武愛蓮丁玉川焦曉燕**王勁松董二偉郭 珺王 浩（. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所 太原 030006； . 山西大學(xué)生物工程學(xué)院 太原 030006）

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玉米秸稈生物炭對褐土微生物功能多樣性及細(xì)菌群落的影響*

武愛蓮1丁玉川1焦曉燕1**王勁松1董二偉1郭 珺1王 浩2
（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所 太原 030006； 2. 山西大學(xué)生物工程學(xué)院 太原 030006）

摘 要生物炭施入土壤被認(rèn)為是一種有效的固碳減排措施， 可增加土壤有機(jī)碳及礦質(zhì)養(yǎng)分含量， 提高土壤的持水能力及保肥能力。為探明其施入土壤后對土壤微生物活性及多樣性的影響， 本文在盆栽試驗(yàn)條件下， 采用Biolog與高通量測序相結(jié)合的方法， 研究了CK（不施生物炭）和施用5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1、60 g·kg-1玉米秸稈生物炭對土壤微生物碳源利用能力（AWCD）、功能多樣性指數(shù)以及土壤細(xì)菌的豐度和多樣性的影響。結(jié)果表明， 隨著生物炭施用量的增加， 表征土壤微生物活性的AWCD值呈下降趨勢， 表現(xiàn)為： 5 g·kg-1處理≈ CK＞10 g·kg-1處理＞30 g·kg-1處理＞60 g·kg-1處理， 其中CK和5 g·kg-1處理間差異不顯著（P＞0.05）， 而10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理在整個培養(yǎng)期間的AWCD值顯著低于CK處理（P＜0.05）； 土壤微生物群落代謝功能多樣性指數(shù)（H′）、碳源利用豐富度指數(shù)（S）均隨生物炭施用量的增加而呈下降趨勢， 但均勻度指數(shù)（E）表現(xiàn)出相反趨勢， 5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1、60 g·kg-1各處理的H′較CK處理分別增加0.16%、-0.88%、-3.14%、-11.09%，S分別增加-2.82%、-11.27%、-18.31%、-47.89%， E分別增加1.14%、3.00%、3.73%和13.76%。主成分分析表明， 與CK處理比較， 5 g·kg-1處理對土壤微生物群落碳源利用方式?jīng)]有顯著影響（P＞0.05）， 而10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理對土壤微生物群落碳源利用方式影響顯著（P＜0.05）。隨著生物炭施用量的增加， 土壤細(xì)菌OTU數(shù)目及豐富度指數(shù)（Chao1）呈增加趨勢， 5 g·kg-1處理與CK處理差異不顯著， 而10 g·kg-1、30 g·kg-1、60 g·kg-1處理的OTU數(shù)目較CK處理分別增加1.09%、5.26%、24.42%， Chao1分別增加5.73%、10.21%、37.68%。土壤中施用生物炭后土壤細(xì)菌變形菌門（Proteobacteria）的豐度在CK處理和5 g·kg-1處理間差異不顯著（P＞0.05）， 而10 g·kg-1、30 g·kg-1、60 g·kg-1處理較CK處理分別增加32.3%、21.1%、16.7%， 擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度隨著生物炭施用量的增加各處理較CK處理分別減少22.1%、55.3%、66.8%、50.5%。生物炭施入土壤后降低了土壤可培養(yǎng)微生物的活性， 減少或改變了土壤微生物碳源利用的種類， 使土壤原有微生物群落組分發(fā)生改變， 生物炭也影響了土壤細(xì)菌各菌群在土壤中的豐度， 使其分布的均勻性降低。為了不影響微生物群落結(jié)構(gòu)和功能， 石灰性褐土上生物炭一次還田量不能超過5 g·kg-1（干土）。

關(guān)鍵詞生物炭 石灰性褐土 微生物活性 微生物多樣性 Biolog 高通量測序 細(xì)菌群落

我國作物秸稈資源豐富， 約占世界總量的25%左右［1］。2001—2010年， 中國平均年產(chǎn)糧食作物秸稈約5.1×108t， 而每年的焚燒量約占作物秸稈總量的21.6%， 排放的CO、CO2及總碳量分別為1.15×107t、1.57×108t 和4.77×107t。這不僅造成了資源的浪費(fèi)，也極大地污染了環(huán)境［2］。生物炭（或生物質(zhì)炭， biocharcoal）是近年來較受關(guān)注的研究熱點(diǎn)， 指生物有機(jī)材料在低氧或缺氧環(huán)境中經(jīng)高溫裂解后形成的產(chǎn)物［3-4］。將作物秸稈廢棄物高溫裂解生產(chǎn)生物炭施入土壤中可實(shí)現(xiàn)碳的封存［5］， 減少CO2的排放［6］。

生物炭含有作物生長所必需的大量和中微量元素， 且其孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)， 比表面積巨大， 具有很強(qiáng)的吸附能力［7］， 目前已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。有關(guān)生物炭對土壤理化特性的影響已做了大量研究，結(jié)果表明生物炭可增加土壤有機(jī)碳及礦質(zhì)養(yǎng)分含量［8-12］， 提高土壤的持水能力及保肥能力［13-15］， 從而提高肥料養(yǎng)分的利用效率［16-17］。但在土壤生態(tài)系統(tǒng)中， 幾乎所有的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化過程都離不開土壤微生物的作用， 它們直接或間接參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、無機(jī)營養(yǎng)的循環(huán)、改善土壤結(jié)構(gòu)等［18-19］。生物炭的多孔結(jié)構(gòu)及對水肥的吸附作用使其為土壤微生物生長與繁殖提供了良好的棲息環(huán)境［20］， 施入生物炭后土壤細(xì)菌、真菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化，富含生物炭的亞馬遜黑土的細(xì)菌多樣性比未作處理的土壤增加25%， 而古菌和真菌的多樣性下降［21-22］。也有研究表明， 施入生物炭后森林土壤的細(xì)菌多樣性下降［22］， 生物炭對微生物的群落分布具有一定的控制作用［23］。目前有關(guān)生物炭對土壤微生物群落多樣性影響的報(bào)導(dǎo)多集中在酸性土壤上［24］， 而在石灰性褐土上生物炭對土壤微生物群落多樣性的影響卻鮮見報(bào)導(dǎo)。本文以秸稈生物炭為研究對象， 采用Biolog與高通量測序相結(jié)合的方法研究在石灰性褐土上施用生物炭后土壤微生物群落的變化特征，旨在明確秸稈生物炭對石灰性土壤微生物群落的影響， 為生物炭在石灰性褐土上的合理使用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用土壤采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗(yàn)基地0～20 cm耕層， 土壤類型為石灰性褐土， 土壤質(zhì)地為砂質(zhì)黏壤土（＜0.002 mm黏粒19.8%， 0.02～0.002 mm粉粒22.3%， 2～0.02 mm砂粒57.9%）。供試土樣風(fēng)干后過2 mm篩備用。供試土壤化學(xué)性質(zhì)為： 有機(jī)碳3.71 g·kg-1， 全氮0.48 g·kg-1， 有效磷3.08 mg·kg-1，速效鉀83.82 mg·kg-1， CEC 13.14 cmol·kg-1， pH 8.3，EC 0.16 mS·cm-1。供試生物炭由山西省工霄商社生產(chǎn)， 由玉米秸稈在300～500 ℃微氧環(huán)境下碳化而成，生物炭過2 mm篩備用。生物炭基本化學(xué)性質(zhì)： 全碳369.87 g·kg-1， 全氮6.56 g·kg-1， CEC 59.2 cmol·kg-1，pH 10.22， EC 10.97 mS·cm-1。供試作物為‘晉雜34號’高粱。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用盆栽方法， 共設(shè)5個生物炭施用水平，即生物炭施用量分別為0（CK）、5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1、60 g·kg-1（分別相當(dāng)于0 t·hm-2、13.5 t·hm-2、27 t·hm-2、81 t·hm-2和162 t·hm-2）， 每個處理3次重復(fù)。N、P2O5和K2O的添加量分別為0.2 g·kg-1、0.15 g·kg-1和0.15 g·kg-1， 裝盆前與土壤充分混勻， 再與生物炭充分混勻后裝入高18 cm、寬21 cm的試驗(yàn)用塑料桶；每桶裝土4 kg， 各桶補(bǔ)充等量水分使土壤熟化3周。

試驗(yàn)于日光溫室內(nèi)進(jìn)行， 2014年4月15日播種，7月2日收獲。試驗(yàn)結(jié)束時采集土壤樣品， 采樣時輕輕去掉表層2 cm的土壤， 采集2 cm以下土壤鮮樣并立即放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冰箱保存待測。

1.3 Biolog分析

稱取10.0 g新鮮土樣置于裝有90 mL已滅菌生理鹽水（0.85% NaCl）的三角瓶內(nèi)， 在轉(zhuǎn)速200 r·min-1下振蕩30 min， 靜置10 min后用生理鹽水（0.85% NaCl）稀釋到10-3， 將稀釋好的土壤懸濁液150 μL接種到Biolog-Eco板（BIOLOG， Hayward， USA）的每個微孔中， 接種后的Eco板在25 ℃下培養(yǎng)。每隔24 h 用Biolog Reader儀（BIOLOG， Hayward， USA）測定波長590 nm和750 nm的吸光值。

采用Glassen等［25］的方法分析Eco-MicroPlate的單孔平均吸光度， 即將單孔在590 nm和750 nm的吸光值分別減去各自對照孔的吸光值， 再用每個對應(yīng)孔590 nm的值減去750 nm的值為單孔實(shí)際顏色反應(yīng)的吸光值。利用該數(shù)據(jù)， 采用Garland和Mills［26］的方法計(jì)算單孔平均吸光度值。

式中： Ai為各單孔實(shí)際吸光值， A0為對照孔的吸光值， Ai-A0為負(fù)值時則歸為0， n為碳源種類（Eco-MicroPlate為31）， AWCD值為3次重復(fù)的平均值。

用Shannon-Weinner豐富度指數(shù)、Shannon-Weinner均勻度指數(shù)、碳源利用豐富度指數(shù)表征土壤微生物群落功能代謝多樣性［27］。采用Eco-MicroPlate培養(yǎng)96 h的吸光值計(jì)算土壤微生物群落功能代謝多樣性指數(shù)， 計(jì)算公式別為：）

式中： Pi=（Ai-A0）/∑（Ai-A0）， Ai、A0含義同上 式， Pi為有碳源的孔與對照孔的吸光值之差與整個微板總差的比值。式中： H′為Shannon-Weinner多樣性指數(shù)， S為有顏色變化的孔數(shù)量。

碳源利用豐富度指數(shù)即顏色變化的孔數(shù)， 吸光值小于0.25視為顏色沒有變化。

1.4 土壤細(xì)菌高通量測序

采取OMEGA（D5625-01）試劑盒方法提取土壤微生物基因組總DNA， 操作步驟參照試驗(yàn)盒說明書。提取物保存于-20 ℃冰箱備用。

利用通用引物（341F-805R）擴(kuò)增微生物16SrDNA基因的V3-V4區(qū)域， 引物組成： 341F： CCTACGGGN GGCWGCAG； 805R： GACTACHVGGGTATCTAATCC。PCR反應(yīng)體系如下： 5 μL的10×PCR Buffer， 0.5 μL 的dNTP（10 mmol·L-1each）， 10 ng的 Genomic DNA，0.5 μL的Bar-PCR primer F（50 μmol·L-1）， 0.5μL的Primer R（50 μmol·L-1）， 0.5 μL的Plantium Taq

（5 U·μL-1） ， 加無菌水使反應(yīng)總體系為50 μL。PCR反應(yīng)條件如下： 94 ℃ 3 min， 5×（94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s）， 20×（94 ℃ 20 s， 55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s），72℃ 5 min 。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳并對DNA進(jìn)行切膠回收， 利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量， 等量混合后測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

高通量數(shù)據(jù)分析主要步驟為： 1）根據(jù)barcode序列將各樣本區(qū)分開并去除barcode； 2）去除短片段序列（序列長度小于200 bp）及低質(zhì)量序列（平均質(zhì)量值小于20）； 3）利用Uclust軟件根據(jù)序列之間的相似度（97%）將16SrDNA基因序列歸為不同的操作分類單元（OTU）； 4）從每個OTU序列中選取代表性序列， 采用RDP classifier軟件（分類閾值大于80%）對序列進(jìn)行分類鑒定， 得到細(xì)菌的分類學(xué)信息。

利用mothur軟件計(jì)算土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)，其中， Chao1豐富度指數(shù)計(jì)算公式為：式中： Sobs為檢測到的所有OTU的總數(shù)， N1為只有一條序列的OTU數(shù)目， N2為只有兩條序列的OTU數(shù)目。

Shannon多樣性指數(shù)計(jì)算公式為：

式中： ni為各分類單元中包含的序列數(shù)， N為所有數(shù)列之和。

采用SPSS 18.0進(jìn)行方差（Duncan檢驗(yàn)法）和主成分分析， Microsoft Excel 2007軟件作圖。差異顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同用量生物炭處理土壤微生物利用碳源的動態(tài)特征

平均顏色變化率（AWCD）表示可培養(yǎng)微生物對不同底物（碳源）的利用能力， 在一定程度上反映了土壤微生物的生理代謝活性。通過對 31種碳源AWCD值的動態(tài)監(jiān)測（每隔 24 h）可知： 隨著培養(yǎng)時間的延長， 各處理AWCD值均呈增長趨勢。培養(yǎng)前24 h， 各處理AWCD值均很低， 24 h后迅速升高， 說明碳源逐漸被利用， 微生物代謝活性增強(qiáng)。CK、5 g·kg-1、10 g·kg-1處理在培養(yǎng)72 h前AWCD值差異不顯著（P＞0.05）， 72 h后 10 g·kg-1處理顯著低于CK和5 g·kg-1處理（P＜0.05）； 30 g·kg-1和60 g·kg-1處理的AWCD值在整個培養(yǎng)期間均顯著低于其他處理（P＜0.05）， 說明高量生物炭的施入影響了微生物利用碳源的能力， 其代謝活性降低。培養(yǎng)結(jié)束時，各處理的AWCD值表現(xiàn)為： 5 g·kg-1≈CK＞10 g·kg-1＞30 g·kg-1＞60 g·kg-1， 5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理較CK處理分別增加1.57%、-9.67%、-27.84%和-53.73%（圖1）。

圖1 不同用量生物炭處理石灰性褐土土壤微生物利用不同種類碳源的平均顏色變化率（AWCD）Fig. 1 Average well color development （AWCD） for different carbon sources utilized by calcareous cinnamon soil microbial under different application rates of biochar

2.2 不同用量生物炭處理土壤可培養(yǎng)微生物多樣性指數(shù)

從表 1可以看出， 隨生物炭施用量增加土壤微生物代謝功能的多樣性指數(shù)、碳源利用豐富度指數(shù)均呈減小趨勢， 而均勻度指數(shù)則呈增加趨勢。5 g·kg-1生物炭處理的多樣性指數(shù)最高， CK和5 g·kg-1處理間差異不顯著（P＞0.05）， 其余 3個處理間差異顯著，且都顯著低于5 g·kg-1和CK處理（P＜0.05）， 5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理較CK處理分別增加0.16%、-0.88%、-3.14%和-11.09%； 均勻度指數(shù)隨著生物炭施用量的增加而增加， 60 g·kg-1處理的均勻度指數(shù)顯著高于CK、5 g·kg-1、10 g·kg-1和30 g·kg-1處理， 5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理較 CK處理分別增加1.14%、3.00%、3.73%和13.76%。碳源利用豐富度指數(shù)隨著生物炭用量的增加而降低， 但CK、5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1處理間差異不顯著（P＞0.05）， 而 60 g·kg-1處理顯著低于以上處理（P＜0.05）。

表1 不同用量生物炭處理石灰性褐土土壤微生物代謝功能多樣性指數(shù)Table 1 Metabolic functional diversity index of microbial community of cinnamon soil under different application rates of biochar

2.3 不同用量生物炭處理土壤微生物主成分分析

主成分分析（principal component analysis， PCA）是采取降維的方法將多個變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合變量的方法。Garland［28］認(rèn)為各處理在空間位置上的差異與聚集在坐標(biāo)軸上的碳源是相關(guān)聯(lián)的。根據(jù)96 h的AWCD進(jìn)行碳源利用主成分分析， 從31個變量中提取4個主成分， 其累積貢獻(xiàn)率達(dá)97.5%。第1主成分（PC1）貢獻(xiàn)率為 54.06%， 第 2主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為 24.40%， 第 3、4主成分貢獻(xiàn)率分別為11.74%和7.55%。對前2個主成分進(jìn)行分析， 將不同處理在2個主成分上的得分值以PC1、PC2為橫縱坐標(biāo)作圖（圖2）。從圖中可以看出， 在PC1軸上， 各處理被分為2類， CK、5 g·kg-1和10 g·kg-1處理分布在PC1軸的正方向， 且CK和5 g·kg-1處理聚在起，說明其土壤微生物群落具有相似的碳源利用模式，其代謝功能相似； 而30 g·kg-1和60 g·kg-1處理分布于PC1軸的負(fù)方向上。在PC2軸上， 各處理被分為 2類， CK、5 g·kg-1和30 g·kg-1處理位于PC2軸的正方向， 10 g·kg-1和60 g·kg-1處理位于PC2軸的負(fù)方向。

圖2　不同用量生物炭處理石灰性褐土土壤微生物碳源利用的主成分分析Fig. 2　Principal component analysis of microbial community utilizing carbon sources of cinnamon soil under different application rates of biochar

2.4 高通量測序分析不同用量生物炭處理土壤細(xì)菌多樣性

從表2可以看出， OTU數(shù)目隨著生物炭施用量的增加基本呈增加趨勢， CK、5 g·kg-1和10 g·kg-1處理間差異不顯著（P＞0.05）， 30 g·kg-1和60 g·kg-1處理顯著大于以上處理（P＜0.05）。5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理OTU數(shù)目較CK處理分別增加-2.57%、1.09%、5.26%和24.42%， 說明生物炭施用量大于5 g·kg-1時可以增加土壤細(xì)菌OTU的數(shù)目。Chao1指數(shù)用來估計(jì)群落中物種的總數(shù)， 隨著生物炭施用量的增加， 該指數(shù)呈增加趨勢， 整體表現(xiàn)為60 g·kg-1＞30 g·kg-1＞10 g·kg-1＞CK＞5 g·kg-1處理， CK 和5 g·kg-1處理間差異不顯著（P＞0.05）， 其余各處理間差異顯著， 且顯著大于CK和5 g·kg-1處理（P＜0.05），各處理較CK處理分別增加-0.16%、5.73%、10.21% 和37.68%。Shannon指數(shù)用來描述群落中個體出現(xiàn)的不確定性， 該指數(shù)越大， 群落多樣性越高?？梢钥闯?， 60 g·kg-1生物炭用量下該指數(shù)最高， 與5 g·kg-1、 10 g·kg-1和30 g·kg-1處理間差異顯著（P＜0.05）， 但與CK處理差異不顯著（P＞0.05）， 5 g·kg-1、10 g·kg-1和30 g·kg-1處理間差異不顯著（P＞0.05）。

表2　不同用量生物炭處理石灰性褐土土壤細(xì)菌基因的α多樣性指數(shù)Table 2　α-diversity index of soil bacterial gene of cinnamon soil under different application rates of biochar

圖3　不同用量生物炭處理石灰性褐土土壤細(xì)菌在門水平的相對豐度Fig. 3　Bacterial community structure at phylum level in calcareous cinnamon soil under different application rates of biochar

2.5 高通量測序分析不同用量生物炭處理土壤細(xì)菌在門水平的相對豐度

圖3表明， 石灰性褐土的主要細(xì)菌菌群包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）以及分類地位不明確和一些稀有的細(xì)菌菌群。其中變形菌門是土壤中最為優(yōu)勢的菌群， 占總reads數(shù)的39.68%， 生物炭施用量為5 g·kg-1時土壤中該類群細(xì)菌的豐度與CK處理差異不顯著， 生物炭施用量大于5 g·kg-1時， 土壤中變形菌門的豐度顯著增加， 10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理分別較CK處理增加32.3%、21.1%和16.7%。擬桿菌門是石灰性土壤中的第2大菌群， 其豐度在CK處理中為13.16%， 隨著生物炭施用量的提高， 該菌群的豐度顯著降低， 5 g·kg-1、10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理分別較CK處理分別減少22.1%、55.3%、66.8%和50.5%。其他各類細(xì)菌菌群的豐度在不同處理間也有相應(yīng)變化（圖4）， 可見土壤中施用生物炭會影響土壤中各細(xì)菌菌群的豐度。同時熱圖也對各樣本進(jìn)行了聚類分析， CK處理和5 g·kg-1處理最先聚在一起，30 g·kg-1和60 g·kg-1處理聚在一起后再和10 g·kg-1處理聚在一起， 說明CK和5 g·kg-1處理的細(xì)菌菌群相似， 而10 g·kg-1、30 g·kg-1和60 g·kg-1處理的細(xì)菌菌群相似。

圖4　不同用量生物炭處理石灰性褐土土壤細(xì)菌門水平菌群熱圖Fig. 4　Heatmap of bacterial community in cinnamon soil at phylum level under different application rates of biochar

3　討論與結(jié)論

評價土壤微生物群落的方法主要有以生化技術(shù)為基礎(chǔ)的群落水平生理學(xué)指紋（Biolog方法）、生物標(biāo)記法（PLFA）， 以及以現(xiàn)代分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的DNA長度多態(tài)性（T-RFLP）和DNA成分多態(tài)性（DGGE）及高通量測序技術(shù)。Biolog微平板法以微生物對不同碳源的利用差異反映土壤微生物群落代謝能力的不同， 碳源平均顏色變化率（AWCD）及土壤微生物代謝功能多樣性指數(shù)在一定程度上可以反映土壤微生物的活性及多樣性［29］。本研究結(jié)果表明， 隨著生物炭施用量的增加， AWCD值、土壤微生物代謝功能多樣性指數(shù)、碳源利用豐富度指數(shù)均呈降低的趨勢， 總體表現(xiàn)為： 5 g·kg-1≈CK＞10 g·kg-1＞30 g·kg-1＞60 g·kg-1處理， CK和5 g·kg-1處理間差異不顯著， 而10 g·kg-1、 30 g·kg-1和60 g·kg-1處理在整個培養(yǎng)期間的AWCD值和多樣性指數(shù)顯著低于CK處理； 均勻度指數(shù)隨著生物炭施用量的增加而增加， 這是因?yàn)榇罅可锾康氖┤胩岣吡送寥繡/N， 而土壤微生物群落酶鏈反應(yīng)速度和最終能達(dá)到的程度與群落內(nèi)能利用單一碳源（底物）微生物的數(shù)目和種類相關(guān)［28］， 在沒有氮肥投入下生物炭的施入一方面可能是使土壤微生物的數(shù)量降低， 另一方面可能是生物炭抑制某些種類微生物的生長而使其種類減少， 說明生物炭的施入改變了土壤原有微生物群落組分， 抑制了原有土壤微生物種類的生長， 增加了適應(yīng)環(huán)境的一些特異微生物的種群。Dempster等［30］的研究結(jié)果表明， 高用量生物炭處理較對照顯著降低了微生物量碳。烏英嗄［31］、Marluthi等［32］的研究結(jié)果也表明， 土壤中施入生物炭改變了土壤微生物利用碳源的種類， 這與本文研究結(jié)果一致。但也有研究表明， 白漿土、潮土、灰漠土和棕壤土上施用玉米芯生物炭， 試驗(yàn)前期未添加生物炭處理的AWCD以及多樣性指標(biāo)均高于添加生物炭處理， 而試驗(yàn)后期生物炭施用量為40 t·hm-2（相當(dāng)于本試驗(yàn)的16 g·kg-1用量）處理的AWCD值以及多樣性指數(shù)最高［33］， 這一方面與試驗(yàn)所用生物炭的原料及生產(chǎn)工藝不同從而使生物炭的理化性質(zhì)不同有關(guān)， 主要體現(xiàn)在全碳含量及生物炭的pH值上，也與土壤的質(zhì)地和酸堿度有關(guān)， 另一方面也與作物種類不同有關(guān)， 作物的根系分泌物對土壤微生物多樣性產(chǎn)生了影響［34］。

鑒于Biolog微平板法僅檢測可培養(yǎng)的微生物，不能全面反映土壤微生物的代謝多樣性， 因此本文結(jié)合高通量測序的方法， 從基因多樣性的水平上研究生物炭對土壤細(xì)菌多樣性的影響。變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、疣微菌門、厚壁菌門和綠彎菌門是石灰性褐土的主要細(xì)菌菌群， 施用生物炭能顯著增加土壤中變形菌門的豐度， 但卻降低了擬桿菌門的豐度， 可見生物炭影響了土壤中各細(xì)菌菌群的分布。5 g·kg-1和CK處理具有相似的細(xì)菌菌群， 石灰性褐土中生物炭施用量為5 g·kg-1時， 不會影響土壤細(xì)菌的多樣性。與Biolog方法不一致的是隨著生物炭施用量的增加， 土壤細(xì)菌的OTU數(shù)目及豐富度指數(shù)呈增加的趨勢， 而多樣性指數(shù)在CK和60 g·kg-1處理較高， 其余處理顯著低于以上兩處理， 這主要是因?yàn)闆Q定該指數(shù)大小的因素一是種群數(shù)目， 即豐富度； 二是種群中個體分布的均勻性。因各處理的豐富度隨生物炭用量的增加而增加， 所以導(dǎo)致5 g·kg-1、10 g·kg-1和30 g·kg-1處理多樣性較低的原因可能是其細(xì)菌菌群分布的不均勻性， 菌群豐度分布圖（圖4）也說明了這一點(diǎn)。兩種方法進(jìn)行多樣性分析的差異一方面可能是由于各自方法的側(cè)重點(diǎn)有所不同， 另一方面是僅對土壤細(xì)菌進(jìn)行了高通量測序分析， 而未涉及其他種類的微生物， 這有待于進(jìn)一步深入研究。

Biolog以及高通量測序方法均表明， 生物炭施入土壤后使土壤原有微生物群落組分發(fā)生改變， 影響了土壤細(xì)菌各菌群在土壤中的豐度， 使其分布的均勻性降低。為了不影響微生物群落結(jié)構(gòu)和功能， 石灰性褐土上秸稈生物炭每次施用量不能超過5 g·kg-1（干土）。

參考文獻(xiàn)References

［1］ Lal R. World crop residues production and implications of its use as a biofuel［J］. Environment International， 2005， 31（4）：575-584

［2］ 李飛躍， 汪建飛. 中國糧食作物秸稈焚燒排碳量及轉(zhuǎn)化生物炭固碳量的估算［J］. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)， 2013， 29（14）： 1-7 Li F Y， Wang J F. Estimation of carbon emission from burning and carbon sequestration from biochar producing using crop straw in China［J］. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering， 2013， 29（14）： 1-7

［3］ Lehmann J， Joseph S. Biochar for Environmental Management： Science and Technology［M］. London： Earthscan， 2009

［4］ Shrestha G， Traina S J， Swanston C W. Blank carbon’s properties and role in the environment： A comprehensive review［J］. Sustainability， 2010， 2（1）： 294-320

［5］ Lenton T M. The potential for land-based biological CO2removal to lower future atmospheric CO2concentration［J］. Carbon Management， 2010， 1（1）： 145-160

［6］ Okimori Y， Ogawa M， Takahashi F. Potential of CO2emission reductions by carbonizing biomass waste from industrial tree plantation in south Sumatra Indonesia［J］. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change， 2003， 8（3）： 261-280

［7］ 劉玉學(xué)， 劉微， 吳偉祥， 等. 土壤生物質(zhì)炭環(huán)境行為與環(huán)境效應(yīng)［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2009， 20（4）： 977-982 Liu Y X， Liu W， Wu W X， et al. Environmental behavior and effect of biomass-derived black carbon in soil： A review［J］. Chinese Journal of Applied Ecology， 2009， 20（4）： 977-982

［8］ Van Zwieten L， Kimber S， Morris S， et al. Effects of biochar from slow pyrolysis of papermill waste on agronomic performance and soil fertility［J］. Plant and Soil， 2010， 327（1/2）：235-246

［9］ 陳紅霞， 杜章留， 郭偉， 等. 施用生物炭對華北平原農(nóng)田土壤容重、陽離子交換量和顆粒有機(jī)質(zhì)含量的影響［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2011， 22（11）： 2930-2934 Chen H X， Du Z L， Guo W， et al. Effects of biochar amendment on cropland soil bulk density， cation exchange capacity，and particulate organic matter content in the North China Plain［J］. Chinese Journal of Applied Ecology， 2011， 22（11）：2930-2934

［10］ 高海英， 何緒生， 陳心想， 等. 生物炭及炭基硝酸銨肥料對土壤化學(xué)性質(zhì)及作物產(chǎn)量的影響［J］. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2012， 31（10）： 1948-1955 Gao H Y， He X S， Chen X X， et al. Effect of biochar and biochar-based ammonium nitrate fertilizers on soil chemical properties and crop yield［J］. Journal of Agro-Environment Science， 2012， 31（10）： 1948-1955

［11］ Gaskin J W， Steiner C， Harris K， et al. Effect of low- temperature pyrolysis conditions on biochar for agricultural use［J］. Transactions of the ASABE， 2008， 51（6）： 2061-2069

［12］ 張祥， 王典， 姜存?zhèn)}， 等. 生物炭對我國南方紅壤和黃棕壤理化性質(zhì)的影響［J］. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 21（8）：979-984 Zhang X， Wang D， Jiang C C， et al. Effect of biochar on physicochemical properties of red and yellow brown soils in the South China Region［J］. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2013， 21（8）： 979-984

［13］ 王浩， 焦曉燕， 王勁松， 等. 生物炭對土壤水分特征及水脅迫條件下高粱生長的影響［J］. 水土保持學(xué)報(bào)， 2015， 29（2）：253-257Wang H， Jiao X Y， Wang J S， et al. Effects of biochar on water characteristics of soil and Sorghum growth under conditions of soil water stress［J］. Journal of Soil and Water Conservation，2015， 29（2）： 253-257

［14］ Glaser B， Lehmann J， Zech W. Ameliorating physical and chemical properties of highly weathered soils in the tropics with charcoal — A review［J］. Biology and Fertility of Soils，2002， 35（4）： 219-230

［15］ 王浩， 焦曉燕， 王勁松， 等. 不同氮肥水平下生物炭對高粱苗期生長及有關(guān)生理特性的影響［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2014，29（6）： 195-201 Wang H， Jiao X Y， Wang J S， et al. Effect of biochar on seedling growth and related physiological characteristics of sorghum under different levels of nitrogen fertilizer［J］. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2014， 29（6）： 195-201

［16］ 高德才， 張蕾， 劉強(qiáng)， 等. 生物黑炭對旱地土壤磷動態(tài)變化的影響［J］. 水土保持學(xué)報(bào)， 2013， 27（6）： 256-260 Gao D C， Zhang L， Liu Q， et al. Effects of biochar on dynamics change of phosphorus in dryland soil［J］. Journal of Soil and Water Conservation， 2013， 27（6）： 256-260

［17］ 高德才， 張蕾， 劉強(qiáng)， 等. 旱地土壤施用生物炭減少土壤氮損失及提高氮素利用率［J］. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)， 2014， 30（6）：54-61 Gao D C， Zhang L， Liu Q， et al. Application of biochar in dryland soil decreasing loss of nitrogen and improving nitrogen using rate［J］. Transactions of the CSAE， 2014， 30（6）：54-61

［18］ Kirk J L， Beaudette L A， Hart M， et al. Methods of studying soil microbial diversity［J］. Journal of Microbiological Methods， 2004， 58（2）： 169-188

［19］ Steenwerth K L， Jackson L E， Calderón F J， et al. Soil microbial community composition and land use history in cultivated and grassland ecosystems of coastal California［J］. Soil Biology and Biochemistry， 2002， 34（11）： 1599-1611

［20］ Pietik?inen J， Kiikkil? O， Fritze H. Charcoal as a habitat for microbes and its effect on the microbial community of the underlying humus［J］. Oikos， 2000， 89（2）： 231-242

［21］ O'Neill B， Grossman J， Tsai M T， et al. Bacterial community composition in Brazilian anthrosols and adjacent soils characterized using culturing and molecular identification［J］. Microbial Ecology， 2009， 58（1）： 23-35

［22］ Grossman J M， O'Neill B E， Tsai S M， et al. Amazonian anthrosols support similar microbial communities that differ distinctly from those extant in adjacent， unmodified soils of the same mineralogy［J］. Microbial Ecology， 2010， 60（1）：192-205

［23］ Khodadad C L M， Zimmerman A R， Green S J， et al. Taxaspecific changes in soil microbial community composition induced by pyrogenic carbon amendments［J］. Soil Biology and Biochemistry， 2011， 43（2）： 385-392

［24］ 何莉莉， 楊慧敏， 鐘哲科， 等. 生物炭對農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性影響的PCR-DGGE分析［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2014， 34（15）：4288-4294 He L L， Yang H M， Zhong Z K， et al. PCR-DGGE analysis of soil bacterium community diversity in farmland influenced by biochar［J］. Acta Ecologica Sinica， 2014， 34（15）： 4288-4294

［25］ Glassen A T， Boyle S I， Haskins K E， et al. Community-level physiological profiles of bacteria and fungi： Plate type and incubation temperature influences on contrasting soils［J］. FEMS Microbiology Ecology， 2003， 44（3）： 319-328

［26］ Garland J L， Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1991， 57（8）： 2351-2359

［27］ Schutter M E， Dick R P. Shifts in substrate utilization potential and structure of soil microbial communities in response to carbon substrates［J］. Soil Biology and Biochemistry， 2001，33（11）： 1481-1491

［28］ Garland J L. Analysis and interpretation of community-level physiological profiles in microbial ecology［J］. FEMS Microbiology Ecology， 1997， 24（4）： 289-300

［29］ 李玉潔， 李剛， 宋曉龍， 等. 休牧對貝加爾針茅草原土壤微生物群落功能多樣性的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 22（6）：21-30 Li Y J， Li G， Song X L， et al. Effect of rest-grazing on soil microbial community functional diversity in Stipa baicalensis steppe［J］. Acta Prataculturae Sinica， 2013， 22（6）： 21-30

［30］ Dempster D N， Gleeson D B， Solaiman Z M， et al. Decreased soil microbial biomass and nitrogen mineralisation with Eucalyptus biochar addition to a coarse textured soil［J］. Plant and Soil， 2012， 354（1/2）： 311-324

［31］ 烏英嗄. 生物質(zhì)炭施用對華北潮土土壤理化性質(zhì)及微生物多樣性的影響［D］. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古師范大學(xué)， 2014 Wu Y S. Effects of biochar application on bacterial diversity and physical-chemical properties in fluvor-aquic soil of North China［D］. Huhhot： Inner Mongol Normal University， 2014

［32］ Marluthi S， Ralebitso-Senior T K， Rahman P K S M， et al. Biochar： Impact on Soil Microbial Ecology［C］//Second Annual Conference： Advancing the Science and Evaluating Biochar Systems. Rothamsted： Poster Presented al UK Biochar Reacher Centre， 2010

［33］ 韓光明. 生物炭對不同類型土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性的影響［D］. 沈陽： 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013 Han G M. Effect of biochar on soil physicochemical property and microbial diversity in different soil types［D］. Shenyang：Shenyang Agricultural University， 2013

［34］ 吳鳳芝， 李敏， 曹鵬， 等. 小麥根系分泌物對黃瓜生長及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2014， 25（10）：2861-2867 Wu F Z， Li M， Cao P， et al. Effects of wheat root exudates on cucumber growth and soil fungal community structure［J］. Chinese Journal of Applied Ecology， 2014， 25（10）： 2861-2867

* 山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311009-2）和山西省國際科技合作項(xiàng)目（2014081040）資助

** 通訊作者： 焦曉燕， 主要從事土壤養(yǎng)分循環(huán)利用等領(lǐng)域研究。E-mail： xiaoyan_jiao@126.com武愛蓮， 主要從事土壤微生態(tài)與植物營養(yǎng)研究。E-mail： wuping.20088@163.com收稿日期： 2015-11-12 接受日期： 2016-01-08

* This study was supported by the Agricultural Science and Technology Research Project of Shanxi Province （20130311009-2） and the Interna

tional Science and Technology Cooperation Project of Shanxi Province （2014081040）.

** Corresponding author， E-mail： Xiaoyan_jiao@126.com

Received Nov. 12， 2015； accepted Jan. 8， 2016

中圖分類號：S154.36

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-3990（2016）06-0736-08

DOI：10.13930/j.cnki.cjea.151212

Effect of corn-stalk biochar on soil microbial functional diversity and bacterial community in cinnamon soils*

WU Ailian1， DING Yuchuan1， JIAO Xiaoyan1**， WANG Jinsong1， DONG Erwei1， GUO Jun1， WANG Hao2
（1. Institute of Agricultural Environment & Resources， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan 030006， China；2. College of Biological Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

AbstractBiochar application was considered as an effective way of carbon sequestration of soil. It has been known to im-prove both soil water and nutrient holding capacity. As a key indicator of soil fertility， microorganism plays an important role in soil ecosystem. It was necessary to understand the influence of biochar application on microbial community and functional diversity in calcareous cinnamon soils for rational utilization of biochar in cinnamon soils. A pot experiment with five biochar application levels ［0 g·kg-1（as control）， 5 g·kg-1， 10 g·kg-1， 30 g·kg-1and 60 g·kg-1］ was conducted to investigate the response of soil microbial activity and diversity， using Biolog analysis and high-throughput sequestration （HiSeq). The results showed that the average rate of color change （AWCD） decreased with increasing biochar application level， and the AWCD values were in the order of 5 g·kg-1≈ control ＞ 10 g·kg-1＞ 30 g·kg-1＞ 60 g·kg-1treatments. There was no significant difference between control and 5 g·kg-1treatments in terms of AWCD. The soil microbial community diversity index （H′） and richness index （S）also decreased， but evenness index （E） increased with increasing biochar application level. Compared with the control， biochar application rates at 5 g·kg-1， 10 g·kg-1， 30 g·kg-1and 60 g·kg-1increased H′ by 0.16%， -0.88%， -3.14% and -11.09%； increased S by -2.82%， -11.27%， -18.31% and -47.89%； and increased E by 1.14%， 3.00%， 3.73% and 13.76%； respectively. Principal component analysis showed that carbon substrate utilization of soil microbial community was significantly affected by 10 g·kg-1， 30 g·kg-1and 60 g·kg-1biochar application. HiSeq analysis showed that soil bacterial OTU enhanced significantly by 1.09%， 5.26% and 24.42%， respectively， in 10 g·kg-1， 30 g·kg-1and 60 g·kg-1biochar treatments， meanwhile， the richness index （Chao1） was increased by 5.73%， 10.21% and 37.68%， respectively， compared with that of control. Biochar enhanced the abundance of bacteria and decreased the evenness of soil bacterial distribution. Proteobacteria abundance was significantly increased by 32.3%， 21.1% and 16.7%， respectively， under 10 g·kg-1， 30 g·kg-1， 60 g·kg-1biochar treatment，while Bacteroidetes abundance decreased obviously by 22.1%， 55.3%， 66.8% and 50.5%， respectively， compared with those of control. The results indicated that the rational dosage of biochar application was not more than 5 g·kg-1（soil dry） in calcareous cinnamon soil to maintain the microbial community structure and activity.

KeywordsBiochar； Calcareous cinnamon soil； Microbial activity； Microbial diversity； Biolog； High-throughput sequencing；Bacterial community