張耀剛，李超群，毋德芳，曹得萍

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細(xì)粒棘球蚴和多房泡球蚴在人體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)譜初步分析

張耀剛，李超群，毋德芳，曹得萍

青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，西寧810001

摘要：目的初步掌握流行于青海省細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲棘球蚴(原頭節(jié)、囊壁、囊液)和多房棘球絳蟲幼蟲泡球蚴在中間宿主人體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)情況。方法利用SDS-PAGE和 Western-blot分析棘球蚴原頭節(jié)、囊壁、囊液蛋白質(zhì)和泡球蚴總蛋白表達(dá)譜。結(jié)果細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的蛋白質(zhì)濃集在分子量72 kDa處，囊壁的蛋白質(zhì)濃集在72 kDa、26 kDa和17 kDa 處，囊液的蛋白濃集在72 kDa、43～55 kDa、26 kDa和17 kDa；泡球蚴總蛋白質(zhì)濃集在分子量72 kDa、55～72 kDa和26 kDa處。結(jié)論不同地區(qū)細(xì)粒棘球蚴在人體內(nèi)蛋白的表達(dá)存在差異；不同亞種泡球蚴原頭節(jié)蛋白的表達(dá)存在差異。

關(guān)鍵詞：細(xì)粒棘球蚴；多房泡球蚴；蛋白質(zhì)表達(dá)譜

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棘球蚴病(Echinococcosis)，俗稱包蟲病，是一種由棘球絳蟲的幼蟲寄生于動物和人體內(nèi)而引起的人獸共患寄生蟲病[1]。我國最常見的是細(xì)粒棘球蚴感染所致的囊型包蟲病和多房棘球蚴感染所致的泡型包蟲病。由于兩種絳蟲是同屬，存在多種共同抗原組分，在免疫診斷中存在交叉反應(yīng)，從而給兩種疾病的鑒別診斷帶來困難[2]。分析棘球蚴和泡球蚴的蛋白表達(dá)譜有助于了解棘球蚴和泡球蚴的抗原成分,為抗包蟲疫苗的研制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。而目前分析細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)、囊壁、囊液和多房棘球蚴總蛋白表達(dá)譜的研究鮮有報道。本研究擬運(yùn)用SDS-PAGE和 Western-blot技術(shù)對細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)、囊壁、囊液和多房泡球蚴總蛋白質(zhì)成分進(jìn)行初步研究，分析棘球蚴和泡球蚴總蛋白質(zhì)表達(dá)情況，為深入了解細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲和多房棘球幼蟲的蛋白代謝途徑以及發(fā)育過程奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗標(biāo)本本實(shí)驗所用人體包蟲病標(biāo)本來源于青海省西寧市各大醫(yī)院外科手術(shù)病人。

1.2細(xì)粒原頭節(jié)、囊壁和囊液總蛋白的制備

1.2.1原頭節(jié)總蛋白的制備取0.5 mL原頭節(jié)(約5 000個)加入2 mL非變性蛋白裂解液(40 mmol/L Tris-HCl、適量蛋白酶抑制劑)，振蕩混勻。冰上超聲粉碎2 min(60周，每次30 s，間隔10 s)，4 ℃振蕩3 h,以使組織充分裂解，顯微鏡下檢查原頭節(jié)已破碎完全，4 ℃，12 000×g離心40 min。取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2囊壁總蛋白的制備剪取大約2 g棘球蚴囊壁用0.1 mol/L PBS液洗滌3次，剪碎，加入2 mL非變性蛋白裂解液(40 mmol/L Tris-HCl、適量蛋白酶抑制劑)，振蕩混勻。冰上超聲粉碎2 min(60 W，每次30 s，間隔10 s)，4 ℃振蕩3 h,以使組織充分裂解，顯微鏡下檢查囊壁已破碎完全，4℃，12 000×g離心40 min。取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3囊液總蛋白的制備取2 mL的棘球蚴囊液，4 ℃，12 000×g離心30 min。取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3泡球蚴總蛋白的制備剪取泡球蚴標(biāo)本0.5 g加入2 mL非變性蛋白裂解液(40 mmol/L Tris-HCl、適量蛋白酶抑制劑)，振蕩混勻。冰上超聲粉碎2 min(60 W，每次30 s，間隔10 s)，4 ℃振蕩3 h,以使組織充分裂解，顯微鏡下檢查組織已破碎完全，4 ℃，12 000×g離心40 min。取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4SDS-PAGE和Western-blot使用SDS-PAGE和Western-blot分析棘球蚴原頭節(jié)、囊壁和囊液及泡球蚴總蛋白質(zhì)表達(dá)譜，使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天試劑公司) 測定蛋白濃度，并將各樣本濃度稀釋至相同，SDS-PAGE上樣量為15 μL；采用本室保存的棘球蚴和泡球蚴患者血清進(jìn)行Western-blot分析。

2結(jié)果

2.1利用SDS-PAGE分析細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)、囊壁和囊液總蛋白質(zhì)的蛋白表達(dá)譜采用本室保存的棘球蚴患者血清進(jìn)行Western-blot分析。原頭節(jié)的蛋白質(zhì)濃集在分子量72 kDa處，囊壁的蛋白質(zhì)濃集在72 kDa、26 kDa和17 kDa 處，囊液的蛋白濃集在72 kDa、43～55 kDa、26 kDa和17 kDa。結(jié)果詳見圖1。

W: cyst wall; F: cyst fluid; P: protoscolices.

2.2利用SDS-PAGE分析多房棘球絳蟲幼蟲泡球蚴總蛋白質(zhì)的蛋白表達(dá)譜，采用本室保存的泡球蚴患者血清進(jìn)行Western-blot分析。蛋白質(zhì)濃集在分子量72 kDa、55～72 kDa和26 kDa處。結(jié)果詳見圖2。

圖2　泡球蚴總蛋白質(zhì)的蛋白表達(dá)譜的SDS-PAGE和Western-blot

3討論

蛋白質(zhì)在細(xì)胞中有多種功能，包括結(jié)構(gòu)上的支持作用、構(gòu)成收縮系統(tǒng)以及參與分子轉(zhuǎn)運(yùn)，它們有的作為激素、有的作為毒素，更多的具有抗原性；另一些尤其是免疫球蛋白是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組分。另外一個大的群體酶，能夠催化細(xì)胞中的蛋白質(zhì)基本合成和降解反應(yīng)。

細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)、囊壁、囊液的蛋白主要濃集于72 kDa，這與Li[3]等的研究結(jié)果是一致的,但三者之間也存在著一定的差異，囊壁的蛋白質(zhì)除72 kDa外，在26 kDa和17 kDa處也有表達(dá)，而囊液的蛋白在43-55 kDa、26 kDa和17 kDa均有表達(dá)。顯示出囊液的表達(dá)譜更寬。Wang XY[4]等所研究的細(xì)粒棘球蚴14-3-3蛋白質(zhì)的分子量為24-33 kDa，與本研究的結(jié)果囊壁和囊液26 kDa的蛋白質(zhì)是比較接近的。而Zhang Q[5]等對寧夏細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示蛋白質(zhì)主要分布在43-97.4 kDa 與 14.0 kDa，與本研究結(jié)果略有差異，本次研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球蚴囊液在26 kDa處亦有表達(dá)，這可能是由于生存環(huán)境的不同導(dǎo)致細(xì)粒棘球蚴囊液的蛋白的表達(dá)出現(xiàn)差異，也可能是不同基因型之間囊液蛋白的表達(dá)存在差異，這還有待進(jìn)一步研究。

本研究多房泡球蚴總蛋白濃集在分子量72 kDa、55～72 kDa和26 kDa處，與Cao Y[6]、Ueno M[7]的結(jié)果差異不大，而內(nèi)蒙古歐洲多房棘球絳蟲原頭節(jié)蛋白的分子量為10～120 kDa，表達(dá)范圍更廣[8]，表明不同亞種泡球蚴原頭節(jié)蛋白的表達(dá)存在差異。

本研究中Western-blot鑒定的蛋白質(zhì)均為總蛋白，打算在以后的研究中通過二維電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定更全面的有關(guān)棘球蚴原頭節(jié)、囊壁、囊液蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)譜。進(jìn)一步研究在棘球蚴原頭節(jié)、囊壁、囊液中表達(dá)的這些蛋白質(zhì)對棘球蚴生命代謝的影響，將為在蛋白質(zhì)水平上探索治療藥物開發(fā)，致病機(jī)制的研究理論提供依據(jù)。也可將這些蛋白分子用作候選抗原，研究其免疫保護(hù)性，有助于研發(fā)有關(guān)棘球蚴的有效疫苗。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.005

通訊作者：曹得萍，Email:qhmccdp@163.com

中圖分類號：R383.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0021-03

Corresponding author:Cao De-ping, Email: qhmccdp@163.com

收稿日期：2015-03-06；修回日期:2015-09-30

Preliminary protein expression profiling analysis on human hydatid and alveolar hydatid in Qinghai Province

ZHANG Yao-gang,LI Chao-qun,WU De-fang,CAO De-ping

(DepartmentofPathogenicBiology，MedicalCollegeofQinghaiUniversity，Xining810001，China)

Abstract:The aim of this study was to analyze the preliminary protein expression profiling on human Echinococcus granulosus metacestode (protoscoleces, cyst wall and cyst fluid) and Echinococcus multilocularis metacestode. To investigate the profiles at the protein expression level, SDS-PAGE and Western-blot were carried out to detect the protein expressing profiles of human hydatid (protoscoleces, cyst wall and cyst fluid) and alveolar hydatid. Results showed that the protein molecular weight of human hydatid protoscoleces was aggregated in 72 kDa, the protein molecular weight of cyst wall was aggregated in 72 kDa, 26 kDa and 17 kDa, the protein molecular weight of cyst fluid was 72 kDa, 43-55 kDa, 26 kDa and 17 kDa; the protein molecular weight of alveolar hydatid was aggregated in 72 kDa, 55-72 kDa and 26 kDa. Results suggested that the different subspecies may result in different protein expression in human hydatid. And alveolar hydatid also had different protein profile in different subspecies.

Keywords:human hydatid; alveolar hydatid; protein expression profilin

國家自然基金地區(qū)項目(No.81360255)和春暉計劃項目(No.2012)聯(lián)合資助