張小會(huì)，張　丹，梁恩濤，余　敏，黃小波,2，曹三杰,2，文心田,2，文翼平,2，伍　銳,2

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減毒沙門氏菌投遞的TGEV S基因疫苗口服免疫豬的動(dòng)態(tài)規(guī)律

張小會(huì)1,3，張丹1，梁恩濤1，余敏1，黃小波1,2，曹三杰1,2，文心田1,2，文翼平1,2，伍銳1,2

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物傳染病與基因芯片實(shí)驗(yàn)室，雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)人獸共患病研究室與豬病防治研究中心，成都611130；3.屏山縣畜牧獸醫(yī)局,宜賓645350

摘要：目的研究TGEV S基因疫苗SL7207(PVAXD-TS)口服免疫仔豬后的動(dòng)態(tài)免疫誘導(dǎo)規(guī)律。方法將口服疫苗SL7207(PVAXD-TS)、空載體菌株SL7207(PVAXD)以1.6×1011CFU/頭的劑量口服接種20日齡仔豬，以PBS為空白對(duì)照，2周后以2.0×1011CFU的劑量加強(qiáng)免疫。分別測(cè)定0、2、4、6和8周的血清IgG、IgA、TGEV中和抗體、細(xì)胞免疫反應(yīng) IL-4、IFN-γ、外周血淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果仔豬口服免疫后第4周即可檢測(cè)抗TGEV的特異性IgG和糞黏液IgA抗體；在免疫后第6周IgA、IgG、IL-4、IFN-γ抗體和外周血T淋巴細(xì)胞增殖與SL7207(PVAXD)、PBS間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，并在第6周達(dá)到最高值；中和實(shí)驗(yàn)顯示該疫苗誘導(dǎo)的血清IgG具有中和活性。結(jié)論證實(shí)以減毒沙門菌為載體的TGEV S基因疫苗口服免疫仔豬有較好的免疫原性。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎；減毒沙門氏菌；S基因；仔豬；免疫原性

Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos. 30901084 & 31072144)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis ,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus ,TGEV)引起的一種腸道傳染病，各年齡階段的豬均可感染本病，尤其是2周齡以內(nèi)的哺乳仔豬最易感，其死亡率高達(dá)100%[1]，TGE已給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大危害。目前該病尚無有效的藥物可用于治療，因此，疫苗預(yù)防接種仍然是防治該病的最佳選擇。

TGEV的S糖蛋白突出于病毒粒子表面，具有重要的免疫學(xué)功能。S 蛋白攜帶主要的B 淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的結(jié)構(gòu)蛋白[2]。豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白是具有良好免疫原性的結(jié)構(gòu)蛋白，能誘導(dǎo)特異性IgG和黏膜sIgA抗體的產(chǎn)生[3-4]。黃小波等[5]研究的減毒沙門氏菌遞呈的TGEV S/N融合基因疫苗在小鼠體內(nèi)具有良好的免疫原性，但與TGEV S單基因疫苗相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且SL7207(pVAX-S/N)干擾素水平低于SL7207(pVAX-S)。多項(xiàng)研究表明TGEV S單基因疫苗具有良好的免疫原性。任曉峰等[6]構(gòu)建的含TGEVS基因主要抗原位點(diǎn)的DNA疫苗，通過肌肉注射免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG和IgA抗體。Ahn等[7]將構(gòu)建的TGEV S基因轉(zhuǎn)基因植物疫苗飼喂小鼠，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了特異性IgG和IgA抗體。

減毒沙門氏菌作為疫苗載體被廣泛應(yīng)用各種疫苗的研究中。其所攜帶的外源性抗原基因可在宿主體內(nèi)有效表達(dá)[8]。減毒沙門氏菌作為DNA疫苗載體的顯著優(yōu)點(diǎn)是能進(jìn)行口服免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的局部粘膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫[9]。減毒沙門氏菌作為鼠疫疫苗的載體遞呈抗原，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的IgG抗體，表明其具有良好的免疫原性[10]。Yang等[11]構(gòu)建了旋毛蟲優(yōu)勢(shì)抗原Ts87的重組減毒沙門氏菌菌株，口服免疫小鼠，誘導(dǎo)了全身性Thl/Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)和局部黏膜IgA抗體的產(chǎn)生。因此，近年來被廣泛用于新型疫苗的研發(fā)。

本研究前期構(gòu)建了攜帶TGEV S基因的減毒沙門氏菌SL7207(PVAXD-TS) ，經(jīng)菌株的體外穩(wěn)定性試驗(yàn)和小鼠的安全性試驗(yàn)，證實(shí)該菌株具有良好的穩(wěn)定性與安全性。同時(shí)該疫苗口服免疫小鼠后可有效激發(fā)小鼠產(chǎn)生抗TGEV的血清IgG、腸道黏膜IgA抗體和IFN-γ[12]。本研究在前期小鼠實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將該疫苗通過口服免疫仔豬，研究其在仔豬體內(nèi)的免疫誘導(dǎo)規(guī)律，為該疫苗的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株、細(xì)胞和動(dòng)物重組減毒沙門氏菌SL7207(PVAXD-TS) 和SL7207(PVAXD)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；Vero細(xì)胞和ST細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室傳代保存；15頭20 d齡健康的杜-長(zhǎng)-大三元仔豬，購(gòu)自雅安某豬場(chǎng)。

1.2主要試劑小量質(zhì)粒抽提試劑盒：OMEGA公司產(chǎn)品；Hind III和KpnI限制性內(nèi)切酶：寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；測(cè)定抗體(IgG,和IgA)的ELISA試劑盒，測(cè)定細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4)的ELISA試劑盒：R&D 公司產(chǎn)品；豬淋巴細(xì)胞分離液：TBD天津?yàn)蠊井a(chǎn)品；小牛血清和DMEM培養(yǎng)基：GIBCO公司產(chǎn)品；卡那霉素：Biosharp公司產(chǎn)品；MTT、肝素鈉、ConA ：Amresco公司產(chǎn)品。

1.3復(fù)蘇與鑒定將菌株SL7207(PVAXD-TS)與對(duì)照菌株SL7207(PVAXD)復(fù)蘇接種于5 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ ，220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的菌液涂布于含Kan的LB瓊脂平板培養(yǎng)16～20 h。挑取SL7207(pVAXD-TS)和SL7207(PVAXD)的單菌落接種于5 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃， 220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按OMEGA公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR與酶切鑒定。

1.4口服疫苗制備選取鑒定后的重組減毒沙門氏菌SL7207(PVAXD-TS) 和對(duì)照組SL7207(PVAXD)的單菌落接種于5 mL含100 μg/mL的Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃， 220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液按照1∶100比例接種于2 000 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.8左右。4 000 r/min離心5 min后收集菌體，用含5%NaHCO3的滅菌PBS調(diào)整菌液濃度至2×1010CFU/mL。

1.5口服免疫將15頭仔豬隨機(jī)分成3組，每組5頭，分別為實(shí)驗(yàn)組SL7207(PVAXD-TS) 、對(duì)照組SL7207(PVAXD)和PBS，仔豬免疫前禁食禁水5 h，免疫后禁食禁水2 h?？诜庖咦胸i，SL7207(PVAXD-TS) 和SL7207(PVAXD)以每只1.6×1011CFU的劑量進(jìn)行初次免疫，2周后以2.0×1011CFU的劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫2次，PBS組飼喂含5%NaHCO3的PBS，其余相同。每天觀察仔豬精神、食欲、飲欲、糞便等情況，連續(xù)觀察至第8周。

1.6樣品收集

1.6.1血液樣品在首免后第0、2、4、6和8周分別采集每頭豬的血液3 mL，一部分血液加入肝素納抗凝，用于測(cè)定外周血T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，剩余部分分離血清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2糞便黏液樣品肛拭棉法取糞便樣品，做好標(biāo)記。樣品逐個(gè)加入200 μL 0.01 mol/L的PBS浸泡肛拭棉，4 ℃作用1.5 h，離心收集上清液，-20 ℃保存待檢。

1.7免疫相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1特異性血清IgG和黏膜IgA的測(cè)定參照ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清IgG和IgA，主要步驟：1)ELISA實(shí)驗(yàn)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔對(duì)應(yīng)加入2倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液；樣本孔加待測(cè)仔豬血清10 μL，樣本稀釋液40 μL，吹打混勻；2)加入HRP標(biāo)記的二抗50 μL，37 ℃恒溫箱溫育1 h；3)棄去酶標(biāo)板中的液體，加入稀釋的洗滌液，洗滌5次，拍干；4)加入底物A和底物B各50 μL，37 ℃避光15 min；5)加入終止液50 μL，反應(yīng)10 min；6)450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD450值。

1.7.2豬 IL-4和IFN-γ水平檢測(cè)參照ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清IL-4和IFN-γ，主要步驟同1.7.1，不同之處是：檢測(cè)IL-4時(shí)待測(cè)樣品孔加入待測(cè)仔豬血清40 μL，抗-IL-4抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL；測(cè)IFN-γ時(shí)加入抗IFN-γ抗體，鏈霉親和素-HRP 50 μL。

1.7.3外周血T淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1)采用一次性注射器無菌采集仔豬前腔靜脈血液，于滅菌的已加入肝素鈉的4 mL離心管內(nèi)，取肝素鈉抗凝血緩慢加于淋巴細(xì)胞分離液上，采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法(2 000 r/min，12 min)分離外周血淋巴細(xì)胞，收集淋巴細(xì)胞；用PBS緩沖液洗滌2次，再用不完全RPMIl640洗滌1次，最后用完全RPMI1640將細(xì)胞稀釋成5×106個(gè)/mL。2)取100 μL淋巴細(xì)胞懸液加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)樣品重復(fù)3孔；加入終濃度為25 μg/mL 的ConA，置培養(yǎng)板于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)68 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)，10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入DMSO 100 μL，培養(yǎng)2 h，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD490值。

1.7.4中和實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法培養(yǎng)ST細(xì)胞，接種TGEV病毒，按Reed-Muench法計(jì)算出TGEV TCID50。將采集的第6周的仔豬血清56 ℃處理30 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將密度?×105個(gè)/孔的ST細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)成單層細(xì)胞。將滴度為100TCID50的TGEV分別與1∶4，1∶16，1∶64,1∶256，1∶1 024稀釋的血清37 ℃，作用1 h，將混合物接種到單層細(xì)胞上，每個(gè)孔重復(fù)4次，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)CPE和未出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔數(shù)，計(jì)算血清的中和抗體效價(jià)。

1.8數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)的分析處理用SPSS Statistic17.0軟件。

2結(jié)果

2.1復(fù)蘇鑒定將菌株SL7207(PVAXD-TS)復(fù)蘇培養(yǎng)，提取質(zhì)粒PVAXD-TS分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定，結(jié)果PCR擴(kuò)增出約1 900 bp的條帶，與預(yù)期的TGEV S抗原基因(1 896 bp)大小相符(見圖1A)；用Hind III和KpnI對(duì)pVAXD-TS雙酶切，可切出與預(yù)期大小相符的目的片段約(1 900 bp)和載體片段(3 800 bp)(見圖1)。

M: DNA Marker; lane1, 2: S gene fragment of TGEV amplified by PCR from pVAXD-TS; lane 3: negative controls; lane 4: plasmid pVAXD-TS digested by Hind III / KpnI.

2.2TGEV特異性抗體的動(dòng)態(tài)變化免疫后第2周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)刺激產(chǎn)生的特異性抗體水平IgG、IgA均有所上升，在免疫后第4周特異性抗體含量與對(duì)照組SL7207(pVAXD)、PBS間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在第6周抗體含量達(dá)到最高值，其中TGEV IgG達(dá)(129.24±5.27) ng/mL,(圖2A)，IgA達(dá)(80.88±5.37) ng/mL(2B)；免疫后第8周抗體水平下降。

2.3仔豬血清γ-干擾素和IL-4水平動(dòng)態(tài)變化免疫后第2周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)刺激產(chǎn)生的IFN-γ含量有所上升; 免疫后第4周IFN-γ含量顯著高于免疫前和對(duì)照組SL7207(pVAXD)、PBS(P<0.01)；免疫后第6周達(dá)到最高值(497.07±36.02 pg/mL)；免疫后第8周，IFN-γ含量有所下降(圖3A)。IL-4檢測(cè)結(jié)果顯示：免疫后第2周，免疫組IL-4含量有所上升；免疫后第4周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)IL-4含量與SL7207(pVAXD)、PBS和免疫前相比差異極顯著(P<0.01)；免疫后第6周IL-4含量達(dá)到最高峰(289.16±3.44 pg/mL)；免疫后第8周，IL-4含量有所下降(圖3B)。

A: serum IgG level; B: feces mucosal IgA level.

A: interferon-γ level; B: IL-4 level.

2.4仔豬血液T淋巴細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)規(guī)律免疫后第2周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞的刺激作用開始增強(qiáng)，在4～6周間增長(zhǎng)最快，到第6達(dá)到最高值；免疫后第6周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)與對(duì)照組SL7207(pVAXD)和PBS間有極顯著差異(P<0.01)；免疫后第8周，免疫組T淋巴細(xì)胞增殖水平有所下降。整個(gè)免疫過程中，SL7207(pVAXD)和PBS對(duì)照組對(duì)淋巴細(xì)胞均無明顯刺激作用，一直處于較低水平(圖4)。

2.5疫苗誘導(dǎo)的TGEV中和抗體動(dòng)態(tài)變化采集免疫后第6周的仔豬血液，分離血清，采用固定病毒稀釋血清的方法測(cè)定血清中和效價(jià)。中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨血清稀釋度的增加其病毒抑制力明顯下降，在血清稀釋度為1∶4～1∶64之間具有較強(qiáng)的中和活性，且與對(duì)照組SL7207(pVAXD)和PBS間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算出SL7207(pVAXD -TS)的中和效價(jià)為10-1.58(1∶38.02)，顯示了較好的中和活性(見圖5)。

圖4　仔豬外周血T淋巴細(xì)胞增殖水平

3討論

減毒沙門氏菌的顯著優(yōu)點(diǎn)是能夠作為黏膜免疫載體，進(jìn)行黏膜免疫接種，其在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)方面有著不可比擬的優(yōu)越性[10]。以減毒沙門氏菌為載體構(gòu)建的多種疫苗均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和粘膜免疫反應(yīng)[13]，產(chǎn)生較高的IgG和IgA抗體[14-15]。目前，關(guān)于乳酸菌作為 TGEV疫苗載體開展口服免疫研究的報(bào)道也較多[16]。Liu[17], Ho等[18]，Tang等[19]構(gòu)建的TGEV S基因的乳酸菌疫苗，免疫小鼠均能誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，但誘導(dǎo)的特異性抗體含量均遠(yuǎn)低于本研究以沙門氏菌為載體的疫苗的免疫結(jié)果。上述結(jié)果表明，以減毒沙門氏菌為載體的口服疫苗具有良好的免疫應(yīng)答，且減毒沙門氏菌作為TGEV DNA疫苗載體可能比乳酸菌更具優(yōu)勢(shì)。

圖5　抗TGEV中和抗體檢測(cè)

TGE主要通過腸道感染豬體，豬小腸是TGEV的重要靶器官。腸道局部粘膜免疫對(duì)阻止TGEV的侵入具有極其重要的作用，腸道分泌型 IgA(sIgA)抗體在抗TGEV感染中發(fā)揮主要作用[20]。口服免疫主要是通過胃腸黏膜進(jìn)行抗原遞呈，進(jìn)而刺激腸道產(chǎn)生局部粘膜免疫應(yīng)答。因此，選擇一種能刺激腸道產(chǎn)生IgA抗體的免疫途徑符合TGEV的感染機(jī)理。目前，關(guān)于口服免疫有效激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的報(bào)道較多[21]。趙德[22]等將PEDV S(C-COE)重組乳酸菌疫苗通過口服和肌肉注射兩種途徑免疫小鼠，結(jié)果表明口服比肌肉注射更容易吸收，產(chǎn)生較高水平的抗體。本研究結(jié)合TGEV腸道粘膜免疫機(jī)理，采用口服途徑接種仔豬，免疫后第2周即能檢測(cè)腸道分泌型IgA抗體和血清IgG抗體。本研究結(jié)果表明，口服免疫能夠誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生針對(duì)TGEV的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

TGEV S基因疫苗的免疫原性研究前期多在小鼠體內(nèi)進(jìn)行[5,12]，不能反應(yīng)其在本種動(dòng)物體內(nèi)的免疫原性。本研究中，SL7207(pVAXD-TS)能夠誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體含量，特別是IgG 抗體含量遠(yuǎn)大于Ho[18]和Liu[17]等報(bào)道的特異性抗體含量。同時(shí)，SL7207(pVAXD-TS)誘導(dǎo)的抗TGEV中和抗體在血清稀釋度為1∶4時(shí)，病毒抑制率為100%，高于文獻(xiàn)Liu[17,19]等報(bào)道的血清稀釋度為1∶2時(shí)，病毒抑制率為100%。此外，本研究測(cè)定的細(xì)胞因子含量(IL-4、IFN-γ)和MTT值均遠(yuǎn)高于此前文獻(xiàn)的相關(guān)報(bào)道[23-25]，但I(xiàn)FN-γ含量低于黃小波等[6]報(bào)道。這可能與動(dòng)物模型、免疫劑量、基因片段、長(zhǎng)度等有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，重組沙門氏菌SL7207(pVAXD-TS)在仔豬體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫動(dòng)態(tài)規(guī)律與小鼠基本相似[12]。該疫苗口服免疫妊娠母豬和其他年齡階段豬只能否像仔豬一樣產(chǎn)生明顯的細(xì)胞免疫、體液免疫和局部黏膜免疫應(yīng)答需要進(jìn)一步研究。此外，本研究為了闡明疫苗的動(dòng)態(tài)免疫規(guī)律，為了避免仔豬日齡過小產(chǎn)生應(yīng)激發(fā)病而影響試驗(yàn)，特選用了20日齡左右的仔豬，由于免疫周期長(zhǎng)達(dá)8周，當(dāng)研究結(jié)束時(shí)仔豬日齡已達(dá)到70日齡左右，此日齡段的仔豬可感染TGEV但通常無明顯癥狀，所以本研究未進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，而是以體外抗體中和試驗(yàn)進(jìn)行間接評(píng)價(jià)疫苗效果。在本研究基礎(chǔ)上，后續(xù)將開展母豬的口服免疫抗體監(jiān)測(cè)，同時(shí)以產(chǎn)房一周內(nèi)的仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，以更貼近臨床發(fā)病實(shí)際情況來科學(xué)評(píng)價(jià)該疫苗的免疫保護(hù)效果。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.008

通訊作者：黃小波，Email：rsghb110@126.com

中圖分類號(hào)：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)01-0033-06

Corresponding author:Huang Xiao-bo, Email: rsghb110@126.com

收稿日期：2014-12-09；修回日期:2015-11-07

Dynamic oral immuno-induction regulation of attenuated Salmonella typhimurium harboring DNA vaccine expressing S gene of transmissible gastroenteritisvirus in piglets

ZHANG Xiao-hui1,3,ZHANG Dan1,LIANG En-tao1,YU-Min1,HUANG Xiao-bo1,2,CAO San-jie1,2,WEN Xin-tian1,2,WEN Yi-ping1,2,WU Rui1,2

(1.LaboratoryofAnimalInfectiousDiseaseandMicroarray/KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya'an625014,China;2.LaboratoryofZoonosisandPigDiseasePreventionResearchCenter,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;3.PingshanCountyAnimalHusbandryandVeterinaryBureau,Yibin645350,China)

Abstract:To develop the dynamic immune regulation of oral vaccine SL7207(pVAXD-TS) in piglets, 20-day-old piglets were orally immunized with SL7207(pVAXD -TS) and SL7207(pVAXD) at a dosage of 1.6 × 1011CFU per piglet, PBS was used as blank control. The booster immunization was done at a dosage of 2.0×1011CFU after 2 weeks. Virus neutralization assay, the specific serum IgG, intestinal mucosal IgA, IFN-γ assay, IL-4 assay, T lymphocyte proliferation assay were respectively performed at 0, 2, 4, 6, 8 weeks. Results showed that SL7207(pVAXD-TS) could induce specific IgG and IgA antibody after four weeks post immunization, and the level of IgA, IgG, IL-4, IFN-γ, and T lymphocytes proliferation were significantly higher(P<0.01) than SL7207(pVAXD) and PBS at 4 weeks; they reached a peak at 6 weeks. Meanwhile, virus neutralization assay showed that serum IgG had a good neutralization activity. It is suggested that the attenuated Salmonella typhimurium harbouring TGEV S gene have a good oral immunogenicity in piglets.

Keywords:Transmissible gastroenteritis; attenuated Salmonella typhimurium; S gene; oral immunogenicity; piglets; immunogenicity

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30901084; No.31072144)