謝爾瓦妮古麗·蘇來曼，成 婕，鄧祥元，高 坤，馬志欣

（江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

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防污劑Irgarol 1051對(duì)三角褐指藻生長及生理特性的影響

謝爾瓦妮古麗·蘇來曼，成 婕，鄧祥元，高 坤，馬志欣

（江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

摘要：為研究防污劑 Irgarol 1051對(duì)微藻生長及生理生化特性的影響，以三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）為材料，分析了Irgarol 1051對(duì)P. tricornutum生長、葉綠素a含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量等的影響。結(jié)果表明： Irgarol 1051可抑制P. tricornutum的生長，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐受性； P. tricornutum中葉綠素a、可溶性蛋白質(zhì)含量及SOD酶活力等均隨Irgarol 1051質(zhì)量濃度的增加而升高，以維持其生長和生理狀態(tài)； 隨著 Irgarol 1051質(zhì)量濃度的升高，藻細(xì)胞中 MDA含量顯著增加，表明細(xì)胞中活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）過量積累，這將破壞藻細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)與功能。研究結(jié)果將為探討Irgarol 1051對(duì)微藻的效應(yīng)機(jī)制及其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)資料和科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：Irgarol 1051； 三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）； 生長； 生理特性

Irgarol 1051（2-methylthio-4-tert-butylamino-6-cyclopropylamino-s-triazine）是一種三嗪類有機(jī)除草劑，作為光合系統(tǒng)II（Photosystem II，PSII）抑制劑可有效抑制海洋附著藻類的生長，常與氧化亞銅一起形成復(fù)合防污劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)海洋污損生物的防除［1］。近年來，由于有機(jī)錫類防污劑被全面禁用，Irgarol 1051結(jié)合銅化合物的新型防污劑已成為海洋防污涂料市場的主要產(chǎn)品之一［2］。在海洋防污過程中，Irgarol 1051以2.5～16 μg/cm2/d的速率被釋放到周圍水體中［3］，這是其進(jìn)入水體的主要途徑。由于Irgarol 1051降解緩慢，難以被生物或非生物過程降解，半衰期長達(dá) 100～ 350 d［4］，且其在近岸水域的質(zhì)量濃度已達(dá)到μg/L級(jí)，是目前使用最多的防污劑，也是環(huán)境中最容易檢測到的、半衰期較長的防污劑之一［5-6］。

研究表明，Irgarol 1051可通過抑制PSII中的電子傳遞，阻斷光合作用的進(jìn)行，進(jìn)而影響藻類等的生存和生長［7］； 而且它在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有累積作用，會(huì)對(duì)非目標(biāo)水生植物造成毒害效應(yīng)［8］。目前，Irgarol 1051對(duì)水生植物的毒性效應(yīng)機(jī)理較為清晰，主要有3種途徑： 一是與PSII中的D1蛋白結(jié)合，干擾PSII的電子傳遞，從而降低ATP、NADPH等的產(chǎn)量； 二是促使細(xì)胞體內(nèi)積累活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），增加對(duì)PSII的氧化應(yīng)激壓力；三是阻礙D1蛋白的周轉(zhuǎn)［8-9］。此外，作為環(huán)境污染物，Irgarol 1051在對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性效應(yīng)的同時(shí)，還可改變環(huán)境生物群落的組成與豐度，并誘導(dǎo)生物耐受［9］。Wendt等［1］研究了Irgarol 1051對(duì)孔石莼（Ulva lactuca L.）游動(dòng)孢子附著和生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)即使Irgarol 1051達(dá)到2000 nM，游動(dòng)孢子的附著和生長未受到影響，說明孔石莼游動(dòng)孢子對(duì) Irgarol 1051具有較強(qiáng)的耐受能力，并推測這種耐受能力可能是由于以谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶為主的酶促解毒體系引起的。但目前對(duì)Irgarol 1051誘導(dǎo)生物耐受的機(jī)理尚不清楚。

本研究以三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）為材料，分析了Irgarol 1051對(duì)P. tricornutum生長、葉綠素 a含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量等的影響，以期從生理生化水平上揭示Irgarol 1051對(duì)P. tricornutum生長及

［Foundation： National Natural Science Foundation of China，No. 31200381； China Postdoctoral Science Foundation Funded Project，No. 2013M531370，No. 2014T70532； Jiangsu Training Programs of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates，No. 201410289035Z］

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）由廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室高坤山教授課題組提供。在無菌條件下，將P. tricornutum轉(zhuǎn)移至 f/2營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為： 溫度 20℃；光強(qiáng)度4500 lx； 光周期12 h L︰12 h D。Irgarol 1051購自廣州市齊云生物科技有限公司； 可溶性蛋白、SOD及MDA測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 其他試劑購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藻種的活化和預(yù)培養(yǎng)

在無菌條件下，將P. tricornutum轉(zhuǎn)移至f/2培養(yǎng)液中進(jìn)行同步化培養(yǎng)7 d，至對(duì)數(shù)生長期后進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為： 溫度20℃，光強(qiáng)度4500 lx，光周期為12 h L︰12 h D）。

1.2.2 暴露試驗(yàn)

參照 OECD201藻類生長抑制實(shí)驗(yàn)的原理和方法，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果在P. tricornutum培養(yǎng)液中加入不同質(zhì)量濃度的Irgarol 1051（0、1、3 、6、9、12 μg/L），每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，暴露時(shí)間為96 h。

1.2.3 藻細(xì)胞密度及生長速率的測定

每天取藻液 0.2 mL，采用血球計(jì)數(shù)板法測定藻細(xì)胞密度。

生長速率的計(jì)算公式如下：

ri=（ln（Nt）-ln（N0））/t式中，ri為生長速率（/h），Nt為t時(shí)刻的藻細(xì)胞密度（個(gè)/mL），N0為初始藻細(xì)胞密度（個(gè)/mL），t為暴露時(shí)間（h）。

1.2.4 葉綠素a含量的測定

取5 mL藻液，用Sigma離心機(jī)在5 000 r/min下離心10 min，棄上清后，再用蒸餾水重懸洗滌2次。向收集到的藻細(xì)胞中加入5 mL無水甲醇，并在4℃條件下避光抽提24 h后，渦旋振蕩10 s，然后在5 000 r/min下離心10 min，取上清液。以無水甲醇為參比，利用分光光度計(jì)在663nm和645 nm波長下測定上清液的吸光值。

葉綠素a濃度（Chl a）的計(jì)算公式如下：

式中，NChl a表示葉綠素a的濃度，μg/mL； A645、A663分別表示上清液在波長為645 nm和663 nm下的吸光值［10］。

葉綠素a含量（CChl a）的計(jì)算公式如下：CChl a表示葉綠素a含量（μg/個(gè)）； Vs和Vz分別表示上清液和藻液取樣體積（mL）。

1.2.5 可溶性蛋白含量、SOD酶活力及MDA含量的測定

取50 mL藻液，用Sigma離心機(jī)在5 000 r/min下離心10 min收集藻細(xì)胞，棄上清后加入0.05 mol/L pH值7.8的磷酸緩沖液2 mL，并利用JY92-IIN型超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）破碎細(xì)胞10 min（其間工作5 s，間歇10 s），鏡檢無完整細(xì)胞后于12000 r/min下離心10 min，取上清液用于測定可溶性蛋白含量、SOD酶活力及MDA含量等?？扇苄缘鞍缀俊OD酶活力及MDA含量的測定方法參照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果分別以μg/1010個(gè)，U/107個(gè)，nmol/107個(gè)來表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 Irgarol 1051對(duì)P. tricornutum生長的影響

由圖1可以看出，防污劑Irgarol 1051可抑制P. tricornutum的生長，且這種抑制效應(yīng)隨Irgarol 1051質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，如在暴露96 h后，在1、3、6、9、12 μg/L Irgarol 1051處理組中，P. tricornutum的細(xì)胞密度為對(duì)照組的 91.2%、81.8%、55.3%、52.3%、42.4%，這與Deng等［8］對(duì)Irgarol 1051抑制聚球藻7942生長的研究結(jié)果一致。而隨著暴露時(shí)間的延長，其生長速率逐漸增大（表1），表明Irgarol 1051可誘導(dǎo)P. tricornutum產(chǎn)生耐受性。Eriksson等［9］研究了Irgarol 1051誘導(dǎo)下海洋附著生物群落的種群組成與豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Irgarol 1051誘導(dǎo)下，海洋附著生物群落的種群組成及豐度發(fā)生了改變，其中舟形藻（Navicula sp.）的豐度由 0.1%增加到 4%，說明Navicula sp.對(duì)Irgarol 1051具有一定的耐受能力。但目前對(duì) Irgarol 1051誘導(dǎo)生物耐受的機(jī)理尚不清楚，推測可能是類似于陸地植物，Irgarol 1051導(dǎo)致光合系統(tǒng)II（PSII）反應(yīng)中心D1蛋白發(fā)生突變（Ser264變成Gly）［9］，但仍需通過進(jìn)一步研究來解析 Irgarol 1051誘導(dǎo)生物耐受的機(jī)理。

圖1 Irgarol 1051對(duì)三角褐指藻生長的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of Irgarol 1051 on the growth of P. tricornutum

表1 Irgarol 1051對(duì)三角褐指藻生長速率的影響Tab. 1 Effects of different concentrations of Irgarol 1051 on the growth rate of P. tricornutum

2.2 Irgarol 1051對(duì)P. tricornutum中葉綠素a及可溶性蛋白含量的影響

葉綠素 a是綠色植物進(jìn)行光合作用的重要色素之一，其含量的變化將直接影響植物的生長發(fā)育［11］。Irgarol 1051對(duì)P. tricornutum中葉綠素a含量的影響如圖2A所示，從中可以看出，隨著Irgarol 1051質(zhì)量濃度的升高，P. tricornutum中葉綠素a含量也逐漸增加，如在1、3、6、9、12 μg/L Irgarol 1051處理組中，P. tricornutum中葉綠素a含量分別為對(duì)照組的1.18、1.46、1.77、1.65和1.81倍，表明在Irgarol 1051脅迫下，P. tricornutum會(huì)通過積累葉綠素a來維持其光合作用的進(jìn)行，促進(jìn)其生長發(fā)育。此外，隨著Irgarol 1051質(zhì)量濃度的升高，P. tricornutum中可溶性蛋白含量也逐漸增加（圖2B），在6 μg/L Irgarol 1051處理組中，P. tricornutum中可溶性蛋白含量達(dá)到最大值（6.94 μg/1010個(gè)），之后略微降低。研究表明： 在一定脅迫條件下，可溶性蛋白含量的變化可作為衡量植物抗逆性的一個(gè)指標(biāo)，可溶性蛋白含量的提高是植物在逆境脅迫下的適應(yīng)表現(xiàn)，逆境脅迫可誘導(dǎo)產(chǎn)生一些新蛋白，并產(chǎn)生大量與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的酶類以抵抗逆境的脅迫［12］。

圖 2 Irgarol 1051對(duì)三角褐指藻中葉綠素 a（A）和蛋白質(zhì)（B）含量的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of Irgarol 1051 on chlorophyll a （A） and protein （B） content in P. tricornutum

2.3 Irgarol 1051對(duì)P. tricornutum中SOD酶活力的影響

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，可與生物體內(nèi)過氧化物酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽酶等組成了抗氧化系統(tǒng)，抵御各種脅迫條件［13］，其中，SOD可催化生物細(xì)胞中的 ROS發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過氧化氫，再由過氧化氫酶將其轉(zhuǎn)化為無害的分子氧和水，從而有效地清除 ROS，防止細(xì)胞膜系統(tǒng)過氧化作用的發(fā)生。從圖3中可以看出，隨著Irgarol 1051質(zhì)量濃度的升高，P. tricornutum中SOD酶活力先升高，在6 μg/L Irgarol 1051處理組中，P. tricornutum中SOD 酶活力達(dá)到最大值（0.041 U/107個(gè)），之后隨Irgarol 1051質(zhì)量濃度的升高而略微降低，這與 P. tricornutum中可溶性蛋白含量的變化趨勢基本一致（圖2B）。SOD酶活力的增加表明在Irgarol 1051脅迫下，P. tricornutum中產(chǎn)生了 ROS，從而誘導(dǎo) P. tricornutum合成SOD，用于將ROS還原為H2O2，從而減輕ROS對(duì)P. tricornutum中生化成分及膜脂結(jié)構(gòu)等的破壞作用。但在高質(zhì)量濃度Irgarol 1051脅迫下，P. tricornutum中SOD酶活力降低，可能是由于P. tricornutum中與SOD合成相關(guān)的代謝途徑被破壞，導(dǎo)致其含量降低。

圖3 Irgarol 1051脅迫下三角褐指藻中SOD酶活力變化Fig. 3 Changes in SOD activity in P. tricornutum underIrgarol 1051-induced stress

2.4 Irgarol 1051脅迫下P. tricornutum中MDA含量的變化丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量的高低可反映細(xì)胞膜脂過氧化的程度，是膜氧化損傷的重要指標(biāo)［8，14］。從圖 4中可以看出，隨著

圖4 Irgarol 1051對(duì)三角褐指藻中MDA含量的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of Irgarol 1051 on MDA content in P. tricornutum

Irgarol 1051質(zhì)量濃度的增加，P. tricornutum脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA含量也隨之增加，表明在 Irgarol 1051脅迫下P. tricornutum中產(chǎn)生了大量的ROS，且由于SOD等抗氧化酶活力的降低，加快了膜脂過氧化的進(jìn)程，從而致使藻細(xì)胞中MDA含量升高。

3 結(jié)論

防污劑Irgarol 1051可抑制P. tricornutum的生長，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生生物耐受性，但耐受機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。在Irgarol 1051脅迫下，P. tricornutum中葉綠素a及可溶性蛋白含量逐漸升高，用于抵御 Irgarol 1051的脅迫，維持其生長狀態(tài)。且在Irgarol 1051脅迫下，P. tricornutum細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生明顯的生理生化反應(yīng)，如SOD酶活力先上升后下降，MDA含量逐漸升高等，表明細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生和消除間的平衡隨Irgarol 1051質(zhì)量濃度的增大逐步被破壞，ROS積累可導(dǎo)致藻細(xì)胞膜的破壞，從而影響P. tricornutum的生長和生理特性。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Wendt I，Arrhenius A，Backhaus T，et al. Extreme Irgarol tolerance in an Ulva lactuca L. population on the Swedish west coast［J］. Marine Pollution Bulletin，2013，76（1-2）： 360-364.

［2］ 許鳳玲，藺存國，于泓先，等. 海洋防污劑及其緩控釋技術(shù)進(jìn)展［J］. 材料開發(fā)與應(yīng)用，2013，28（3）： 119-122. Xu Fengling，Lin Cunguo，Yu Hongxian，et al. The study of controlled release of marine antifoulant［J］. Development and Application of Materials，2013，28（3）： 119-122.

［3］ Lam K H，Lam M H W，Lam P K S，et al. Identification and characterization of a new degradation product of Irgarol 1051 in mercuric chloride-catalyzed hydrolysis reaction and in coastal waters［J］. Marine Pollution Bulletin，2004，49： 361-367.

［4］ Kim N S，Shim W J，Yim U H，et al. Assessment of TBT and organic booster biocide contamination in seawater from coastal areas of South Korea［J］. Marine Pollution Bulletin，2014，78（1-2）： 201-208.

［5］ 周曉見，董夏偉，繆莉，等. 海洋防污損涂料添加劑Irgarol 1051環(huán)境科學(xué)研究進(jìn)展［J］. 環(huán)境科技，2011，24（3）： 64-68. Zhou Xiaojian，Dong Xiawei，Miao Li，et al. Environmental science progress of Irgarol 1051 marine antifouling additives［J］. Environmental Science and Technology，2011，24（3）： 64-68.

［6］ Thomas K V，Brooks S. The environmental fate and effects of antifouling paint biocides［J］. Biofouling，2010，26（1）： 73-88.

［7］ Arrhenius A，Backhaus T，Gronvall F，et al. Effects of three antifouling agents on algal communities and algal reproduction： mixture toxicity studies with TBT，Irgarol，and Sea Nine［J］. Archives of Environmental Con-tamination and Toxicology，2006，50（3）： 335-345.

［8］ Deng X Y，Gao K，Sun J L. Physiological and biochemical responses of Synechococcus sp. PCC7942 to Irgarol 1051 and diuron［J］. Aquatic Toxicology，2012，122-123： 113-119.

［9］ Eriksson K M，Clarke A K，F(xiàn)ranzen L G，et al. Community-level analysis of psbA gene sequences and Irgarol tolerance in marine periphyton［J］. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（4）： 897-906.

［10］ Porra R J. The chequered history of the development and use of simultaneous equations for the accurate determination of chlorophylls a and b［J］. Photosynthesis Research，2002，73： 149-156.

［11］ 王洪斌，成明，錢鵬，等. 金屬離子對(duì)中肋骨條藻的脅迫效應(yīng)及葉綠素a合成的影響［J］. 海洋科學(xué)，2012，36（7）： 104-108. Wang Hongbin，Cheng Ming，Qian Peng，et al. The stress effects of metal ions on Skeletonema costatum and the influences on chlorophyll a synthesis［J］. Marine Sciences，2012，36（7）： 104-108.

［12］ 瞿建宏，羅永宏，裘麗萍，等. 甲萘威對(duì)普通小球藻生長和主要生理指標(biāo)的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）： 319-320. Zhai Jianhong，Luo Yonghong，Qiu Liping，et al. Effect of carbaryl on growth and main physiological parameters of Chlorella vulgaris［J］. Jiangsu Agricultural Sciences，2013，41（9）： 319-320.

［13］ 于娟，唐學(xué)璽，李永祺，等. UV-B輻射對(duì)海洋微藻抗氧化系統(tǒng)的影響［J］. 海洋科學(xué)，2002，26（12）： 49-53. Yu Juan，Tang Xuexi，Li Yongqi，et al. The effect of UV-B radiation on the antioxidant system of marine microalgae［J］. Marine sciences，2002，26（12）： 49-53.

［14］ 成婕，謝爾瓦妮古麗·蘇來曼，鄧祥元，等. 納米二氧化鈦對(duì)斜生柵藻的毒性效應(yīng)研究［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（1）： 238-242. Cheng Jie，Xieerwaniguli Sulaiman，Deng Xiangyuan，et al. Toxic effects of nanoparticle TiO2on Scenedesmus obliquus［J］. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，2014，36（1）： 238-242.

（本文編輯： 梁德海）

中圖分類號(hào)：Q938.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3096（2016）04-0054-05

doi：10.11759/hykx20150412001

收稿日期：2015-10-12； 修回日期： 2016-01-02

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200381）； 中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2013M531370，2014T70532）； 江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410289035Z）

作者簡介：謝爾瓦妮古麗·蘇來曼（1992-），女，新疆阿克陶人，學(xué)士，研究方向?yàn)槲⒃瀛h(huán)境生態(tài)學(xué)，電話： 15209083736，E-mail： 2582661406@qq.com；鄧祥元，通信作者，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樵孱惌h(huán)境生物學(xué)，電話：15189112925，E-mail： dengxy2009@126.com生理特性的影響機(jī)制，并為闡明藻類對(duì) Irgarol 1051的應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制提供數(shù)據(jù)資料和理論基礎(chǔ)。

Effects of Irgarol 1051 on the growth and physiological characteristics of Phaeodactylum tricornutum

XIEERWANIGULI Sulaiman，CHENG Jie，DENG Xiang-yuan，GAO Kun，MA Zhi-xin
（College of Biotechnology，Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang 212018，China）

Received： Oct. 12，2015

Key words：Irgarol 1051； Phaeodactylum tricornutum； Growth； Physiological characteristics

Abstract：Effects of different concentrations of Irgarol 1051，an antifouling agent，on changes in the growth and physiological characteristics of Phaeodactylum tricornutum，such as chlorophyll a content，soluble protein content，superoxide dismutase （SOD） activity，and malondialdehyde （MDA） content，were analyzed. Our results showed that Irgarol 1051 significantly inhibited the growth of P. tricornutum and increased its tolerance. Chlorophyll a，soluble protein content，and SOD activity increased with an increase in Irgarol 1051 concentration to protect P. tricornutum cells from Irgarol 1051-induced stress. MDA content in P. tricornutum cells also increased with an increase in Irgarol 1051 concentration，indicating that excessive accumulation of reactive oxygen species damaged the structure and function of the microalgal membrane. Thus，these results provided data to exploit the effects of Irgarol 1051 on microalgae and to evaluate its environmental impact.