王海媛，孫明輝，任智慧，周芳，晉興華（天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

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研究開發(fā)

響應(yīng)面法優(yōu)化中空介孔二氧化硅球包載吲哚美辛的工藝研究

王海媛，孫明輝，任智慧，周芳，晉興華
（天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

摘要：采用硬模板法在室溫下、中性水溶液中合成了中空介孔二氧化硅球，中空部分直徑為 250nm，外殼厚度25nm。利用氮?dú)馕?解吸附、透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜表征了微球的物理化學(xué)性質(zhì)。該微球球形度良好，BET結(jié)果顯示其比表面積為730.0m2/g，平均孔容1.084cm3/g，平均孔道直徑6.58nm。利用中空介孔二氧化硅球較好的載藥性能負(fù)載吲哚美辛，并采用三因素的Box-Behnke實驗設(shè)計對藥物負(fù)載處方工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。當(dāng)IMC/HMSNs質(zhì)量比為22:1，超聲1.4h，震蕩吸附23h時實驗條件達(dá)到最佳，包封率理論值為85.2%。在此條件進(jìn)行驗證實驗，吲哚美辛的包封率可達(dá)理論預(yù)測值的98.7%，說明將 Box-Behnken 實驗設(shè)計法用于中空介孔二氧化硅球包載吲哚美辛的優(yōu)化篩選是可行的，且得到的實驗觀察值與數(shù)學(xué)模型的預(yù)測值相符合。

關(guān)鍵詞：中空介孔二氧化硅球；吲哚美辛；Box-Behnken實驗；包封率

吲哚美辛（Indomethacin，IMC），又名消炎痛，是一種非甾體消炎藥，是最強(qiáng)的環(huán)氧酶抑制劑之一，具有解熱、抗炎、抗風(fēng)濕的作用，臨床上主要用于急性風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。此外，有研究表明吲哚美辛具有良好的抗腫瘤作用[1-3]，該藥被認(rèn)為是比撲熱息痛和阿司匹林更具有發(fā)展前景的藥物。吲哚美辛為BCSⅡ類藥物（生物藥分類系統(tǒng)，biophamacecitieal classification system），其脂溶性好，但水溶性極差（5μg/mL，25℃），普通制劑如片劑、膠囊劑、軟膏、栓劑等生物利用度低，且易引發(fā)胃腸道損害、肝損害、腎損害及中樞神經(jīng)疾病，因此研發(fā)吲哚美辛新劑型，尋找增加其溶解性和生物利用度的包載材料，提高生物利用度，減少不良反應(yīng)成為人們關(guān)注的主要問題[4]。

中空介孔二氧化硅球（hollow mesoporous silica nanoparticles，HMSNs）作為一種新型載體，兼具空心和多孔微球的雙重優(yōu)點，其水熱穩(wěn)定性好、納米級孔道結(jié)構(gòu)完整、孔徑范圍可調(diào)、生物相容性好、比表面積大、負(fù)載量高[5-6]，特別是在催化[7-8]、藥物裝載和控制釋放[9-13]等方面具有良好的應(yīng)用前景。實驗采用中空介孔二氧化硅球來包載吲哚美辛以提高藥物溶解性，增加其生物利用度，并利用響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）中的Box-Behnken實驗設(shè)計（Box-Behnken design，BBD）對吲哚美辛負(fù)載的處方工藝進(jìn)行優(yōu)化研究[14-16]。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料與儀器

材料：吲哚美辛、過硫酸鉀，上海晶純實業(yè)有限公司；正硅酸乙酯，天津市博迪化工有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、無水乙醇，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；苯乙烯、4-乙烯基吡啶，北京百靈威科技有限公司，各試劑均為分析純，水為超純水，Milli-Q Academic。

儀器：Agilent Cary 60紫外分光光度計；Anke TGL-16G高速臺式離心機(jī)；KE-BEI型電熱恒溫水浴鍋；Mettler toledo XS105型電子天平；SX2-4-10馬弗爐；QT2060超聲清洗機(jī)；WH-7401-50B電動攪拌器；Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀；JEOL-100CX-II透射電子顯微鏡；Tecnai G2 F20場發(fā)射透射電子顯微鏡；V-Sorb4800比表面檢測儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 中空介孔二氧化硅球的合成

在三口燒瓶中，加入去離子水170mL、一定量的4-乙烯基吡啶與苯乙烯（體積比 1∶2），氮?dú)獗Ｗo(hù)下磁力攪拌30min后加入0.36g過硫酸鉀粉末（K2S2O8），80℃反應(yīng)24h，得到模板微球（PS-co-P4VP），離心水洗3次，存放于去離子水中。稱取一定量十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）于250mL燒瓶中，加入180mL去離子水、6.8mL正硅酸乙酯，超聲混合后加入10mL模板微球乳液，室溫下攪拌48h，80℃沉積2h，離心乙醇洗滌 3次，自然晾干，得到復(fù)合微球PS-co-P4VP@SiO2，馬弗爐中550℃煅燒6h，冷卻至室溫，得到中空介孔二氧化硅球HMSNs。

1.2.2 藥物負(fù)載實驗

利用溶劑浸漬法進(jìn)行中空介孔二氧化硅球的載藥實驗。稱取2.5mg HMSNs加入到5mL、12mg/mL的吲哚美辛乙醇溶液中（IMC/HMSNs質(zhì)量比為24∶1），超聲1.0h，密封、避光，放入37℃恒溫震蕩器中震蕩18h后，10000r/min離心5min，取上清，用紫外分光光度法 320nm處測定吲哚美辛的吸光度，從而計算HMSNs的包封率。根據(jù)式（1）測定吲哚美辛的包封率EE。

式中，EE為吲哚美辛的包封率；M總為加入的吲哚美辛的總質(zhì)量；M游離為離心后上清液中剩余的吲哚美辛的質(zhì)量。

1.2.3 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理方法

采用Design-Experts 8.0.6軟件中的BBD實驗進(jìn)行試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析。以IMC/HMSNs質(zhì)量比、載藥時間、超聲時間3個因子為自變量，分別以A、B、C表示，以吲哚美辛包封率為響應(yīng)值（Y），并根據(jù)現(xiàn)有實驗條件，在單因素考察的基礎(chǔ)上，確定了各影響因素合適的條件范圍，依次為16∶1～32∶1、12～24h、0.5～1.5h，按照方程x=(X–X0)/?X對自變量進(jìn)行編碼（x為自變量的編碼值，X為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，?X為自變量的變化步長），并以自變量的編碼值+1、0、–1分別代表自變量的高、中、低水平的編碼值，實驗自變量因素編碼及水平見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 中空介孔二氧化硅球的合成與表征

表1 Box-Behnken 實驗自變量因素編碼及水平

雖然許多研究者通過模板輔助的溶膠-凝膠過程成功合成了 HMSNs，但仍無法有效的避免不必要和不規(guī)則的聚集體形成。采用直接包覆法制備核殼結(jié)構(gòu)微球過程中會有大量前體或水解產(chǎn)物不能全部包覆在硬模板外面，而以沉淀的形式直接析出。

在本研究中，CTAB表面活性劑和PS-co-P4VP核殼微球作為雙重模板用來形成HMSNs的介孔和空心。選擇 PS-co-P4VP核殼微球作為模板劑，首先是因為包含PS核心和P4VP外殼的模板微球，外層為未成鍵的路易斯堿性P4VP鏈，可以作為催化劑啟動在模板上的 TEOS溶膠-凝膠過程。另一方面，PS-co-P4VP模板微球通過一級無皂乳液聚合可以很容易的合成，這為后續(xù)實驗的進(jìn)行提供了很大的便利和經(jīng)濟(jì)效益。

2.1.1 透射電鏡分析

從PS-co-P4VP、PS-co-P4VP@SiO2和SiO2透射電鏡圖可以看出，中空微球形態(tài)完整，殼層均勻，球形度良好，尺寸約為300nm，SiO2外殼為25nm。圖1中(d)為高倍透射電鏡下的微球，從中可以看見明暗相間的孔道。

圖1 不同樣品的透射電鏡圖

2.1.2 氮?dú)馕?解吸附

利用氮?dú)馕?解吸附方法測定微球的表面積，孔徑分布和孔容量等。HMSNs的吸附-脫附等溫曲線（圖2）屬于IV型等溫線，是介孔材料典型的吸附等溫線。同時，在0.6～1.0的相對氮?dú)鈮悍秶鷥?nèi)，脫附等溫線和吸附等溫線之間存在一個明顯的滯后環(huán)，這表明制備的HMSNs具有介孔結(jié)構(gòu)、相對較窄的孔徑分布。

圖2 氮?dú)馕?脫附等溫曲線和孔徑分布曲線

根據(jù)HMSNs的吸附-脫附等溫線計算相應(yīng)的孔徑分布，利用脫附支數(shù)據(jù)作圖得到介孔材料的孔徑分布圖。1.1nm處的小窄峰，結(jié)合吸附支數(shù)據(jù)考慮是由脫附支的TSE現(xiàn)象引起的假峰，而在2.0～5.0nm處顯示一個狹窄的孔隙大小分布，在 3.29nm處達(dá)到峰值，即孔道半徑為3.29nm，直徑6.58nm。BET結(jié)果顯示HMSNs比表面積為729.963m2/g，BJH計算得到孔體積為 1.084 cm3/g、平均孔徑為6.58nm。

2.1.3 傅里葉變換紅外光譜

觀察復(fù)合微球的紅外光譜圖（圖3中c線）發(fā)現(xiàn)，1475cm–1、1397cm–1處存在CTAB中—CH3反對稱變形振動和對稱變形振動；1600～1400cm–1范圍內(nèi)多處吸收峰為苯環(huán)的特征吸收峰，3026cm–1為吡啶環(huán)上C—H的伸縮振動，3064cm–1為苯環(huán)上環(huán)氫的伸縮振動，均為模板微球 PS-co-P4VP的特征吸收峰，紅外特征吸收峰的存在證明了 CTAB和PS-co-P4VP雙重模板功能。

經(jīng) 550℃煅燒，模板劑的特征吸收峰均消失，僅存SiO2的6個特征峰（圖3中d線）。1087cm–1處的Si—O—Si反對稱伸縮振動，805cm–1、464cm–1處的Si—O鍵對稱伸縮振動和彎曲振動，3447cm–1處的Si—OH反對稱伸縮振動，1632cm–1附近水的H—O—H彎曲振動，967cm–1處的Si—OH的彎曲振動吸收。

對比SiO2（圖3中d線）和PS-co-P4VP@SiO2（圖3中c線）在1087cm–1和967cm–1處的特征吸收峰發(fā)現(xiàn)，967cm–1處Si—OH中等強(qiáng)度吸收峰，說明仍有大量Si—OH未縮合成Si—O—Si鍵，硅骨架不牢固；煅燒后的 SiO2微球1087cm–1處吸收峰強(qiáng)度明顯加大，同時 967cm–1處吸收峰強(qiáng)度不斷減小，說明煅燒過程使部分Si—OH縮合成Si—O—Si鍵，增大了硅骨架強(qiáng)度。

圖3 傅里葉變換紅外光譜圖

2.2 HMSNs載藥實驗及BBD設(shè)計

綜合考慮，選擇IMC/HMSNs質(zhì)量比、載藥時間、超聲時間進(jìn)行單因素實驗，實驗得到的最優(yōu)條件為IMC/HMSNs質(zhì)量比24∶1，載藥時間18h，超聲時間1.0h，

2.2.1 實驗設(shè)計

該優(yōu)化實驗采用Design-Experts 8.0.6軟件中的中心組合實驗設(shè)計 BBD原理，確定響應(yīng)面的實驗方案。選取IMC/HMSNs質(zhì)量比A、載藥時間B、超聲時間C為自變量，以吲哚美辛的包封率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面分析實驗。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以實驗最優(yōu)值為中心值，設(shè)計了17個試驗，其中分析因子試驗12個，零點試驗5個，試驗方案及結(jié)果見表2。

采用Design-Experts 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，利用向后剔除法除去不顯著項。回歸方程為Y=53.05+1.63A+0.09B+7.21C+0.13AC+ 0.13BC–0.04A2–2.73C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，說明二次回歸方程線性相關(guān)性良好，方程與實驗結(jié)果匹配度高。調(diào)整相關(guān)系數(shù)則用來解釋回歸模型的充分性和適用性，根據(jù)自變量個數(shù)和樣本量的大小對相關(guān)系數(shù)進(jìn)行調(diào)整，Adj-R2=0.9993，說明模型預(yù)測值與實驗真實值之間具有很高的相關(guān)性。

回歸方程各項的方差分析結(jié)果見表 3。二次回歸模型的F值為1883.07，P<0.0001，遠(yuǎn)小于一般顯著性檢驗規(guī)定的α（0.05或0.01），說明該方程顯著性良好。而失擬項F=0.68，明顯小于F0.05[F0.05(3,2)=19.2]，模型擬合度良好；失擬項P=0.6637（>0.01），二次回歸模型失擬度不顯著，說明模型擬合效果好，試驗誤差小，不存在失擬因素，可用于HMSNs負(fù)載吲哚美辛的實驗條件優(yōu)化。通過P值分析，A、B、C、AC、BC、A2、C2項均達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），表明IMC/HMSNs質(zhì)量比、載藥時間、超聲時間以及IMC/HMSNs質(zhì)量比與超聲時間、載藥時間與超聲時間的交互作用對吲哚美辛包封率均有顯著影響。

表2 Box-Behnken 實驗設(shè)計結(jié)果

表3 回歸方程各項的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互作用與優(yōu)化

IMC/HMSNs質(zhì)量比與載藥時間相互作用顯著，但對包封率變化影響不大[圖4(a)]。IMC/HMSNs質(zhì)量比與超聲時間交互作用明顯，且坡度變化大，對包封率影響顯著[圖 4(b)]。載藥時間與超聲時間作用不顯著但對響應(yīng)值作用明顯[圖 4(c)]。綜合考慮各因子的線性、二次及交互作用3方面的影響，在試驗考察范圍內(nèi)，3個因素對包封率的影響依次為：IMC/HMSNs質(zhì)量比、載藥時間、超聲時間。由3D圖可以發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)值存在最大值，進(jìn)一步通過軟件分析計算，得到中空介孔二氧化硅球負(fù)載吲哚美辛的最佳實驗條件（表4）：IMC/HMSNs質(zhì)量比為22∶1，載藥時間23h，超聲時間1.4h，包封率達(dá)85.2%。在得到的最佳負(fù)載條件下，進(jìn)行3次驗證試驗（表5），包封率為84.1%，與理論預(yù)測值基本吻合，吻合度可達(dá)98.7%，證明了回歸模型的可行性。因此采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的HMSNs負(fù)載吲哚美辛的實驗參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實用價值。

圖4 IMC/HMSNs質(zhì)量比、載藥時間與超聲時間對包封率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖

表4 BBD優(yōu)化結(jié)果

表5 驗證實驗結(jié)果

3 結(jié) 論

利用響應(yīng)曲面法對HMSNs負(fù)載吲哚美辛的處方工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過實驗和計算分析，以 22∶1的質(zhì)量比，超聲1.4h，震蕩吸附23h時實驗條件達(dá)到最優(yōu)，預(yù)測包封率可達(dá)85.2%，明顯優(yōu)于現(xiàn)有的載體材料。在修正條件下對實驗結(jié)果進(jìn)行驗證實驗，得到中空介孔二氧化硅球包封率為84.1%。與理論預(yù)測值基本吻臺，說明該回歸模型是合理有效的，為納米材料負(fù)載藥物的研究提供了新的實驗依據(jù)。

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第一作者：王海媛（1991—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：晉興華，博士，講師。E-mail 15822534131@163.com。

中圖分類號：R 944.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-6613（2016）07-2145-06

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.07.030

收稿日期：2015-11-23；修改稿日期：2015-12-09。

Optimization of indomethacin loaded hollow mesoporous silica nanoparticles by response surface method

WANG Haiyuan，SUN Minghui，REN Zhihui，ZHOU Fang，JIN Xinghua
（School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Abstract：The hollow mesoporous silica nanoparticles(HMSN) were synthesized in neutral aqueous solution at room temperature.Following this method，well-defined HMSN was prepared with a 25nm shell and a 250nm hollow diameter.Nitrogen adsorption-desorption analysis，Trans-mission electron microscopy，F(xiàn)ourier Transform Infrared Spectrometer were applied to characterize the synthesized HMSNs.The morphology of the HMSN was spherical.The BET result shows that the specific surface area of HMSN was 730.0m2/g，the average pore size was 1.084cm3/g，and the pore diameter was 6.58 nm.Experiments were designed according to a three-level Box-Behnken design to optimize the Indomethacin loaded HMSNs.The result indicated that HMSNs exhibited an excellent drug loading capacity.The optimal formulation parameters were as follows：IMC/HMSNs mass ratios(A)，loading time(B) and ultrasonic time(C) levels were 22∶1，1.4h and 23h，respectively and the best encapsulation efficiency could be 85.2%.The observed responses were in good agreement with the predicted values of the mathematic models，so the Box-Behnken design is suitable for optimizing the formulation of indomethacin loaded hollow mesoporous silica nanoparticles.

Key words：HMSNs；indomethacin；Box-Behnken design；encapsulation efficiency