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        長期應(yīng)用地西泮對豚鼠耳蝸微音器電位的影響

        2016-07-27 07:06:18王立友柴玲姍劉永江熊順華
        西北藥學雜志 2016年4期
        關(guān)鍵詞:毛細胞豚鼠耳蝸

        王立友,李 姍,王 芳,柴玲姍,劉永江,熊順華

        (1.湖北醫(yī)藥學院臨床醫(yī)學專業(yè),十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學院生理學教研室,十堰 442000)

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        ·藥理·

        長期應(yīng)用地西泮對豚鼠耳蝸微音器電位的影響

        王立友1,李姍1,王芳1,柴玲姍1,劉永江1,熊順華2*

        (1.湖北醫(yī)藥學院臨床醫(yī)學專業(yè),十堰442000;2.湖北醫(yī)藥學院生理學教研室,十堰442000)

        摘要:目的觀察長期應(yīng)用地西泮對豚鼠耳蝸微音器電位的影響。方法采用逐漸增加劑量的方法皮下注射地西泮3個月后停藥,10 d后用不同強度的短聲刺激誘發(fā)微音器電位產(chǎn)生,測量誘發(fā)微音器電位產(chǎn)生的閾值,用共聚焦顯微鏡測量耳蝸毛細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果應(yīng)用地西泮3個月后停藥,與對照組相比,引起豚鼠微音器電位產(chǎn)生的閾值明顯降低,微音器電位的幅度顯著增加,記錄出自發(fā)的微音器電位,毛細胞內(nèi)Ca2+濃度降低。結(jié)論長期應(yīng)用地西泮后豚鼠耳蝸對聲刺激的敏感性增加可能與毛細胞內(nèi)Ca2+濃度降低有關(guān)。

        關(guān)鍵詞:地西泮;長期應(yīng)用;耳蝸;微音器電位

        1儀器與材料

        1.1儀器BL-420生物信號采集系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);共聚焦顯微鏡(LSM 510 META,德國蔡氏集團)。

        1.2試藥Fluo-4AM(DojinDo Laboratories東仁化學科技上海有限公司);地西泮(天津金耀藥業(yè)有限公司,批號1403181,5 mg·mL-1);人工外淋巴液(mmol·L-1)的配制:氯化鈉溶液137 mmol·L-1,氯化鉀溶液5.4 mmol·L-1,氯化鎂溶液1.8 mmol·L-1,氯化鈣溶液1.3 mmol·L-1,N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)5.0 mmol·L-1,葡萄糖(Glucose)5.0 mmol·L-1,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.3。

        1.3動物約150 g的豚鼠40只(實驗動物質(zhì)量合格證SCXK(鄂)2011-0011)。動物實驗在湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心完成,實驗動物設(shè)施使用證明SYXK(鄂)2011-0031。

        2方法

        2.1地西泮成癮模型的構(gòu)建選取豚鼠40只,實驗組20只,對照組20只,實驗組采用逐漸增加劑量的方法皮下注射地西泮,首劑0.2 mL,致使豚鼠在10~20 min內(nèi)呈安靜睡眠狀態(tài),2 d給藥1次,每個劑量注射5次后增加0.05 mL,直至劑量增至0.55 mL,在用藥80 d時開始逐漸減量,每次減0.1 mL,每個劑量應(yīng)用1次,減至0.2 mL時停藥;對照組皮下注射同等劑量的生理鹽水,停藥10~15 d時進行微音器電位的記錄和引發(fā)微音器電位閾值的測量。

        2.2耳蝸微音器電位記錄和聽閾的測量每100 g豚鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為100 g·L-1的氨基甲酸乙酯0.5 mL以麻醉豚鼠,剪去一側(cè)耳廓后面的毛,用咬骨剪剪開耳廓后面的乳突即可見圓窗,將1根電極置于圓窗或其附近,另一電極置于皮下,信號送入BL-420信號采集系統(tǒng)進行記錄,將不同強度的電壓信號輸入話筒給出短聲刺激以誘發(fā)耳蝸微音器電位,每一個單刺激時間為2 ms,刺激強度從最小的0.01 V開始逐漸增加,致話筒發(fā)出的聲音逐漸增大,以引發(fā)出不同幅度的電位,當聲音增加至某一強度時剛好記錄到微音器電位,即為聽閾。在保持周圍環(huán)境安靜的情況下連續(xù)記錄1 h以觀察能否記錄出自發(fā)產(chǎn)生的微音器電位。

        2.3共聚焦顯微鏡測量細胞內(nèi)Ca2+取30 μL的二甲基亞楓加入裝有50 μg Fluo-4AM粉末的EP管中,使其溶解并充分混勻,取已經(jīng)溶解的含有Fluo-4AM的混合物1 μL,加入100 μL人工外淋巴液將其稀釋。取停藥10~15 d的豚鼠,擊昏,去頭取耳蝸,置于人工外淋巴液中,用吸管吹打,使毛細胞脫離耳蝸壁至外淋巴液中,取已經(jīng)分離的耳蝸毛細胞置于96孔板中,靜置10 min后,盡可能地吸去外淋巴液,在含有毛細胞的培養(yǎng)板中加入已經(jīng)稀釋了的含F(xiàn)luo-4AM的外淋巴液,10 μL/孔,放入培養(yǎng)箱中,整個過程要注意避光,20 min后取出,放于共聚焦顯微鏡上進行檢測,激發(fā)波長為488 nm。

        3結(jié)果3.1應(yīng)用地西泮3個月后耳蝸微音器電位的變化應(yīng)用地西泮3個月后停藥,與對照組相比,刺激誘發(fā)的耳蝸微音器電位產(chǎn)生的閾值明顯降低,微音器電位的幅度顯著增加,在沒有聲音刺激的環(huán)境下連續(xù)記錄1 h,對照組沒有記錄出自發(fā)產(chǎn)生的微音器電位,在地西泮組,10個豚鼠中有3個記錄出自發(fā)的微音器電位,見表1和圖1。

        表1地西泮成癮后豚鼠微音器電位的變化

        Tab.1 Changes of the microphonic potentials after diazepam addiction in guinea pigs

        (n=10)

        注:*P<0.05。

        圖1刺激誘發(fā)和自發(fā)產(chǎn)生的微音器電位

        A.對照組;B.實驗組;C.刺激誘發(fā)的微音器電位;D.自發(fā)產(chǎn)生的微音器電位

        Fig.1 The evoked and spontaneous microphonic potential

        A.control group;B.diazepam group;C.microphonic potential evoked by stimulation;D.spontaneous microphonic potential

        由圖1可知,箭頭所示為自發(fā)產(chǎn)生的微音器電位,用刺激誘發(fā)對照組和實驗組的微音器電位幅度隨刺激強度而發(fā)生變化。

        3.2應(yīng)用地西泮3個月后耳蝸毛細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的高低可用細胞內(nèi)熒光強度表示,激光共聚焦顯微鏡可實時記錄熒光強度;與對照組相比,地西泮組毛細胞漿中熒光強度和光密度值(對照組 3 475.00±801.79,實驗組2 324.90±701.17,P<0.05)顯著降低,Ca2+濃度顯著低于對照組。見圖2。

        圖2耳蝸外毛細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化

        A.對照組;B.地西泮組

        Fig.2 Changes of Ca2+concentration in the outer hair cells of the cochlea

        A.control group;B.diazepam group

        4討論

        當聲波使基底膜產(chǎn)生機械運動時,毛細胞與蓋膜的相對位置變化形成剪力使靜纖毛傾斜,通過“彈簧門控作用”使靜纖毛頂部陽離子通道開放,陽離子內(nèi)流導致膜電位發(fā)生去極化;毛細胞的去極化使細胞膜上的電壓依賴性Ca2+通道開放,Ca2+流入胞內(nèi),胞內(nèi)Ca2+濃度升高使細胞側(cè)膜上的Ca2+激活,K+通道開放,大量K+外流,毛細胞復(fù)極化,同時產(chǎn)生感受器電位和微音器電位,使聽神經(jīng)的傳入纖維興奮并發(fā)放沖動,引起聽覺的形成。結(jié)果顯示,不同強度的聲音刺激耳蝸,誘發(fā)的微音器電位幅度與聲刺激強度成正比;與對照組相比,長期應(yīng)用地西泮停藥后,引發(fā)微音器電位產(chǎn)生的刺激閾值降低,同等強度聲刺激誘發(fā)的微音器電位幅度增大,提示豚鼠耳蝸對聲音的敏感性增加,且在沒有聲音刺激時還記錄到自發(fā)產(chǎn)生的微音器電位,提示長期大量應(yīng)用地西泮后出現(xiàn)的聽覺過敏和幻聽可能與耳蝸功能活動的變化有關(guān)。由圖2可知,長期大量應(yīng)用地西泮后,毛細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著低于對照組;Ca2+通過非選擇性陽離子通道、L型Ca2+通道和N型Ca2+通道進入毛細胞內(nèi),Ca2+入胞增大了細胞的去極化,增強了聽覺的產(chǎn)生;但細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加,促進了K+外流、細胞的復(fù)極化過程以及聽覺的抑制和中止。在內(nèi)耳,Ca2+參與了耳蝸毛細胞的機械轉(zhuǎn)導、適應(yīng)、調(diào)諧、受體電位的形成和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等多種細胞活動;耳蝸內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定對正常聽覺的形成至關(guān)重要,而胞內(nèi)Ca2+濃度的升高或降低都影響聽覺的形成;有資料顯示,過度的聲刺激會導致耳蝸微音器電位振幅下降,并伴有外毛細胞胞內(nèi)Ca2+濃度不斷升高,兩者具有負相關(guān)性[10-11]。進一步提示,胞內(nèi)Ca2+濃度降低與聽覺的敏感性增強有關(guān)。耳蝸毛細胞上表達GABA受體[12],地西泮可作用于GABA受體,打開Cl-通道,Cl-內(nèi)流使膜電位下降,影響L和N型Ca2+通道的開放,使Ca2+內(nèi)流減少。聽覺的敏感性增強或幻聽的產(chǎn)生可能與地西泮致胞內(nèi)Ca2+濃度的降低導致聽覺的抑制和中止過程減弱有關(guān),其對耳蝸的影響還有待進一步探討。

        參考文獻:

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        基金項目:湖北省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(編號:2014109 29021)

        作者簡介:王立友,男,在讀本科生

        *通信作者:熊順華,女,教授

        doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.018

        中圖分類號:R965

        文獻標志碼:A

        文章編號:1004-2407(2016)04-0386-03

        (收稿日期:2015-09-10)

        Effect of long-term application of diazepam on cochlea microphonic potential in guinea pig

        WANG Liyou1,LI Shan1,WANG Fang1,CHAI Lingshan1,LIU Yongjiang1,XIONG Shunhua2*

        (1.Clinical Medicine Specialty,Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;2.Department of Physiology,Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

        Abstract:Objective To investigate the effect of long term usage in diazepam on the microphonic potential in guinea pigs.Methods Diazepam with progressively higher doses was injected into the subcutaneous of guinea pigs for 3 months. The microphonic potential was induced by short blast under different intensities after 10 days.Then the thresholds of microphonic potential were measured and changes of Ca2+concentration in cochlea hair cells were determined by laser scanning confocal microscope.Results Compared with the control group,the threshold value of stimulation induced microphonic potential was significantly decreased,while the amplitude was significantly increased.The spontaneous microphonic potential was recorded,and Ca2+concentration in cochlea hair cell of guinea pig was reduced in diazepam group.Conclusion The sensitivity of guinea pig cochlea to acoustic stimulation may be related to the decrease of Ca2+concentration in hair cells after long-term use of diazepam.

        Key words:diazepam;long-term application;the cochlear;microphonic potential

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