龐 勇，聶 瑞，呂頌輝

（1. 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，?？?海南 570125； 2. 海南省海洋監(jiān)測預(yù)報(bào)中心，海口 海南 570206； 3. 暨南大學(xué) 赤潮與海洋生物學(xué)研究中心，廣州 廣東 510632）

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不同磷源對(duì)米氏凱倫藻生長和堿性磷酸酶活性的影響

龐 勇1，3，聶 瑞2，3，呂頌輝3

（1. 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，?？?海南 570125； 2. 海南省海洋監(jiān)測預(yù)報(bào)中心，?？?海南 570206； 3. 暨南大學(xué) 赤潮與海洋生物學(xué)研究中心，廣州 廣東 510632）

摘要：為了解米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）赤潮形成的磷營養(yǎng)機(jī)理，作者研究了不同磷源［三磷酸腺苷二鈉鹽（Adenosine disodium triphosphate，ATP）、甘油磷酸鈉（sodium glycerophosphate，G-P）、卵磷脂（lecthin，LEC）和NaH2PO4·2H2O］對(duì)其生長和藻細(xì)胞堿性磷酸酶活性（alkaline phosphatase activity ，APA）的影響。結(jié)果表明： （1）米氏凱倫藻可以有效利用無機(jī)磷（NaH2PO4·2H2O），對(duì)有機(jī)磷源如三磷酸腺苷二鈉鹽（ATP）、甘油磷酸鈉（G-P）也能有效利用，但不能有效利用卵磷脂（LEC）； （2）米氏凱倫藻堿性磷酸酶的檢測中，在起始階段，不同磷源（ATP，G-P，LEC和NaH2PO4·2H2O）的米氏凱倫藻APA達(dá)到最大值，米氏凱倫藻的APA分別為 6.0，10.5，8.0和0.4 pmol/（個(gè)·h）。隨培養(yǎng)時(shí)間的持續(xù)，各有機(jī)磷培養(yǎng)基中米氏凱倫藻的 APA均表現(xiàn)出先逐漸減小，而后增強(qiáng)，最后在最大值維持的趨勢，而以 NaH2PO4·2H2O為磷源的米氏凱倫藻的APA沒有明顯的增加； （3）單個(gè)細(xì)胞的米氏凱倫藻的APA位點(diǎn)分布明顯，大致位于細(xì)胞表面。通過研究發(fā)現(xiàn)，米氏凱倫藻在外界環(huán)境無機(jī)磷限制的條件下，能夠較好地吸收利用有機(jī)磷維持生長，印證了近年來米氏凱倫藻赤潮頻繁地發(fā)生在磷限制海域的事實(shí)。

關(guān)鍵詞：米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi Hansen）； 有機(jī)磷； 堿性磷酸酶

米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi Hansen）屬于裸甲藻目（Gymnodiniales），凱倫藻屬（Kerenia），能分泌溶血性毒素和魚毒素，有溶解魚類鰓組織細(xì)胞的作用。中毒魚鰓出現(xiàn)鰓小葉上皮細(xì)胞增生、鄰近鰓小葉黏連、上皮細(xì)胞脫落、鰓血管破裂、血細(xì)胞滲出等組織病理現(xiàn)象。鰓小葉作為魚類呼吸系統(tǒng)的重要組成部位，一旦發(fā)生上述病變，必將影響到鰓的呼吸、分泌、排泄等功能，最終造成魚類的死亡。米氏凱倫藻分布廣泛，是近年來常見的赤潮生物，并且已經(jīng)在澳大利亞、北歐各國、日本、新西蘭、南美、北非、中國香港等地引發(fā)過赤潮災(zāi)害，造成了嚴(yán)重的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。1998年3～4月份，中國大鵬灣、深圳灣、珠江口及內(nèi)伶仃島一帶海域和香港海域發(fā)生的大規(guī)模米氏凱倫藻赤潮，導(dǎo)致深圳經(jīng)濟(jì)損失超過千萬人民幣，香港漁農(nóng)損失超過 3億港元［3-4］?？梢姡芯棵资蟿P倫藻的營養(yǎng)生理、了解米氏凱倫藻赤潮的形成規(guī)律，對(duì)于減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)損失、保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境，有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP） 是參與藻細(xì)胞磷代謝和信號(hào)肽轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種胞外磷酸酶，也是目前研究最多、最重要的一種酶，其通過誘導(dǎo)方式產(chǎn)生，作用的底物范圍很廣，能水解以單磷酸脂為主的各式有機(jī)磷復(fù)合物。唐洪杰［5］等摸索了微藻中堿性磷酸酶活性的測定方法，為后來在微藻中堿性磷酸酶的研究提供了一定技術(shù)基礎(chǔ)。而堿性磷酸酶活性的表達(dá)也會(huì)受環(huán)境介質(zhì)的影響， 比如pH、金屬離子等［6-7］。王丹［8］等對(duì)旋鏈角毛藻（Chaetoceros curvisetus）堿性磷酸酶的研究發(fā)現(xiàn)該藻能利用細(xì)胞內(nèi)源磷庫以補(bǔ)償外源磷的降低對(duì)細(xì)胞生長的影響，在無機(jī)磷匱乏而有機(jī)磷豐富的環(huán)境內(nèi)可以通過誘導(dǎo)堿性磷酸酶分解溶解態(tài)非活性磷獲得生長所需的磷。歐林堅(jiān)［9］等研究赤潮藻對(duì)無機(jī)磷源的競爭生長中發(fā)現(xiàn)，堿性磷酸酶在磷脅迫條件下大量表達(dá)，能夠水解水體中的溶解態(tài)有機(jī)磷（DOP），可以有效利用代謝產(chǎn)生的有機(jī)磷源。

藻類對(duì)不同形態(tài)的有機(jī)磷源的利用率存在差異，

［Foundation： National Natural Science Foundation of China，No. U0733006；National Keystone Basic Research Program（973），No. 2010CB428702］

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用米氏凱倫藻來至大亞灣海域，分離純化后保存于暨南大學(xué)藻種庫。

藻種采用f/2培養(yǎng)基，光照強(qiáng)度為5 000 lx，光暗比為12 h︰12 h，培養(yǎng)所用海水來至大亞灣，鹽度為29.3。正式實(shí)驗(yàn)前需對(duì)米氏凱倫藻進(jìn)行營養(yǎng)條件馴化，取生長指數(shù)期的藻種接種于低營養(yǎng)的培養(yǎng)基（NaH2PO4·2H2O為4 μmol/L的f/2培養(yǎng)基，其余組分及其濃度保持不變）中，每天檢測培養(yǎng)基中的溶解性無機(jī)磷及藻細(xì)胞數(shù)目。當(dāng)培養(yǎng)基中的溶解性無機(jī)磷的濃度低于儀器檢出限，且藻細(xì)胞停止生長 3 d后，即認(rèn)為該藻種已達(dá)到磷饑餓狀態(tài)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

以f/2培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)備容積為1 L的錐形瓶14個(gè)，添加的磷源分別為： 甘油磷酸鈉（sodium glycerophosphate，G-P）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、卵磷脂（lecthin，LEC）以及無機(jī)態(tài)的正磷酸鹽（NaH2PO4·2H2O）。起始磷源濃度大致為5.4 μmol/L，取不添加藻液的含有不同溶解有機(jī)磷源的培養(yǎng)瓶作為空白對(duì)照，檢測實(shí)驗(yàn)過程中有機(jī)磷源的自然降解。分別接種馴化后處于磷饑餓條件下的米氏凱倫藻細(xì)胞于新的培養(yǎng)基中，隔天取樣分析，檢測各組磷源含量及AP活性和細(xì)胞數(shù)目，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)重復(fù)。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)和分析

藻細(xì)胞采用浮游植物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)。自接種當(dāng)天起，每2 d計(jì)數(shù)1次，得到單位培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)值。細(xì)胞的比生長速率（μ，d-1）根據(jù)公式μ = （ ln Nt- lnN0）/（ t- t0）計(jì)算獲得。其中N0、Nt分別表示單位水體藻類細(xì)胞的起始數(shù)量和經(jīng)t天后的細(xì)胞數(shù)量，單位為個(gè)/mL。

1.4 磷源吸收測定

溶解態(tài)無機(jī)磷（dissolved inorganic phosphorus，DIP）采取磷鉬藍(lán)顯色法在分光光度計(jì)下進(jìn)行檢測（Spectrum，722E）［11］?？?cè)芙鈶B(tài)磷（total dissolved phosphorus，TDP）與細(xì)胞顆粒磷（particulate phosphorus，PP）依據(jù) Jeffries［12］的方法采用酸性過硫酸鉀（K2S2O8）氧化法進(jìn)行測定。樣品在 115℃高壓水解60～90 min，然后以DIP的方式進(jìn)行處理。溶解態(tài)有機(jī)磷DOP=TDP-DIP。

1.5 堿性磷酸酶的提取及活性測定

Bulk-AP的提取采用熒光模擬底物測胞外酶，通過外加熒光模擬底物（FMS，即熒光顯色團(tuán)和酶的作用底物以共價(jià)鍵結(jié)合的化合物）的方法，活性的測定采用熒光分光光度計(jì)（Hitachi，F(xiàn)-4600PC）檢測［13］，Ex= 365 nm，Em= 455 nm，以4-甲基傘形酮磷酸酯（4-methyllumbelliferyl，4-MUP，Sigma）為水解底物熒光測定，以 4-甲基傘形酮（4-methyllumbelliferon，Sigma）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在本實(shí)驗(yàn)中，采用濾膜過濾游離態(tài)APA（free APA，＜0.22 μm）。將APA（pmol/ （L·h））數(shù)值除以單位水體的細(xì)胞數(shù)目，獲得單位生物量的APA（pmol/（個(gè)·h））。

單個(gè)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性的反應(yīng)底物為酶標(biāo)記熒光底物2-（5＇-chloro-2＇-phosphoryloxyphenyl-6-chloro-4-（3H） -quinazolinone），也叫做CPPCQ或ELF底物（Molecular Probes，Inc.，OR）。未反應(yīng)的ELF底物為溶解態(tài)的并且不具有高熒光物質(zhì)，當(dāng)它與 AP酶反應(yīng)時(shí)，釋放出一個(gè)磷酸，并在酶活性的反應(yīng)位點(diǎn)形成不溶性的黃綠色沉淀。準(zhǔn)備無菌過濾海水，盡量輕柔地將細(xì)胞收集于微離心管中，并離心2 min（2 000～3 000 r/min），棄去上清液，向藻液加入1 mL 70%乙醇（若藻液較少，可減少加入量）［14］。在黑暗4℃下培養(yǎng)30 min，離心1 min，棄去上清液，向濃縮的藻液加入100 μL 的ELF反應(yīng)液（5 μL母液＋95 μL無菌海水），輕柔地混合均勻，在暗冷條件下培養(yǎng)1 h，離心1 min，棄去上清液，加入100 μL無菌海水。重復(fù)該步驟2～3次。將藻液最終收集于盡可能少的無菌過濾海水中，4℃冷藏、待用，取一定體積（約25 μL）的藻液于長波可通過的 DAPI濾光裝置（Ex=365 nm±8 nm，Em＞420 nm，紫光）觀察細(xì)胞［15-16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同磷源下米氏凱倫藻的生長特征

與培養(yǎng)在無機(jī)磷源NaH2PO4·2H2O中作為對(duì)照的米氏凱倫藻生長相比較，在以 G-P、ATP有機(jī)物質(zhì)為磷源的培養(yǎng)基中，米氏凱倫藻的生長狀況良好（圖1）。在NaH2PO4·2H2O的培養(yǎng)基中，米氏凱倫藻在實(shí)驗(yàn)的第 8天即基本進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞數(shù)目最大可達(dá)9.005×103個(gè)/mL。在G-P和ATP的培養(yǎng)基中，米氏凱倫藻在第 9天進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞最大數(shù)目分別可達(dá)到10.3×103和9.07×103個(gè)/mL。而在以LEC為磷源的培養(yǎng)基中，米氏凱倫藻細(xì)胞生長明顯受到抑制，在實(shí)驗(yàn)后期死亡，說明該藻無法利用大分子的有機(jī)磷LEC維持生長。米氏凱倫藻的比生長速率變化見表1，采用NaH2PO4·2H2O、G-P、ATP為磷源培養(yǎng)的米氏凱倫藻的最大比生長率分別可達(dá)到0.55、0.56、0.68/d，平均比生長率分別為0.23、0.24、0.26/d，LEC細(xì)胞最后基本死亡，比生長率為負(fù)數(shù)。比較不同磷源對(duì)米氏凱倫藻生長的影響，發(fā)現(xiàn)以NaH2PO4·2H2O、G-P、ATP為磷源培養(yǎng)的米氏凱倫藻的細(xì)胞數(shù)目基本一致，且顯著高于以LEC為磷源培養(yǎng)的情況（P＜0.05），說明該藻對(duì)小分子有機(jī)磷和無機(jī)磷源的吸收利用效率相當(dāng)，且顯著高于大分子有機(jī)磷源。

圖1 米氏凱倫藻在不同磷源培養(yǎng)下的細(xì)胞數(shù)目變化Fig. 1 Cell numbers of Karenia mikimotoi in batch culture with different phosphorus compounds

表1 米氏凱倫藻在不同磷源培養(yǎng)下的比生長速率Tab. 1 Specific growth rates of Karenia mikimotoi in batch culture with different phosphorus compounds

2.2 米氏凱倫藻對(duì)不同磷源的可利用性

在培養(yǎng)的前期，ATP、G-P和LEC的細(xì)胞顆粒磷的含量均較高，但是隨著細(xì)胞數(shù)的變化，細(xì)胞顆粒磷有了新的變化，ATP和G-P隨著細(xì)胞數(shù)的增加，從高濃度的細(xì)胞顆粒磷逐步減小，最后隨著細(xì)胞數(shù)的穩(wěn)定，細(xì)胞顆粒磷的濃度也趨于穩(wěn)定，在 NaH2PO4·2H2O的培養(yǎng)中初期的細(xì)胞顆粒磷較低，隨著細(xì)胞數(shù)的增加，細(xì)胞顆粒磷增加，說明在 NaH2PO4·2H2O培養(yǎng)中，外界無機(jī)磷源充足時(shí)，細(xì)胞內(nèi)磷含量很高，而相應(yīng)其他 3種有機(jī)磷培養(yǎng)液中細(xì)胞內(nèi)的磷含量較低。

LEC培養(yǎng)的細(xì)胞顆粒磷先是增加，其后由于細(xì)胞數(shù)的死亡，細(xì)胞顆粒磷變?yōu)榱悖渌袡C(jī)磷源（ATP、G-P）培養(yǎng)的細(xì)胞顆粒磷呈下降趨勢，直到細(xì)胞數(shù)進(jìn)入穩(wěn)定期，才趨于平穩(wěn)。

研究結(jié)果表明，米氏凱倫藻能夠有效利用NaH2PO4·2H2O、ATP和G-P（圖2a，2b）。實(shí)驗(yàn)起始階段，GP培養(yǎng)基中因DOP水解使DIP含量有所增加，隨后因被米氏凱倫藻大量攝取，DIP處于相對(duì)平緩的趨勢，溶解性無機(jī)磷含量略高于 LEC培養(yǎng)的含量，LEC培養(yǎng)液中，無機(jī)磷幾乎為零。而在ATP培養(yǎng)中，由于ATP容易水解，ATP的兩個(gè)高能磷酸鍵的其中一個(gè)斷裂，形成磷酸鹽和二磷酸腺苷（ADP），見圖2a，ATP培養(yǎng)中的DIP明顯高于LEC和GP。NaH2PO4·2H2O培養(yǎng)的培養(yǎng)基中無機(jī)磷初始時(shí)明顯高，為 5.4 μmol/L，隨時(shí)間的持續(xù)逐步減少。實(shí)驗(yàn)進(jìn)入第8天，除LEC培養(yǎng)米氏凱倫藻外，其他磷源培養(yǎng)的米氏凱倫藻進(jìn)入穩(wěn)定期，此后，培養(yǎng)基中DOP和DIP的濃度基本保持相對(duì)平緩狀態(tài)，NaH2PO4·2H2O培養(yǎng)液的有機(jī)磷含量最少，變化趨勢基本平行于坐標(biāo)軸，LEC屬于高分子，不能被直接利用或水解，濃度變化基本不變； G-P減少的幅度較小，部分被水解或直接被藻細(xì)胞利用； ATP培養(yǎng)液的有機(jī)磷含量最高，其原因?yàn)锳DP中有兩個(gè)磷酸基，在ADP消解后形成兩分子的磷酸鹽，ATP中的有機(jī)磷濃度幾乎為其初始濃度的2倍。

在環(huán)境磷酸鹽豐富的情況下，有些藻類具有過量攝取磷并儲(chǔ)備磷庫的能力，在磷脅迫的情況下，這些藻類能迅速利用內(nèi)部的磷庫維持生長，米氏凱倫藻也具備這種能力。起始接種時(shí)細(xì)胞顆粒磷的含量為 0.22 pmol/個(gè)，接種后 NaH2PO4·2H2O、LEC、G-P及 ATP培養(yǎng)基中細(xì)胞顆粒磷分別達(dá)到最大值0.718、0.220、0.594、0.991 pmol/個(gè)（圖2c）。接種后，ATP和 G-P培養(yǎng)的培養(yǎng)液中，無機(jī)磷源稀缺，隨著DOP被水解，細(xì)胞顆粒磷迅速增加，米氏凱倫藻細(xì)胞的生長也進(jìn)入穩(wěn)定期，環(huán)境中DIP及DOP含量變化減緩，米氏凱倫藻同時(shí)利用細(xì)胞內(nèi)磷庫和外界磷源維持生長，細(xì)胞顆粒磷隨之降低，達(dá)到一個(gè)平緩的穩(wěn)定期。而LEC培養(yǎng)的培養(yǎng)液中，LEC不能被水解成小分子有機(jī)磷或無機(jī)磷，因此，隨著培養(yǎng)的持續(xù)，細(xì)胞顆粒磷較少，直到藻細(xì)胞死亡，細(xì)胞顆粒磷為磷。以NaH2PO4·2H2O培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)前期無機(jī)磷源充足，細(xì)胞顆粒磷受外界充足磷源影響，細(xì)胞對(duì)環(huán)境的響應(yīng)較慢，藻細(xì)胞數(shù)量增加，磷源攝取量較少，細(xì)胞顆粒磷變化趨勢較為平緩，還略有降低；培養(yǎng)中期，藻細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期，攝取磷源較多，細(xì)胞顆粒磷升至最大值； 后期，環(huán)境中的無機(jī)磷源有所降低，米氏凱倫藻同時(shí)利用細(xì)胞內(nèi)磷庫和外界磷源維持生長，導(dǎo)致細(xì)胞顆粒磷降低，在隨后幾天，細(xì)胞死亡、代謝重新釋放了一定量的磷源進(jìn)入培養(yǎng)液中，米氏凱倫藻又能迅速攝取磷，細(xì)胞顆粒磷含量有所回升，如圖2c所示。

圖2 米氏凱倫藻批量培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中溶解無機(jī)磷（a）、溶解有機(jī)磷（b）和顆粒磷（c）的濃度變化Fig. 2 Variation in phosphorous concentration in the batch culture of Karenia mikimotoi，dissolved inorganic phosphorus （a），dissolved organic phosphorus （b），cellular particulate phosphorus （c）

2.3 米氏凱倫藻堿性磷酸酶活性的變化

2.3.1 米氏凱倫藻Bulk-APA的變化特性

受起始接種時(shí)米氏凱倫藻的磷脅迫生理狀態(tài)影響，各培養(yǎng)基中起始總APA為5.86 pmol/（個(gè)·h）。在隨后幾天，不同磷源培養(yǎng)基中米氏凱倫藻的APA變化趨勢見圖3。在無機(jī)磷組中，因磷源一直充足，所以APA表達(dá)一直較低較穩(wěn)定。在有機(jī)磷組中，大分子的LEC不被米氏凱倫藻吸收利用，APA從一開始就高，直到藻細(xì)胞死亡后變?yōu)榱悖?而另兩組（ATP和GP），開始環(huán)境中缺磷，APA也較高，隨著有機(jī)磷分解，提供了藻需要的磷源，APA降低。在培養(yǎng)初期，LEC培養(yǎng)的藻液初期表現(xiàn)出高濃度的堿性磷酸酶，達(dá)到 10.5 pmol/（個(gè)·h），但是很快迅速降低，基本為零，充分說明 LEC不能被米氏凱倫藻所利用，導(dǎo)致最后米氏凱倫藻全部死亡。其他兩種有機(jī)磷均是在培養(yǎng)初期表現(xiàn)出較高的APA濃度，但隨著時(shí)間的變化，堿性磷酸酶的含量不斷降低。對(duì)于NaH2PO4·2H2O培養(yǎng)來說，剛接種培養(yǎng)時(shí)，藻類對(duì)環(huán)境的不適應(yīng)性使其表現(xiàn)出較高的APA，但是隨之立即進(jìn)入低APA階段，隨著磷濃度的減少，APA略有升高的趨勢。

圖3 米氏凱倫藻在不同磷源培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中堿性磷酸酶活性的變化Fig. 3 Variation in specific alkaline phosphatase in different phosphorus compounds in a culture of Karenia mikimotoi

以NaH2PO4·2H2O、G-P和ATP為磷源培養(yǎng)的米氏凱倫藻的 APA，后期最大值分別為 1.80、8.00和6.00 pmol/（個(gè)·h）。結(jié)果表明，溶解態(tài)無機(jī)磷NaH2PO4·2H2O和小分子溶解態(tài)有機(jī)磷G-P、ATP的存在抑制了APA的表達(dá)，培養(yǎng)基中G-P和ATP部分被水解為無機(jī)磷源，AP含量高于NaH2PO4·2H2O培養(yǎng)液中的含量，而在 NaH2PO4·2H2O4培養(yǎng)中的 AP，由于環(huán)境中的無機(jī)磷源充足，AP表達(dá)情況較弱。

在表達(dá)較強(qiáng)的ATP和G-P培養(yǎng)中，前期APA表達(dá)較強(qiáng)，有機(jī)磷水解釋放出無機(jī)磷源，供米氏凱倫藻生長，其后 APA表達(dá)逐漸減弱，隨著水解的無機(jī)磷的消耗，APA值有所回升。在后期藻細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期，米氏凱倫藻APA的表達(dá)也趨于穩(wěn)定。

2.3.2 單個(gè)米氏凱倫藻細(xì)胞堿性磷酸酶活性的變化特性

對(duì)單個(gè)米氏凱倫藻細(xì)胞進(jìn)行APA特性觀察分析，如圖4，單個(gè)細(xì)胞表現(xiàn)出黃綠色的熒光沉淀（DAPI濾光裝置，Ex=365 nm±8 nm，Em＞420 nm，紫光）。在無機(jī)磷培養(yǎng)下的米氏凱倫藻APA表達(dá)較弱，ATP和GP培養(yǎng)的藻細(xì)胞APA表達(dá)強(qiáng)度和概率均高于無機(jī)磷培養(yǎng)的藻細(xì)胞。在不同生長時(shí)期藻細(xì)胞的APA熒光強(qiáng)弱有一定的差異，變化趨勢基本上與Bulk-APA含量變化一致。LEC培養(yǎng)的米氏凱倫藻細(xì)胞在生長前期有很強(qiáng)的熒光特性表達(dá)，到培養(yǎng)的中后期藻細(xì)胞的熒光特性消失； ATP和G-P培養(yǎng)的藻細(xì)胞在生長前期也有較強(qiáng)的熒光特性，到生長后期藻細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后，堿性磷酸酶減少，產(chǎn)生的黃綠色熒光沉淀的表達(dá)也相應(yīng)減弱。

圖4 米氏凱倫藻ELF標(biāo)記單細(xì)胞堿性磷酸酶情況Fig. 4 Result of Karenia mikimotoi labeled with ELF

3 結(jié)論

米氏凱倫藻能夠有效利用無機(jī)磷源（NaH2PO4·2H2O），對(duì)小分子有機(jī)磷源如甘油磷酸鈉（G-P）和三磷酸腺苷（ATP）也能夠有效利用，但不能利用大分子有機(jī)磷源卵磷脂（LEC）。

米氏凱倫藻能夠在磷源充足時(shí)攝取大量的磷儲(chǔ)存在體內(nèi)，在外界環(huán)境磷源缺乏時(shí)，能夠迅速通過酶作用有效利用體內(nèi)的磷庫維持生長； 米氏凱倫藻環(huán)境無機(jī)磷源充足時(shí)，幾乎沒有堿性磷酸酶的表達(dá)，環(huán)境無機(jī)磷源缺乏時(shí)，能誘導(dǎo)產(chǎn)生堿性磷酸酶水解有機(jī)磷和顆粒磷來維持自身的生長。

米氏凱倫藻不僅有較高的 Bulk-APA，對(duì)于single-APA 也有較強(qiáng)的表現(xiàn)，在單個(gè)米氏凱倫藻細(xì)胞中，能夠清晰地在細(xì)胞的表面看見由 ELF標(biāo)記留下黃綠色的熒光沉淀。

參考文獻(xiàn)：

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（本文編輯： 譚雪靜）

中圖分類號(hào)：X173

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3096（2016）04-0059-06

doi：10.11759//hykx20140805001

收稿日期：2014-08-05； 修回日期： 2015-08-31

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（U0733006）； 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）項(xiàng)目（2010CB428702）

作者簡介：龐勇（1983-），男，四川江油人，碩士，助理研究員，主要從事海洋生態(tài)環(huán)境學(xué)研究，E-mail： yongpang520@163.com一般來說，利用率取決于有機(jī)磷的分子量大小。對(duì)大分子而言，分子量太大，藻類對(duì)其利用率可能很低，而小分子的有機(jī)磷源則可能會(huì)有很高的利用率。在無機(jī)磷耗盡的寡營養(yǎng)海區(qū)，AP對(duì)浮游植物再利用溶解態(tài)有機(jī)磷維持生長具有重要意義，不同種類浮游植物利用 AP降解溶解性有機(jī)磷的能力甚至關(guān)系著種群的存亡［10］。本研究選用廣東沿海常見的赤潮藻種，選取了 3種有機(jī)磷源 ATP、LEC、G-P和一種無機(jī)磷源 NaH2PO4·2H2O，研究米氏凱倫藻對(duì)不同磷源的吸收利用特征，揭示和補(bǔ)充米氏凱倫藻赤潮形成的磷營養(yǎng)機(jī)理。所以在不同磷源下對(duì)米氏凱倫藻的生長和堿性磷酸酶活性進(jìn)行研究，顯得非常有意義。

Effects of the different kinds of phosphorus sources on growth and alkaline phosphatase activity （APA） of Karenia mikimotoi Hansen

PANG Yong1，3，NIE Rui2，3，LYU Song-hui3
（1. Hainan Academy of Oceanographic and Fishery Sciences，Haikou 570125，China； 2. Marine Monitoring and Forecasting Center of Hainan Province，Haikou 570206，China； 3. Research Center for Harmful Algae and Marine Biology，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Received： Aug. 5，2014

Key words：Karenia mikimotoi； organic phosphorus； alkaline phosphatase

Abstract：To understand the mechanisms of phosphorus nutrition in blooms of Karenia mikimotoi，the studies of the growth and alkaline phosphatase activity （APA） of K. mikimotoi were undertaken using different phosphorus sources ［adenosine triphosphate disodium salt （adenosine disodium triphosphate，and ATP），glycerophosphate （sodium glycerophosphate and G-P），lecithin （lecthin and LEC） and NaH2PO4·2H2O］. The results revealed the following （1） K. mikimotoi could utilize PO4-P，sodium glycerophosphate （G-P），sodium glycerophosphate （G-P），and adenosine triphosphate （ATP） as phosphorus sources，but it could not utilize lecithin （LEC）； （2） when the APA of K. mikimotoi was assayed at the initial stage，the maximum APA in the different phosphorus sources，ATP，G-P，LEC and NaH2PO4·2H2O，of K. mikimotoi were 6.0，10.5，8.0 and 0.4 pmol/（cell·h），respectively. As the incubation time was increased，the APA decreased and then increased and maintained the maximum level. The phosphorus source of NaH2PO4·2H2O，the APA of K. mikimotoi did not increase significantly； （3） the APA site of a single K. mikimotoi cell was widely distributed，largely on the cell surface In this research，it was found that K. mikimotoi could better absorb and utilize organic phosphorus to maintain growth in the external environment under inorganic phosphorus-limited conditions，which confirmed that the bloom of K. mikimotoi frequently occurred in phosphorus-restricted areas in recent years.