和最大的藥源微生物種群，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的天然抗生素中約有70%來(lái)源于放線菌家族，其中鏈霉菌屬占90%以上［1］。但是，多年來(lái)主要集中于陸地放線菌的研究開(kāi)發(fā)，次級(jí)代謝產(chǎn)物的高度重復(fù)率已成為新型藥物研發(fā)的瓶頸［2］。由于海洋來(lái)源的放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)豐富多樣且研究相對(duì)較少，因此對(duì)海洋放線菌特別是深海來(lái)源的放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，有望為海洋來(lái)源的新型藥物研發(fā)提供模式結(jié)構(gòu)及豐富我國(guó)海洋微生物天然產(chǎn)物庫(kù)。

深海來(lái)源放線菌Streptomyces sp.WP6是由國(guó)家海洋局第三海洋研究所張改云從西南印度洋-2 539 m沉積物中分離到的鏈霉菌屬菌株，關(guān)于該菌的化學(xué)成分研究目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文對(duì)該菌株進(jìn)行擴(kuò)大規(guī)模發(fā)酵并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，其中提取分離出8個(gè)代謝產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（1）、N-乙?；野罚?）、脯氨酸-亮氨酸（3）、N-乙酰色胺（4）、吲哚-3-甲酸（5）、苯乙酸（6）、環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）（7）、（4S）-4，10二羥基-10甲基-2烯-1，4內(nèi)酯（8），所有化合物均為首次從Streptomyces sp.WP6發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到。

1 儀器與材料

1.1 儀器與材料

Bruker AV400核磁共振波譜儀（美國(guó)bruker公司）；Xevo G2 Q-Tof三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；Eyela旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化公司）；IS-RDS3C恒溫振蕩器（美國(guó)精騏有限公司）；分析型、制備型薄層色譜硅膠板和柱色譜硅膠（煙臺(tái)江友硅膠有限公司）；Sephadex LH-20凝膠（40～70 μm，Amersham Pharmacia公司）。

1.2 菌株來(lái)源

從西南印度洋-2 539 m的沉積物中分離到實(shí)驗(yàn)菌株，通過(guò)16s rRNA基因序列（1 489 bp）比對(duì)，結(jié)合其培養(yǎng)特征分析，與Streptomyces rutgersensis NBRC 18819T相似度為99.18%，由國(guó)家海洋局第三海洋研究所張改云鑒定為Streptomyces rutgersensis。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

大豆蛋白胨5 g/L，淀粉15 g/L，甘油15 g/L，細(xì)菌學(xué)蛋白胨15 g/L，海鹽30 g/L，pH 7.4。

2 菌株發(fā)酵與次生代謝產(chǎn)物分離

2.1 發(fā)酵

將適量生長(zhǎng)良好的深海來(lái)源鏈霉菌Streptomyces rutgersensis接種到裝有400 mL液體培養(yǎng)基的1 L的錐形培養(yǎng)瓶中，28℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，將一級(jí)種子培養(yǎng)液以3%（體積比）的接種量接種到5 L（含1.5 L培養(yǎng)基）的錐形培養(yǎng)瓶中，28℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，將二級(jí)種子培養(yǎng)液以5%（體積比）的接種量接種到50 L（含40 L培養(yǎng)基）的發(fā)酵罐中，28℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)7 d。

2.2 次級(jí)代謝產(chǎn)物分離

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)16 000 r/min離心得到發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次后減壓濃縮得粗提物A；菌絲體首先用甲醇浸泡3次后減壓濃縮，然后再經(jīng)乙酸乙酯萃取得到粗提物B。兩部分粗提物經(jīng)TLC檢測(cè)后成分相近，故合并得總浸膏17 g。浸膏經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠柱用甲醇-水梯度洗脫（5%→100%），得到10個(gè)流分（Fr.1～Fr.10）。Fr.2依次經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20（三氯甲烷-甲醇，體積比為1∶1）、正相硅膠柱層析反復(fù)分離得到化合物1（9.8 mg）和化合物2（51.0 mg），F(xiàn)r.3用上述同樣的方法分離得到化合物3（29.2 mg），F(xiàn)r.5依次經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20（甲醇）、TLC薄層制備層析色譜純化得到化合物4（13.2 mg），F(xiàn)r.6依次經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20（三氯甲烷-甲醇，體積比為1∶1）、正相硅膠柱層析純化得到化合物5（3.3 mg）、化合物6（50.4 mg）、化合物7 （10.0 mg），F(xiàn)r.8依次經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20（三氯甲烷-甲醇，體積比為1∶1）、正相硅膠柱層析反復(fù)分離得到化合物8（4.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色油狀（丙酮），mp 55℃。HRESIMS m/z：413.266 7［M+Na］+（calcd for C24H38O4Na，413.266 8）。1H NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.67（2H，dd，J=3.3，5.7 Hz，H-12，24），7.77（2H，dd，J=3.3，5.7 Hz，H-11，23），4.22（4H，t，J=5.2 Hz，H-8，20），4.22（2H，t，J=5.2 Hz，H-5，17），1.40（4H，m，H-4，16），1.36（4H，m，H-3，15），1.45（4H，m，H-6，18），1.35（4H，m，H-2，14），0.95（6H，t，J=7.4 Hz，H-1，13），0.91（6H，t，J=7.2 Hz，H-7，19）。13C NMR （CD3COCD3，100 MHz）δ：167.1（s，C-9，21），132.6 （s，C-10，22），131.1（d，C-12，24），128.7（d，C-11，23），67.5（t，C-8，20），38.8（d，C-5，17），30.2（t，C-4，16），28.8（t，C-3，15），23.6（t，C-6，18），22.7（t，C-2，14），13.4（q，C-1，13），10.4（q，C-7，19）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3］報(bào)道一致，故鑒定化合物1為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl）phthalate］。

化合物2：白色粉末（甲醇），mp 169℃。HRESIMS m/z：202.083 8［M+Na］+（calcd for C10H13NO2Na，202.084 4）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.02（1H，d，J=8.5 Hz，H-4，8），6.72（1H，d，J= 8.5 Hz，H-5，7），3.33（2H，t，J=7.3 Hz，H-1），2.68 （2H，t，J=7.3 Hz，H-2），1.90（3H，s，H-2）。13C NMR （CD3OD，100 MHz）δ：171.8（s，C-1′），155.5（s，C-6），129.8（s，C-3），129.3（d，C-4，8），114.9（d，C-5，7），41.0（t，C-1），34.5（t，C-2）21.2（q，C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4-5］報(bào)道一致，故鑒定化合物2為N-乙?；野罚∟-acetyltyramine）。

化合物3：白色粉末（三氯甲烷），mp 163～165℃。HRESIMS m/z：233.128 6［M+Na］+（calcd for C11H18N2O2Na，233.126 6）。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：4.11（1H，t，J=8.0 Hz，H-6），4.01（1H，dd，J=3.7，9.6 Hz，H-9），3.56（2H，m，H-3），1.53 （1H，m，H-10a），2.03（1H，m，H-10b），2.11（1H，m，H-5a），2.34（1H，m，H-5b），1.78（1H，m，H-11），0.99 （3H，d，J=6.6 Hz，H-13），1.90（1H，m，H-4a），2.01 （1H，m，H-4b），0.94（3H，d，J=6.6 Hz，H-12），6.46 （1H，s，NH）。13C NMR（CDCl3，100 MHz）δ：170.5 （s，C-7），166.3（s，C-1），59.0（d，C-6），53.4（d，C-9），45.5（t，C-3），38.5（t，C-10），28.1（t，C-5），24.6 （d，C-11），23.3（q，C-13），22.7（t，C-4），21.2（q，C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6-7］報(bào)道一致，故確定化合物3為脯氨酸-亮氨酸［cyclo-（Pro-Leu）］。

化合物4：乳白色油狀（甲醇），bp（484.7± 28.0）℃。HRESIMS m/z：225.101 0［M+Na］+（calcd for C12H14N2ONa，225.100 4）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.08（1H，s，H-6），7.08（1H，td，J=1.0，7.8 Hz，H-2），7.00（1H，td，J=0.9，7.8 Hz，H-5），7.55 （1H，d，J=7.8 Hz，H-4），7.34（1H，d，J=7.8 Hz，H-7），3.47（2H，t，J=7.4 Hz，H-11），2.94（t，J=7.4 Hz，H-10），1.93（s，H-2′）。13C NMR（CD3OD，100 MHz）δ：173.3（s，C-1′），138.1（s，C-8），128.8（s，C-9），123.4（d，C-6），122.3（d，C-2），119.5（d，C-5），19.2 （d，C-4），113.2（s，C-3），112.2（d，C-7），41.5（t，C-11），26.2（t，C-10），22.6（q，C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致，故鑒定化合物4為N-乙酰色胺（N-acetyltryptamine）。

化合物5：淡黃色粉末（丙酮），mp 226～228℃。HRESIMS m/z：184.039 2［M+Na］+（calcd for C9H7NO2Na，184.037 4）。1H NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：8.06（1H，d，J=2.5 Hz，H-2），7.22（1H，td，J=7.3，2.1 Hz，H-5），7.20（1H，td，J=7.3，2.1 Hz，H-6），8.16（1H，dd，J=7.3，2.5 Hz，H-4），7.52（1H，m，H-7），11.02（1H，brs，NH）。13C NMR （CD3COCD3，100 MHz）δ：165.4（s，C-1），136.8（s，C-7a），131.9（s，C-3a），126.5（d，C-2），122.4（d，C-5），121.2（d，C-6），121.0（d，C-4），112.0（d，C-7），107.7（s，C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道一致，故鑒定化合物5為吲哚-3-甲酸（indol-3-carboxylic acid）。

化合物6：白色粉末（甲醇），mp 76.5℃。HRESIMS m/z：159.043 0［M+Na］+（calcd for C8H8O2Na，159.042 2）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.23-7.32（5H，m，H-4，5，6，7，8），3.59（2H，s，H-2）。13C NMR（CD3OD，100 MHz）δ：174.3（s，C-1），134.6（s，C-3），129.0（d，C-4，8），128.1（d，C-5，7），126.6（d，C-6），40.6（t，C-2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報(bào)道一致，故確定化合物6為苯乙酸（phenylaceticacid）。

化合物7：黃色粉末（丙酮），mp 146～148℃。HRESIMS m/z：267.110 8［M+Na］+（calcd for C14H16N2O2Na，267.110 9）。1H NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.35（2H，t，J=7.4 Hz，H-4′，6′），7.31（2H，t，J=7.4 Hz，H-3′，7′），7.24（1H，t，J=7.4 Hz，H-5′），4.13（1H，t，J=8.4 Hz，H-6），4.40（1H，t，J=5.8 Hz，H-3），3.39（1H，m，H-1″a），3.53（1H，m，H-1″b），3.03 （1H，dd，J=7.0，14.4 Hz，H-1′a），3.34（1H，dd，J=4.7，14.4 Hz，H-1′b），1.67（1H，m，H-3″a），2.14（1H，m，H-3″b），1.86（2H，m，H-2″）。13C NMR （CD3COCD3，100 MHz）δ：169.1（s，C-1），165.0（s，C-4），137.3（s，C-3′），129.7（d，C-4′），129.7（d，C-6′），128.3（d，C-3′），128.3（d，C-7′），126.6（d，C-5′），58.7（d，C-6），56.2（d，-3），44.7（t，C-1″），36.1（t，C-1′），28.0（t，C-3″），22.1（t，C-2″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致，故鑒定化合物7為環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）［cyclo-（Pro-Phe）］。

化合物8：乳白色油狀（甲醇），bp（360.8±15.0）℃，［α］2D5+8（c 0.20，MeOH）；HRESIMS m/z：235.130 1 ［M+Na］+（calcd for C12H20O3Na，235.131 0）。1H NMR （CD3OD，400 MHz）δ：7.73（1H，dd，J=5.7，1.4 Hz，H-3），6.11（1H，dd，J=5.7，2.0 Hz，H-2），5.16（1H，m，H-4），1.82（1H，m，H-5a），1.65（1H，m，H-5b），1.18（6H，s，H-11，12），1.48（2H，m，H-6）。13C NMR （CD3OD，100 MHz）δ：176.2（s，C-1），160.0（d，C-3），121.9（d，C-2），85.9（d，C-4），71.7（s，C-10），44.9 （t，C-9），34.3（t，C-5），31.3（t，C-7），29.4（q，C-11，12），26.3（t，C-8），25.5（t，C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10-11］報(bào)道一致，故鑒定化合物8為（4S）-4，10二羥基-10甲基-2烯-1，4內(nèi)酯［（4S）-4，10-dihydroxy-10-methylundec-2-en-1，4-olide］。

以上8個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1　深海放線菌Streptomyces sp.WP6中分離到的8個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物Figure 1 Secondary metabolites isolated from deep-sea-derived actinomycete Streptomyces sp.wp6

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（責(zé)任編輯：陳翔）

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-8783（2016）03-0282-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016020101

收稿日期：2016-02-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2015028）；海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（GD2012-D01-001）

作者簡(jiǎn)介：周婷婷（1991—），女，2014級(jí)碩士研究生，Email：1225247873@qq.com；通信作者：楊全（1972—），男，博士，教授，主要從事中藥資源方面研究，Email：yangquan7208@vip.163.com

Study on the secondary metabolites from a deep-sea-derived actinomycete Streptomyces sp.WP6

ZHOU Tingting1，2，XIE Chunlan1，2，ZHANG Gaiyun2，YANG Quan1
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources，Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，China）

AbstractObjective To study the biological activity secondary metabolites from Streptomyces sp.WP6.

Methods Normal phase silica gel column chromatography RP gel column chromatography Sephadex LH-20 gel column chromatography preparative thin-layer chromatography rapid preparative HPLC and medium pressure HPLC were used for isolating and purifying the secondary metabolites.The structures of secondary metabolites were identified by13C NMR1H NMR HMBC HSQC1H-1H COSY and LC-MS.Results Eight secondary metabolites were obtained and identified as di- 2-ethylhexyl phthalate 1 N-acetyltyramine 2 cyclo- Pro-Leu 3 N-acetyltryptamine 4 indol-3-carboxylic acid 5 phenylaceticacid 6 cyclo- Pro-Phe 7 4S -4 10-dihydroxy-10-methylundec-2-en-1 4-olide 8 .Conclusion All compounds were isolated for the first time from Streptomyces sp.WP6 for the forst time.

Key wordsactinomycete Streptomyces sp. biological activity secondary metabolites