郭佳偉，朱香萍，吳志昊，宋宗誠(chéng)，范兆飛，4，譚訓(xùn)剛，尤 鋒

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109； 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3. 威海圣航水產(chǎn)科技有限公司，山東 威海 264200； 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

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大菱鲆周期蛋白依賴激酶基因cdk1、cdk6克隆及表達(dá)分析

郭佳偉1，朱香萍1，吳志昊2，宋宗誠(chéng)3，范兆飛2，4，譚訓(xùn)剛2，尤 鋒2

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109； 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3. 威海圣航水產(chǎn)科技有限公司，山東 威海 264200； 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

摘要：通過(guò)同源克隆以及5′/3′RACE的方法擴(kuò)增得到大菱鲆（Scophthalmus maximus）細(xì)胞周期蛋白依賴激酶基因cdk1和cdk6的全長(zhǎng)cDNA序列，在mRNA水平上分析了它們組織表達(dá)特征，并對(duì)比分析了靜水壓處理對(duì)其胚胎期表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，cdk1基因全長(zhǎng)cDNA序列為1281 bp （GenBank登錄號(hào)：KP339306），編碼區(qū)為912 bp； cdk6基因cDNA全長(zhǎng)1400 bp （GenBank登錄號(hào)： KT186374），編碼區(qū)長(zhǎng)度為978 bp。組織RT-PCR分析表明，cdk1基因表達(dá)具有廣泛性，在性腺、腎臟等生長(zhǎng)發(fā)育較快的組織中表達(dá)量較高； cdk6基因也在多個(gè)組織中表達(dá)，在性腺中表達(dá)量最高。通過(guò)Real time RT-PCR檢測(cè)基因在胚胎中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，靜水壓處理組 cdk1、cdk6在胚胎發(fā)育中，總體變化趨勢(shì)與對(duì)照組類似。大菱鲆胚胎對(duì)照組中cdk1在原腸期以前相對(duì)神經(jīng)胚期及以后時(shí)期表達(dá)量較高，靜水壓處理組基因表達(dá)變化與對(duì)照組趨勢(shì)相同； 對(duì)照組中 cdk6在原腸期出現(xiàn)表達(dá)高峰，但靜水壓處理組在原腸期表達(dá)量相對(duì)較低。靜水壓處理對(duì) cdk1和 cdk6的表達(dá)量的影響不同，這可能與基因還有除調(diào)控細(xì)胞周期的其他功能有關(guān)。為解析這兩個(gè)基因在大菱鲆胚胎發(fā)育中的作用及其機(jī)制提供了參考。

關(guān)鍵詞：大菱鲆（Scophthalmus maximus）； cdk1和cdk6； 克隆； 組織； 胚胎； 靜水壓； RT-PCR

三倍體魚(yú)性腺不發(fā)育或者低育而具有生長(zhǎng)速度快的特性，但是，三倍體需要每次進(jìn)行人工誘導(dǎo)，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。四倍體的生殖細(xì)胞含有偶數(shù)染色體組預(yù)期是可育的，成熟的四倍體與正常的二倍體雜交則可進(jìn)行大批量、一勞永逸的三倍體生產(chǎn)，故四倍體研究一直被關(guān)注。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，自20世紀(jì)80年代以來(lái)，已在超過(guò)40種魚(yú)類中開(kāi)展了人工誘導(dǎo)四倍體的嘗試，如淡水魚(yú)類羅非魚(yú)（Oreochromis spp.）［1］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［2］和海水魚(yú)歐鱸（Dicentrarbus labrax）［3］等。這些研究多限于處理方法參數(shù)篩選優(yōu)化，對(duì)其后期生長(zhǎng)發(fā)育到成熟個(gè)體的報(bào)道較少，僅有淡水魚(yú)異源四倍體鯽鯉（♀Carassius auratus red. Var X ♂Cyprinus carpio的雜交可育后代）［4］等的相關(guān)報(bào)道，故魚(yú)類四倍體誘導(dǎo)技術(shù)尚需要進(jìn)一步完善，其誘導(dǎo)機(jī)制研究也尤顯重要。但目前，有關(guān)海水魚(yú)中四倍體誘導(dǎo)的分子生物學(xué)研究幾乎未見(jiàn)到，嚴(yán)重影響了海水魚(yú)類四倍體誘導(dǎo)技術(shù)的提升及三倍體育種實(shí)現(xiàn)。

四倍體的誘導(dǎo)，既要有效地破壞紡錘體、抑制分裂進(jìn)程，也要保證誘導(dǎo)結(jié)束后，受精卵能夠準(zhǔn)確地重新啟動(dòng)，確保加倍的染色體組協(xié)同一致， 完成后續(xù)分裂和發(fā)育過(guò)程，而該過(guò)程的順利實(shí)現(xiàn)并非易事，這也許就是現(xiàn)今人們只獲得了四倍化胚胎，而很難得到四倍體魚(yú)的原因［5］。卵裂抑制后的重新啟動(dòng)與細(xì)胞分裂周期的重新啟動(dòng)密切相關(guān)。因此，通過(guò)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)變化，可以分析重新啟動(dòng)過(guò)程中分子水平變化和調(diào)整機(jī)制，研究四倍體的形成機(jī)制，從而指導(dǎo)誘導(dǎo)參數(shù)的優(yōu)化。細(xì)胞周期指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成的

［Foundation： National High Technology Research and Development Program of China （863 Programme），No. 2012AA10A402； Natural Science Foundation of Shandong，No. ZR2011CM035； National Natural Science Foundation of China，No. 31502156； Science and Technology Development Project of Shandong，No. 2013GHY11526； and the National Flatfish Industry System Construction Programme，No. nycytx-50-G03］

大菱鲆（Scophthalmus maximus）20世紀(jì)90年代初由歐洲引入中國(guó)，目前已經(jīng)成為中國(guó)北方重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類［8］。近年對(duì)大菱鲆的研究比較多集中在溫度和鹽度對(duì)魚(yú)體影響等方面［9-10］，國(guó)外有關(guān)大菱鲆三倍體誘導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)，大菱鲆三倍體性腺的確不能正常發(fā)育，且一齡以上三倍體生長(zhǎng)顯著快于二倍體（P＜0.05）［11］，因而進(jìn)行其三倍體育種研究具有實(shí)用價(jià)值。大菱鲆四倍體研究目前僅有本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的誘導(dǎo)報(bào)道［12］，通過(guò)靜水壓法獲得了四倍體胚胎及仔魚(yú)。作者擬分析四倍體誘導(dǎo)組受精卵與對(duì)照組受精卵胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞周期相關(guān)基因 cdk1和cdk6的差異表達(dá)，以期為闡述這些基因在四倍體誘導(dǎo)中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步完善鲆鰈魚(yú)及其他海水魚(yú)類四倍體誘導(dǎo)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

進(jìn)行相關(guān)基因克隆和組織表達(dá)的樣品，取自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所水族樓常規(guī)培育的大菱鲆，培育條件為： 每天換水2次，并吸底排污2次，投喂適口商業(yè)餌料2次； 水溫變化范圍為15～25℃，pH為7.8～8.2，鹽度30，DO＞5 mg/L。大菱鲆樣品全長(zhǎng)13～14.5 cm，共6尾。解剖取其心臟、肝臟、脾臟、鰓、頭腎、腎臟、腦、眼、肌肉、腸、胃和性腺組織，立即置于液氮中速凍，然后在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

大菱鲆四倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)在山東威海圣航水產(chǎn)科技有限公司進(jìn)行，經(jīng)控光控溫培育，選取性腺發(fā)育成熟的雄魚(yú)和雌魚(yú)，分別人工擠出精卵后，進(jìn)行半干濕法授精。受精卵在15.3±0.3℃海水中孵育，取大部分受精卵進(jìn)行靜水壓誘導(dǎo)處理，其余少部分受精卵作為對(duì)照組。四倍體誘導(dǎo)條件為： 第一次卵裂前15 min以67.5 MPa靜水壓處理6 min［12］，處理后與對(duì)照組在相同條件下孵育。在多胞期至出膜期的各發(fā)育階段，誘導(dǎo)組與對(duì)照組分別取約 200粒胚胎置于0.5 mL RNA-Solv Reagent（Omega Bio-tek，美國(guó)）中，液氮暫時(shí)保存后轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱，用于RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

1.2 Cdk1、cdk6基因克隆及序列分析

取上述大菱鲆各組織，按照 RNA-Solv Reagent說(shuō)明書(shū)抽提總RNA，通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整度和純度，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。取 1 μg總 RNA經(jīng)過(guò)Dnase1（TAKARA，日本）消化處理，用 M-MLV Reverse Transcriptase（Promage，美國(guó)）反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一鏈模板20 μL，儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆?。并用SMARTer RACE cDNA Amplication Kit（Clontech，美國(guó)）完成3′/ 5′RACE cDNA模板構(gòu)建。

根據(jù)GenBank獲得已知魚(yú)類cdk1、cdk6的基因序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（表1），以大菱鲆性腺和腎臟cDNA為模板通過(guò)PCR反應(yīng)（2xEs Taq MasterMix 25 μL，ddW 19 μL，Primer-F（10 μmol/L） 2 μL，Primer-R（10 μmol/L）2 μL，cDNA 2 μL）擴(kuò)增它們的保守序列，cdk1 PCR程序： 94℃預(yù)變性5 min； 94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)； 72℃再延伸5 min； cdk6 PCR程序除退火溫度為55℃、35個(gè)循環(huán)外，其余條件相同。PCR產(chǎn)物用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，經(jīng)Gel Extraction Kit（OMEGA，美國(guó)）純化，連接、轉(zhuǎn)化，并經(jīng)藍(lán)白斑篩選和 PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆菌株送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。根據(jù)獲得的cdk1、cdk6保守片段設(shè)計(jì)3′和5′RACE特異性引物（表1）。使用SMART RACE cDNA Amplification Kit擴(kuò)增兩基因cDNA的3′和5′端序列。PCR反應(yīng)條件為： 94℃變性30 s； 68℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物按照上述同樣方法純化、連接轉(zhuǎn)化、檢測(cè)、測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上Blast比對(duì)，使用 BioEdit 進(jìn)行拼接，獲得 cDNA全長(zhǎng)序列。設(shè)計(jì)特異性引物（表 1），進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證。根據(jù)cDNA序列，用BioEdit軟件翻譯cdk1、cdk6基因的氨基酸序列，并用DNAMA進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建是采用軟件ClustalX 和MEGA5結(jié)合GenBank上各物種的cdk1、cdk6氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)聚類分析而完成的。

1.3 Cdk1、cdk6表達(dá)分析

1.3.1 組織表達(dá)分析

利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），通過(guò)RT-PCR分析cdk1、cdk6在大菱鲆12種組織中的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系： 2xEs TaqMasterMix，12.5 μL； H2O，9.5 μL； Primer-F（10 μmol/L），1 μL； Primer-R（10 μmol/L），1 μL； cDNA，1 μL。反應(yīng)條件： 94℃預(yù)變性5 min； 94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)； 72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將電泳檢測(cè)結(jié)果使用Gel-Pro analyzer進(jìn)行灰度分析，并使用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析確定不同組織之間差異的顯著水平。

1.3.2 胚胎發(fā)育階段的表達(dá)分析

cDNA模板取來(lái)自相同親本靜水壓處理組或?qū)φ战M不同時(shí)期胚胎各約50粒，分別按照1.2中的方法提取，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA的第一鏈模板20 μL加RNase-free Water稀釋到30 μL，每個(gè)樣品3次重復(fù)。利用 Primer5.0軟件設(shè)計(jì) Real time RT-PCR特異性引物（表1），用TAKARA TP800熒光定量 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系： SYBR Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），10 μL； RNase-free Water，7.8 μL；Primer-F（10 μmol/L），0.6 μL； Primer-R（10 μmol/L），0.6 μL； cDNA，1 μL。采用3部法程序： 95℃預(yù)變性30 s； 95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線以確保擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性。通過(guò)檢測(cè)SYBR Green熒光染料在PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，記錄每個(gè)PCR反應(yīng)的 Ct值，然后以 β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔct法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。使用 SPSS Statistics 17.0軟件選擇tukey法進(jìn)行單因素方差分析，確定不同發(fā)育階段及誘導(dǎo)組與對(duì)照組之間差異的顯著性水平。

表1 大菱鲆cdk1、cdk6基因克隆、RT-PCR和Real time RT-PCR分析所用引物序列Tab. 1 Primers used in cloning，RT-PCR，and real-time RT-PCR of Scophthalmus maximus cdk1 and cdk6 genes

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大菱鲆cdk1、cdk6 cDNA序列及氨基酸同源性分析

通過(guò)基因克隆和全長(zhǎng)驗(yàn)證，獲得了大菱鲆cdk1、cdk6基因的cDNA全長(zhǎng)序列。cdk1基因cDNA全長(zhǎng)1281 bp（KP339306），編碼區(qū)長(zhǎng)度為 912 bp，編碼一條含 303個(gè)氨基酸的蛋白。保守結(jié)構(gòu)域搜索發(fā)現(xiàn)了STKc-CDK1-euk結(jié)構(gòu)域，屬于PKc-like超家族的一員。通過(guò)Compute pI/MW在線軟件分析等電點(diǎn)pI為8.30，相對(duì)分子質(zhì)量為34591.15。大菱鲆CDK1氨基酸序列具有高度保守性，與銀鱈魚(yú)（Anoplopoma fimbria，ACQ58326.1）相似度最高達(dá)到 96%，與人類（Homo sapiens，NP_001777.1）相似度為81%。由氨基酸比對(duì)（圖 1 A）和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1 B）可以看出其與魚(yú)類的先聚在一起，然后再與其他物種聚在一起。

大菱鲆cdk6基因cDNA全長(zhǎng)1400 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為978 bp，編碼一條含325個(gè)氨基酸的蛋白，也發(fā)現(xiàn)了STKc-CDK6-euk結(jié)構(gòu)域，同屬PKc-like超家族的一員。其等電點(diǎn)pI為5.62，相對(duì)分子量為36632.9。大菱鲆 CDK6氨基酸序列具有高度保守性，和亞馬遜帆鰭鱸（Poecilia formosa，XP_007547583.1）相似度最高達(dá)到 98%，與人相似度為 85%。由氨基酸比對(duì)（圖2 A）和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2B）可以看出，其與魚(yú)類的相似性較高，與高等脊椎動(dòng)物的相似性較低。

圖1 大菱鲆cdk1基因氨基酸序列、結(jié)構(gòu)及同源性分析Fig. 1 Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequences of Scophthalmus maximus cdk1

2.2 Cdk1、cdk6基因在大菱鲆各組織中的表達(dá)

Cdk1和cdk6基因在各組織中RT-PCR表達(dá)和電泳圖灰度分析如圖3所示。Cdk1基因在各組織中廣泛表達(dá)，性腺中表達(dá)量最高，在腎臟、頭腎中表達(dá)量次之，腦、眼睛和肌肉中表達(dá)量較低。大菱鲆 cdk6基因整體表達(dá)量較 cdk1低，在各個(gè)組織中也都有表達(dá)，性腺中表達(dá)量最高，在肝臟、腦、眼等組織中的表達(dá)量較低。

圖2 大菱鲆cdk6基因氨基酸序列、結(jié)構(gòu)及同源性分析Fig. 2 Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequences of Scophthalmus maximus cdk6

2.3 靜水壓處理后cdk1、cdk6在胚胎發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)

實(shí)驗(yàn)中所獲得的靜水壓處理組大菱鲆胚胎的四倍體誘導(dǎo)率（四倍體分裂相數(shù)/總分裂相數(shù)×100%）在70%～90%。

圖3 大菱鲆cdk1和cdk6組織差異表達(dá)Fig. 3 Cdk1 and cdk6 expression patterns in 12 tissues of Scophthalmus maximus

大菱鲆胚胎cdk1基因Real time RT-PCR表達(dá)如圖4所示。對(duì)照組中，多胞期到原腸后期均較高水平表達(dá)，神經(jīng)胚期表達(dá)量降低，其后表達(dá)量相對(duì)較低。靜水壓處理組具有相同的總趨勢(shì)，高囊胚、原腸早期表達(dá)量相對(duì)較高，神經(jīng)胚以后處于穩(wěn)定的低表達(dá)狀態(tài)。在高表達(dá)階段，對(duì)照組變化幅度較大，靜水壓處理組變化較小； 在高囊胚、原腸早期，對(duì)照組的表達(dá)水平顯著高于處理組（P ＜ 0.05）（圖4）。

圖4 大菱鲆cdk1基因在對(duì)照組和靜水壓處理組不同發(fā)育時(shí)期胚胎差異表達(dá)Fig. 4 The expression levels of cdk1 in Scophthalmus maximus embryos at different stages with hydrostatic pressure treatment

Cdk6基因Real time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，對(duì)照組多胞期到低囊胚期表達(dá)量較低，原腸早期表達(dá)量明顯升高，原腸中期達(dá)到最高水平，隨后原腸后期至克氏囊期表達(dá)量下降，直至出膜前期持續(xù)下降，出膜期時(shí)最低。靜水壓處理組的總體變化趨勢(shì)與對(duì)照組相同，也是在原腸期至神經(jīng)胚期表達(dá)量較高，但總體上較對(duì)照組低，在原腸早、中期顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖5）。

3 討論

3.1 大菱鲆cdk1和cdk6基因的序列結(jié)構(gòu)及組織表達(dá)差異

Cdk1、cdk6是編碼細(xì)胞周期蛋白依賴激酶的重要基因，其編碼蛋白CDK1和CDK6在細(xì)胞周期各時(shí)相的轉(zhuǎn)化中起重要作用。CDK1通過(guò)磷酸化一些功能蛋白而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程［13］。大菱鲆cdk1氨基酸序列具有高度保守性，含有STKc-CDK1-euk結(jié)構(gòu)域，屬于PKC-like超家族的一員，也具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族特征序列 DLKPQN和 G/V-T/S-X-XY/F-X-A-P-E、CDK1活性相關(guān)的 3個(gè)磷酸化位點(diǎn)T14、Y15、T161，以及與cyclin B結(jié)合位點(diǎn)保守序列 PSTAIRE和與 ATP結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)保守序列GXGXXG和K33。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，CDK6是G1期重要的調(diào)控因子，它與 cyclinD結(jié)合形成復(fù)合物，在細(xì)胞周期蛋白依賴激酶活化激酶的協(xié)同作用下，使下游的 pRb磷酸化，從而解除對(duì)轉(zhuǎn)錄因子 E2F-1的抑制效應(yīng)，啟動(dòng)DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞增殖［14］。大菱鲆 cdk6氨基酸序列和其他魚(yú)類的高度保守，也含有絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶家族特征序列ADFGLARIYSFQMALTSVVVTLW，還有與 cyclin結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的保守序列 EEGM、SHR和 RIYSFQMALT以及與 ATP結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的保守序列GXGXXG和K32。

作者的組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，大菱鲆cdk1和cdk6基因組織表達(dá)具有相似性，在心臟、肝臟、脾臟等組織中均有不同程度的表達(dá)，但 cdk6表達(dá)量要略低于cdk1。兩基因在腦、眼、肌肉中表達(dá)量都較低，性腺中表達(dá)量最高，分析可能與所取魚(yú)體的性腺正處于快速生長(zhǎng)發(fā)育期有關(guān)。這與大黃魚(yú)（Larimicthys crocea）［15］、虹鱒［16］的 cdk1結(jié)果類似，各個(gè)組織中也均檢測(cè)到其表達(dá)，且在性腺中表達(dá)量最高。在以往的人類研究中 cdk6在不同種類細(xì)胞中也都有表達(dá)，正常組織中的表達(dá)量較癌癥組織中低［17］。即這兩個(gè)基因在細(xì)胞分裂旺盛的組織中表達(dá)較高，可作為參考說(shuō)明細(xì)胞的分裂情況。

圖5 大菱鲆cdk6基因在對(duì)照組和靜水壓處理組胚胎發(fā)育中的差異表達(dá)Fig. 5 The expression levels of cdk6 in Scophthalmus maximus embryos at different stages with hydrostatic pressure treatment

3.2 大菱鲆胚胎cdk1和cdk6基因的表達(dá)特點(diǎn)以及靜水壓處理對(duì)基因表達(dá)的影響

經(jīng)靜水壓處理，作者獲得了四倍體誘導(dǎo)率較高（70%～90%）的大菱鲆胚胎。對(duì)照組中檢測(cè)大菱鲆cdk1基因在多胞期、囊胚期、原腸期表達(dá)量較高，這與胚胎發(fā)育過(guò)程中的生理特點(diǎn)密不可分，多胞期后細(xì)胞向四周擴(kuò)散，在原腸作用下進(jìn)行有規(guī)律的定向遷移、排列和分化形成胚層。這些時(shí)期胚胎發(fā)育速度快，細(xì)胞處于高速生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有絲分裂旺盛，需要大量 CDK1對(duì)有絲分裂進(jìn)程進(jìn)行調(diào)控。在神經(jīng)胚期以后 cdk1表達(dá)量處于相對(duì)穩(wěn)定的低水平，這與該時(shí)期細(xì)胞分化程度增加、遷移減慢和細(xì)胞分化程度低有關(guān)。靜水壓處理后，檢測(cè) cdk1基因的轉(zhuǎn)錄水平在胚胎發(fā)育過(guò)程中的變化趨勢(shì)與正常大菱鲆二倍體相同，且四倍體誘導(dǎo)組中的表達(dá)量略低于對(duì)照組的，也就是說(shuō)水靜壓對(duì)其細(xì)胞分裂可能有一定的抑制作用。而在不同倍性鯽鯉魚(yú)（紅鯽（Carassius auratus red. Var）和湘江野鯉（Cyprinus carpio）雜交后代異源四倍體鯽鯉（allotetraploids hybrids）、雄性異源四倍體鯽鯉與雌性二倍體日本白鯽 （Carassius auratuscuvieri）交配產(chǎn)生三倍體湘云鯽（allotriploid crucian carp）、紅鯽）卵巢中，cdk1基因的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)隨倍性的遞增而依次升高［18］。兩者結(jié)果不同，分析其原因可能是，在胚胎發(fā)育早期cdk1表達(dá)受到多種因子的調(diào)控并不因倍性增加而增加 cdk1的轉(zhuǎn)錄水平，抑或是如前所述水靜壓會(huì)減緩其細(xì)胞分裂引起的，但這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。關(guān)于cdk1基因功能研究在哺乳類中較深入，小鼠胚胎發(fā)育早期 cdk1基因缺失會(huì)引起胚胎死亡，推測(cè)其在胚胎發(fā)育中有重要作用［19］。通過(guò)shRNA技術(shù)低表達(dá) cdk1使阻塞 G2/M 轉(zhuǎn)換可誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞凋亡［20］。研究表明，惡性腫瘤 cdk1的表達(dá)量一般高于正常組織，揭示 cdk1表達(dá)受細(xì)胞分化狀態(tài)影響，大菱鲆胚胎發(fā)育早期細(xì)胞分化程度低時(shí)cdk1表達(dá)量較高，也提示其與細(xì)胞分化狀態(tài)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組cdk6基因表達(dá)量在早期處于較低水平，在原腸早期突然升高，原腸中期達(dá)到最高，后期開(kāi)始緩慢下降。如前所述，CDK6是G1期調(diào)控的重要因子，通過(guò)一系列誘導(dǎo)可以啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞增殖［21］。故大菱鲆原腸期高表達(dá)cdk6與旺盛的細(xì)胞分裂密切相關(guān)。靜水壓處理組胚胎cdk6在發(fā)育過(guò)程中的變化趨勢(shì)與對(duì)照組基本一致，但總體上較低，特別在原腸期的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組。Cdk6主要集中在哺乳動(dòng)物和人類癌癥的相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn)cdk6具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、影響血細(xì)胞功能、影響特定細(xì)胞的分化等多種功能。當(dāng) CDK6的活性受到抑制或下降，能阻止細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換［22］。在小鼠ES細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化后cdk6表達(dá)水平明顯下調(diào)，通過(guò) siRNA技術(shù)沉默 cdk6基因，發(fā)現(xiàn)未分化相關(guān)基因明顯下調(diào)，而分化相關(guān)基因明顯上調(diào)，揭示 cdk6基因表達(dá)與細(xì)胞未分化狀態(tài)密切相關(guān)［23］。關(guān)于cdk6基因在魚(yú)類及其多倍體中都未見(jiàn)報(bào)道，大菱鲆靜水壓處理組 cdk6表達(dá)量降低的原因是否是由于水靜壓減緩其細(xì)胞分裂引起的，還需要進(jìn)一步研究探討。

在天然多倍體和成功獲得成熟個(gè)體人工多倍體中基因表達(dá)的相關(guān)研究中僅見(jiàn)多倍體生長(zhǎng)以及性別相關(guān)基因的研究。靜水壓誘導(dǎo)染色體加倍機(jī)制在細(xì)胞水平上是靜水壓處理早期胚胎破壞細(xì)胞內(nèi)紡錘體結(jié)構(gòu)抑制有絲分裂而形成［24］。在分子水平上細(xì)胞周期蛋白基因cdk1和cdk6在細(xì)胞周期中起到重要的調(diào)控作用，染色體完成加倍后細(xì)胞進(jìn)入周期性有絲分裂，基因表達(dá)水平直接影響加倍胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。在細(xì)胞周期中cdk1和 cdk6同樣起到重要的調(diào)控作用，但在大菱鲆胚胎發(fā)育中的變化趨勢(shì)不同，并且靜水壓處理后變化趨向亦不同。在多胞期、囊胚期、原腸期胚胎細(xì)胞分化程度低，cdk1高表達(dá)，不同的是cdk6在多胞期和囊胚期表達(dá)量較低，說(shuō)明cdk6表達(dá)量和細(xì)胞未分化程度不是簡(jiǎn)單的正相關(guān)，還具有更復(fù)雜的關(guān)系。在靜水壓處理后cdk1基因在早期胚胎各時(shí)期中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)或低表達(dá)現(xiàn)象，而 cdk6基因表達(dá)在處理后各個(gè)發(fā)育時(shí)期低表達(dá)，故兩個(gè)基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中可能有不同的作用機(jī)制，由此對(duì)靜水壓作用的響應(yīng)機(jī)制也不同，但尚需深入研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Myers J M. Tetraploid induction in Oreochromis spp.［J］. Aquaculture，1986，57： 281-287.

［2］ 馬濤，朱才寶，朱秉仁. 熱休克誘導(dǎo)虹鱒四倍體［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2005，11（4）： 329-336. Ma Tao，Zhu Caibao，Zhu Bingren. Tetraploid of rainbow trout （Salmo gairdneririchardson） induced by heat shocks［J］. Acta Hydrobiologica Sinica，2005，11（4）：329-336.

［3］ Peruzzi S，Chatain B. Induction of tetraploid gynogenesis in the European sea bass （Dicentrarbus labrax L.）［J］. Genetica，2003，119： 225-228.

［4］ Long Y，Tao M，Liu S J，et al. Differential expression of Gnrh2，Gthβ，and Gthr genes in sterile triploids and fertile tetraploids［J］. Cell and Tissue Research，2009，338（1）： 151-159.

［5］ 桂建芳，肖武漢. 靜水壓休克誘導(dǎo)水晶彩鯽三倍體和四倍體的細(xì)胞學(xué)機(jī)理初探［J］. 水生生物學(xué)報(bào)，1995，19（1）： 49-55. Gui Jianfang，Xiao Wuhan. Preliminary study on the cytological mecha-nism of triploidy and tetraploidy induced by hydrostatic pressure shock in tra-nsparent colored crucian carp［J］. Acta Hydrobiologica Sinica 1995，19（1）49-55.

［6］ Kishimoto T. Cell-cycle control during meiotic maturation［J］. Current Opinion in Cell Biology，2003，15：654-663.

［7］ Donjerkovic D，Scott D W. Regulation of the G1 phase of the mammalian cell cycle［J］. Cell Research，2000，10（1）： 1-16.

［8］ 申雪艷，宮慶禮，雷霽霖，等. 進(jìn)口大菱鲆苗種的遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］. 海洋與湖沼，2004，35（4）： 332-341. Shen Xueyan，Gong Qingli，Lei Jilin，et al. Population genetic structure analysis of the imported turbot seedlings Scophthalmus maximus using RAPD and microsatellite technique［J］. Oceanologia et Limnologia Sinica，2004，35（4）： 332-341.

［9］ 紀(jì)利芹，蔣克勇，韓龍江，等. 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆成魚(yú)代謝機(jī)能的影響［J］. 海洋科學(xué)，2014，38（5）： 46-53. Ji Liqin，Jiang Keyong，Han Longjiang，et al. Effect of continuous cooling on metabolic function of adult Scophthalmus maximus［J］. Marine Sciences，2014，38（5）： 46-53.

［10］ 王新安，郭黎，馬愛(ài)軍，等. 基于響應(yīng)面法分析溫度和鹽度及其交互作用對(duì)大菱鲆幼魚(yú)抗氧化酶活性的影響［J］. 海洋科學(xué)，2014，38（6）： 17-23. Wang Xinan，Guo Li，Ma Aijun，et al. Effects of temperature，salinity and their interaction on the activities of antioxidant enzymes of juvenile turbot Scophthalmus maximus based on response surface methodology［J］. Marine Sciences，2014，38（6）： 17-23.

［11］ Cal R M，Vidal S，Gómez C，et al. Growth and gonadal development in diploid and triploid turbot （Scophthalmus maximus）［J］. Aquaculture，2006，251： 99-108.

［12］ 吳志昊，尤鋒，宋宗誠(chéng)，等. 大菱鲆四倍體的人工誘導(dǎo)研究［J］. 海洋與湖沼，2014，45（3）： 657-662. Wu Zhihao，You Feng，Song Zongcheng，et al. Induction of tetraploid in turbot Scophthalmus maximus［J］. Oceanologia Et Limnologia Sinica，2014，45（3）： 657-662.

［13］ Nurse P，Thuriaux P. Regulatory genes controlling mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe［J］. Genetics，1980，96（3）： 627-637.

［14］ Rivadeneira D B，Mayhew C N，Thangavel C，et al. Proliferative suppression by CDK4/6 inhibition： complex function of the retinoblastoma pathway in liver tissue and hepatoma cells［J］. Gastroenterology，2010，138（5）： 1920-1930.

［15］ 蔡明夷，周鵬，韓坤煌，等. 大黃魚(yú) cyclinB1和cdc2cDNA序列特征及組織表達(dá)分析［J］. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版，2014，53（1）： 132-141. Cai Mingyi，Zhou Peng，Han Kunhuang，et al. Characterization and tissue expression profiles of cyclin B1 and Cdc2 in large yellow croaker（Larimichthys crocea） ［J］. Journal of Xiamen University （Natural Science），2014，53（1）： 132-141.

［16］ Qiu G F，Ramachandra R K，Rexroad C E，et al. Molecular characterization and expression profiles of cyclin B1，B2 and Cdc2 kinase during oogenesis and spermatogenesis in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）［J］. Animal Reproduction Science，2008，105（3）：209-225.

［17］ Grossel M J，Hinds P W. From cell cycle to differentiation： an expanding role for cdk6［J］. Cell Cycle，2006，5（3）： 266-270.

［18］ 曾琛，陶敏，劉少軍，等. 不同倍性魚(yú) cdc2基因cDNA 部分序列的克隆及其在卵巢中的表達(dá)分析［J］.湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29（3）： 73-76. Zeng Chen，Tao Min，Liu Shaojun，et al. Comparative analysis of transcriptional level in ovaries with different ploidy level［J］. Journal of Natural Science of Hunan Normal University，2006，29（3）： 73-76.

［19］ Santamara D，Barrire C，Cerqueira A，et al. Cdk1 is sufficient todrive the mammalian cell cycle［J］. Nature，2007，448（ 7155） ： 811-815.

［20］ Xi Q，Huang M，Wang Y，et al. The expression of CDK1 is associated with proliferation and can be a prognostic factor in epithelial ovarian cancer［J］. Tumor Biology，2015： 1-10.

［21］ Cole A M，Myant K，Reed K R，et al. Cyclin D2- cyclin-dependent kinase 4/6 is required for efficient proliferation and tumorigenesis following Apc loss［J］. Cancer Research，2010，70（20）： 8149-8158.

［22］ Hu M G，Deshpande A，Enos M，et al. A requirement for cyclin-dependent kinase 6 in thymocyte development and tumorigenesis［J］. Cancer Research，2009，69（3）： 810-818.

［23］ 王娟娟，劉會(huì)賢，侯杰，等. Cdk6在維持ES細(xì)胞自我更新中的作用［J］. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012，28（10）： 958-965. Wang Juanjuan，Liu Huixian，Hou Jie，et al. The role of Cdk6 in maintaining the self-renewal state of ES cells［J］. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2012，28（10）： 958-965.

［24］ Zhang X，Onozato H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one［J］. Aquaculture，2004，240（1）： 101-113.

（本文編輯： 譚雪靜）

中圖分類號(hào)：Q75

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3096（2016）04-0011-11

doi：10.11759/hykx 20150726003

收稿日期：2015-07-26； 修回日期： 2015-10-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家863計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012AA10A402）； 山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2011CM035）； 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31502156）； 山東省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013GHY11526）； 鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系課題（NYCYTX-50-G03）

作者簡(jiǎn)介：郭佳偉（1991-），女，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事海水魚(yú)類分子細(xì)胞學(xué)研究，E-mail： guojiawei51@126.com； 朱香萍，通信作者，副教授，E-mail： zhuxp980216@163.com； 尤鋒，通信作者，研究員，E-mail： youfeng@qdio.ac.cn整個(gè)過(guò)程，分為G1、S、G2和M期4個(gè)時(shí)相。細(xì)胞周期進(jìn)程的實(shí)現(xiàn)有賴于各級(jí)調(diào)控因子對(duì)細(xì)胞周期精確而嚴(yán)密的調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶 CDKs對(duì)細(xì)胞周期不同時(shí)相的推進(jìn)和轉(zhuǎn)化有重要作用。其中，CDK1（又稱p34CDC2、cdc2）在精母/卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、G1/S和G2/M轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用［6］，而CDK6是一種多功能的蛋白，在生長(zhǎng)因子刺激下，與Cyclin D結(jié)合，促使細(xì)胞進(jìn)入S期，反之細(xì)胞周期停滯于G1期［7］。

Cloning and expression analysis of cdk1 and cdk6 in Scophthalmus maximus

GUO Jia-wei1，ZHU Xiang-ping1，WU Zhi-hao2，SONG Zong-cheng3，F(xiàn)AN Zhao-fei2，4，TAN Xun-gang2，YOU Feng2
（1. Animal Science and Technology Department，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2. Key Laboratory of Experimental Marine Biology，Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Laboratory for Marine Biology and Biotechnology，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266071，China； 3. Shenghang Aquatic Science and Technology Co.，Ltd.，Weihai 264200，China； 4. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Received： Jul. 26，2015

Key words：Scophthalmus maximus； cdk1 and cdk6； cloning； tissue； embryo； hydrostatic pressure treatment； RT-PCR

Abstract：Whole cDNA sequences of cyclin-dependent protein kinase genes （cdk1 and cdk6） in turbot （Scophthalmus maximus） were sequenced using homologous cloning and 5＇/3＇-RACE. The open reading frames of cdk1 and cdk6 were 912 bp （GenBank accession number，KP339306） and 978 bp （GenBank accession number，KT186374），respectively. Gene expression in turbot tissues was analyzed using RT-PCR. The results showed that both cdk1 and cdk6 were widely expressed in several turbot tissues. cdk1 expression levels were higher in the gonads and kidneys than in other organs，and cdk6 expression level was the highest in the gonads. cdk1 and cdk6 expression levels in turbot embryos were studied using real-time RT-PCR. In the control group，cdk1 expression levels were higher at the gastrula stage and earlier compared to those at the neurula stage and later，and cdk6 expression level at the gastrula stage was the highest. Trend variation pertaining to cdk1 and cdk6 expression levels in the hydrostatic pressure treatment group （tetraploid induction group）was similar to that in the control group，except for the expression level，which was lower in the treatment group than in the control group. Hydrostatic pressure treatments had different effects on cdk1 and cdk6 expression levels，suggesting cdk1 and cdk6 in turbot to have different functions. The above results could provide a basis for the analysis of functions and mechanisms of the two genes in turbot embryo development.