鐘英英++黃禧擎++凌秋萍++羅鈺沁+羅思成++梁瓊鋒

摘要：以葡萄的葉片、葉柄及莖段誘導(dǎo)的愈傷組織為試驗(yàn)材料，考察紫外線照射、硝酸銀處理和雜菌污染對(duì)其愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響。結(jié)果表明：經(jīng)硝酸銀處理的愈傷組織中白藜蘆醇含量隨處理濃度的提高呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，在濃度為10 mg/L時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最大；經(jīng)紫外線照射的愈傷組織中白藜蘆醇含量隨照射時(shí)間的延長先增加后減少，莖段與葉片經(jīng)紫外線照射3 min后白藜蘆醇的含量最高，而葉柄經(jīng)紫外處理5 min后白藜蘆醇的含量最高。染菌的愈傷組織中白藜蘆醇含量也明顯高于對(duì)照。因此，在所試驗(yàn)的范圍內(nèi)提高葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量，硝酸銀的適宜濃度為10 mg/L，紫外線照射時(shí)間為3～5 min，另外雜菌感染也有助于葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量的提高。

關(guān)鍵詞：葡萄；愈傷組織；白藜蘆醇；硝酸銀；紫外線輻照

中圖分類號(hào)： S663.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0406-02

收稿日期：2015-04-20

基金項(xiàng)目：國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃；廣西壯族自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃。

作者簡介：鐘英英（1979—），女，廣西柳州人，碩士，講師，主要從事天然產(chǎn)物提取及利用方面的研究。Tel：（0772）2687033；E-mail：mininetzhkitty@126.com。白藜蘆醇是最先在葡萄屬植物中發(fā)現(xiàn)的一種抗逆性物質(zhì)，是植物體在惡劣環(huán)境下或遇到病原微生物侵害時(shí)自身分泌的一種抗毒素。目前，可提取白藜蘆醇的原料主要來自葡萄、虎杖、桑樹、花生等植物，在葡萄屬植物中含量最高，由于其具有抗氧化、抗癌、保護(hù)心血管等作用而備受關(guān)注[1-2]。目前白藜蘆醇的提取主要依靠葡萄皮、虎杖等[2-3]，要滿足白藜蘆醇日益增長的市場需要，需要消耗大量的原料，對(duì)環(huán)境及野生資源的破壞很大。而利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有成本低、周期短、不破壞自然資源、不受季節(jié)限制等優(yōu)勢，為白藜蘆醇生產(chǎn)提供了新途徑。本試驗(yàn)研究AgNO3和紫外光照對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇積累的影響，以期找到從葡萄愈傷組織中提取白藜蘆醇的最佳條件，為葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的大規(guī)模生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用的葡萄葉柄、莖段和葉片等材料取自當(dāng)?shù)仄咸褕@；白藜蘆醇對(duì)照品購于四川成都曼斯特生物科技公司；MS培養(yǎng)基、NAA、6-BA等均購自浙江臨安木木生物有限公司。

1.2方法

1.2.1葡萄愈傷組織的培養(yǎng)選取無病害葡萄葉柄、葉片和莖段，用低濃度的洗衣粉浸泡30 min，在無菌超凈臺(tái)下，用75%乙醇消毒30 s，用1% NaClO3 浸泡1～2 min，再用無菌蒸餾水沖洗數(shù)次；將葉片剪成約0.5 cm×0.5 cm的片段，葉柄、莖段則切成0.3～0.5 cm長的小段，接種于MS培養(yǎng)基（含 2 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA，pH值為5.8）中，（26±1） ℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，每個(gè)月繼代培養(yǎng)1次。

1.2.2不同濃度的AgNO3處理將繼代培養(yǎng)的愈傷組織分別轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為0、1、10、30 mg/L AgNO3的繼代培養(yǎng)基MS（2 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA，pH值5.8）中，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，（26±1） ℃繼續(xù)進(jìn)行暗培養(yǎng)30 d備用。

1.2.3紫外光處理將繼代培養(yǎng)的愈傷組織在紫外燈下分別照射0、1、3、5、10、15 min，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，照射后繼續(xù)在（26±1） ℃暗培養(yǎng)30 d備用。

1.2.4染菌處理將繼代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至有培養(yǎng)基的廣口瓶后敞開20 min，然后繼續(xù)蓋上，（26±1） ℃暗培養(yǎng)30 d備用。同時(shí)，用正常培養(yǎng)的愈傷組織作對(duì)照，處理和對(duì)照均進(jìn)行9次重復(fù)。

1.2.5白藜蘆醇含量的測定（1）白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。精確稱取2.0 mg白藜蘆醇對(duì)照品，用甲醇在10 mL容量瓶中混勻，定容得到0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將其稀釋至質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16 ug/mL的溶液。以濃度為0作空白，用紫外可見分光光度計(jì)在306 nm處分別測出各濃度的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

（2）白藜蘆醇提取及含量計(jì)算。將愈傷組織烘至恒質(zhì)量，研磨至粉后，精確稱取2.000 g，轉(zhuǎn)移至50 mL圓底燒瓶中，以料液比為1 g ∶ 20 mL加入70%甲醇，60 ℃恒溫回流提取2 h。之后將所得溶液進(jìn)行真空抽濾，洗滌2次，合并洗滌液和濾液，記錄體積，取2 mL樣品加70%甲醇至10 mL，用紫外可見分光光度計(jì)在306 nm處分別測出各提取液的吸光度，按照下式計(jì)算白藜蘆醇的含量（mg/g）：

白藜蘆醇含量=C×V×D/（103×m）。

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品液吸光度對(duì)應(yīng)的白藜蘆醇的濃度，μg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；m為樣品稱取的質(zhì)量，g；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不同組織來源的愈傷組織中白藜蘆醇含量的單向方差分析以及染菌與對(duì)照樣本的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，均用SPSS 20.0進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

由“1.2.5”節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，得到回歸方程為y=0.142 8x+0.137 2，r2=0.996 1，表明白藜蘆醇濃度在2～16 μg/mL 間呈線性關(guān)系（圖1）。

2.2AgNO3濃度對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇含量的影響

由圖2可知，隨AgNO3濃度的提高，白藜蘆醇含量呈先上升后又逐漸下降的趨勢，這與張真等的研究結(jié)果[4]類似。當(dāng)AgNO3濃度為10 mg/L時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)最大，此時(shí)莖段、葉片和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別為2669、2.926、3.011 mg/g，均明顯高于未處理的 1.562、1786、1.159 mg/g；但隨著AgNO3濃度的升高，白藜蘆醇含量開始下降，當(dāng)AgNO3濃度達(dá)到30 mg/L時(shí)，莖段、葉片和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別下降至 1.230、1238、1063 mg/g。因此，濃度低于10 mg/L的AgNO3能夠促進(jìn)白藜蘆醇的生成，而濃度超過10 mg/L的AgNO3則會(huì)抑制其積累。

白藜蘆醇是植物在惡劣環(huán)境下或遇到病原微生物侵害時(shí)自身產(chǎn)生的一種抗逆性物質(zhì)。低濃度銀離子存在時(shí)，植物體可能為了消除銀離子的傷害，從而刺激生物體合成更多的抗逆性物質(zhì)[5]。當(dāng)硝酸銀濃度過高時(shí)，則可能會(huì)使細(xì)胞受到毒害，抑制白藜蘆醇的生成。其中的原因可能是離體植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生并積累乙烯，Ag+通過競爭性結(jié)合細(xì)胞膜上的乙烯受體蛋白，抑制乙烯的活性，繼而抑制愈傷組織形成[6]。另外，重金屬脅迫可能導(dǎo)致活性氧自由基在植物細(xì)胞內(nèi)增多，其強(qiáng)氧化性對(duì)許多生物功能分子造成破壞，從而使細(xì)胞的生長受到影響[4]。

2.3紫外線照射對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇含量的影響

如圖3所示，隨著紫外線照射時(shí)間的延長，葡萄不同組織誘導(dǎo)的愈傷組織中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)先上升隨后又逐漸下降的趨勢。經(jīng)紫外光輻射3～5 min的愈傷組織中，白藜蘆醇含量較高。其中，莖段和葉片誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)輻照3 min后白藜蘆醇的含量最高，達(dá)到2.543、2.180 mg/g，分別為對(duì)照組（莖段1.562 mg/g，葉片1.786 mg/g）的1.63、1.22倍；葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織則在輻照5 min處理組中的白藜蘆醇含量最高（1.446 mg/g），為對(duì)照組（1.159 mg/g）的1.25倍。但當(dāng)輻照時(shí)間超過15 min時(shí)，葡萄愈傷組織中的白藜蘆醇含量均低于對(duì)照，莖段、葉片、葉柄來源的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別比對(duì)照下降了11.7%、41.8%、11.3%，葉片誘導(dǎo)的愈傷組織受到的影響最大。

白藜蘆醇為芪類次生代謝物，芪合酶（stilbene synthase， STS）是白藜蘆醇生物合成過程中的關(guān)鍵酶[6-7]。Fritzemeier等發(fā)現(xiàn)，紫外光照射可顯著提高葡萄葉片的STS 活性，與白藜蘆醇生物合成相關(guān)的另外2種酶（苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸-4-羥化酶）也同時(shí)被誘導(dǎo)[8]。Bruno等也研究發(fā)現(xiàn)，北美沙地葡萄品種（Vitis rupestris）在紫外誘導(dǎo)2 h后，STS mRNA持續(xù)高水平表達(dá)，白藜蘆醇含量也急劇增加[9]。本研究結(jié)果表明，少于5 min的紫外光照射可提高葡萄愈傷組織中的白藜蘆醇含量。然而，紫外光輻射也是一種環(huán)境脅迫因子，過度照射可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷并影響白藜蘆醇等代謝物的生成。

2.4染菌對(duì)白藜蘆醇含量的影響

從圖4可以看出，正常的愈傷組織中，莖段來源的白藜蘆醇含量最高（9次重復(fù)均值達(dá)到1.95 mg/g），其次為葉片愈傷組織（1.79 mg/g），含量最低的為葉柄愈傷組織（1.51 mg/g），但是不同組織之間的白藜蘆醇含量沒有顯著差異（P>005）。染菌處理后，無論是葉片、葉柄還是莖段來源的愈傷組織中白藜蘆醇含量均顯著高于對(duì)照（葉片P=0007、葉柄P=0.001、莖段P=0.009）。這可能是由于雜菌污染可以作為一種脅迫，可以引發(fā)植物細(xì)胞產(chǎn)生防御性應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，從而激活特定代謝途徑，促使葡萄離體細(xì)胞中白藜蘆醇的積累。已有研究表明，健康葡萄葉片中白藜蘆醇含量大大低于染病的葉片，感染的程度越大葉片中白藜蘆醇含量相對(duì)越高[10]。另外，文濤等發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)可以提高虎杖愈傷組織中的白藜蘆醇含量[11]。本研究結(jié)果表明，染菌可以顯著提高愈傷組織生成白藜蘆醇的量，不同重復(fù)得到的結(jié)果差別偏大可能跟愈傷組織受到感染程度不同有關(guān)。

3結(jié)論

葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的含量隨著AgNO3濃度的增加呈現(xiàn)先上升隨后又逐漸下降的趨勢，當(dāng)其濃度為10 mg/L時(shí)，白藜蘆醇含量最高；而在濃度超過30 mg/L時(shí)，白藜蘆醇積累

受到抑制。葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量隨著紫外線照射時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升隨后又逐漸下降的趨勢。其中，光照 3 min 后莖段與葉片來源的愈傷組織白藜蘆醇含量最高，光照 5 min 后葉柄白藜蘆醇含量最高。但紫外光照超過 15 min，愈傷組織中的白藜蘆醇積累則會(huì)受到抑制。外植體的差異也會(huì)造成愈傷組織中白藜蘆醇含量不同，其中含量從高到低依次為葉片>莖段>葉柄，但無顯著差異。染菌處理可以顯著提高愈傷組織中白藜蘆醇的含量。

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