張文志++魯緋++閆紅

摘要：采用基于SYBR Green探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)PCR方法對(duì)醬油中的大豆轉(zhuǎn)基因靶基因CaMv35S啟動(dòng)子、NOS終止子、EPSPS、18S進(jìn)行了高通量檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)了內(nèi)源參照Lectin基因。研究發(fā)現(xiàn)，醬油樣品中同時(shí)存在CaMv35S、NOS、18S靶基因，而不存在靶基因EPSPS，表明轉(zhuǎn)基因成分EPSPS在食品加工過程中已被降解；熔解曲線分析表明，實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)獲得了很好的特異性，與傳統(tǒng)PCR相比，具有快速、高通量、高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。本研究建立的對(duì)醬油中多種抗草甘膦大豆轉(zhuǎn)基因成分的快速、高通量、高靈敏的定量檢測(cè)方法將在轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：PCR RT-PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)： TS264.2+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0372-05

收稿日期：2015-05-12

作者簡(jiǎn)介：張文志（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)生物學(xué)分析。E-mail：170850483@qq.com。

通信作者：魯緋，博士，研究員。E-mail：lufeilufei515@sina.com。大豆已經(jīng)成為人們生活中不可或缺的食物及食品原料，在我國(guó)用途非常廣泛，消費(fèi)市場(chǎng)上大豆制品種類繁多。我國(guó)是大豆進(jìn)口大國(guó)，根據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，從開放大豆進(jìn)口以來，我國(guó)每年大豆進(jìn)口量逐年增加，到2014年我國(guó)大豆進(jìn)口量已超過7 000萬t，且進(jìn)口大豆中有超過90%為轉(zhuǎn)基因大豆[1-2]。

我國(guó)對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)管工作非常重視。2001年，國(guó)務(wù)院頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，對(duì)大豆、玉米等國(guó)內(nèi)流通的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，規(guī)定了統(tǒng)一的標(biāo)志制度，即確定了食品中轉(zhuǎn)基因成分的最低限標(biāo)準(zhǔn)[3]。然而，在轉(zhuǎn)基因食品飽受爭(zhēng)議的今天，我國(guó)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)控技術(shù)體系依然缺乏。較為落后的檢測(cè)設(shè)備和相關(guān)技術(shù)，使得安全評(píng)價(jià)及審批許可制度缺乏技術(shù)保障[4]，嚴(yán)重制約了我國(guó)對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全監(jiān)管，也嚴(yán)重妨礙了廣大消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性的深入了解[5]。因此，建立可靠、準(zhǔn)確、快速、高通量的食品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法迫在眉睫。

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法主要分為2類：酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[6]和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（polymerase chain reaction，PCR）[7]。分別以蛋白質(zhì)和核酸為檢測(cè)對(duì)象。ELISA目前已有商業(yè)化試劑盒，它通過間接地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分表達(dá)出的蛋白來推測(cè)轉(zhuǎn)基因成分，雖然其具備很好的選擇性，但缺乏定量準(zhǔn)確性，且價(jià)格較為昂貴，樣品前處理復(fù)雜。傳統(tǒng)的PCR方法直接以提取的基因片段為檢測(cè)對(duì)象，靈敏度好，但定量能力較差，且非目標(biāo)片段容易引起信號(hào)的假陽(yáng)性和假陰性。在傳統(tǒng)PCR原理的基礎(chǔ)上，巢式PCR[8]、多重PCR[9]等方法也發(fā)展起來，其選擇性和準(zhǔn)確性得到很大提高，但仍然是半定量的方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR[10]是一種可以特異性靶標(biāo)樣品中的目標(biāo)DNA片段，并輸出該目標(biāo)DNA定量信息新方法，相對(duì)于上述方法，這種方法的定量信息更準(zhǔn)確，方法更加靈敏，因此在大豆轉(zhuǎn)基因制品的檢測(cè)上得到廣泛應(yīng)用[11-13]。SYBR Green是一種常用的結(jié)合雙鏈 DNA 的染料，本身在激發(fā)光下只發(fā)出微弱的熒光，結(jié)合雙鏈DNA后，熒光增強(qiáng)1 000倍，因此常用來對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行定量分析[14]。本研究建立了基于SYBR Green染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，用于高通量分析多種醬油中的大豆轉(zhuǎn)基因成分，希望為轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)志的監(jiān)管體系提供更可靠的技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料試驗(yàn)所用含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆成分的醬油由北京市食品及釀酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)一站提供。

1.1.2主要試劑無水乙醇，異丙醇，70%乙醇（均為分析純）。深加工產(chǎn)品DNA提取試劑盒DP326（天根生化科技有限公司，其中包括GMO1、GMO2、Proteinase K、TE緩沖液）；Carrier RNA（天根生化科技有限公司）。0.1 mol/L Tris-Cl（pH值8.0）；乙酸；EDTA-Na2；ABI熒光染料；2×PCR Reagent（天根生化科技有限公司）；瓊脂糖。

1.1.3主要儀器BIO-RAD CF×96熒光PCR儀；METTLER TOLEDO電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；Eppendorf移液槍（1 000、100、10、2.5 μL）；湘儀TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)；恒溫水浴鍋（恒發(fā)）；渦旋振蕩器；磁力攪拌器；BIO-RAD MJ Mini PCR儀。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1凝膠緩沖液及凝膠的制備凝膠緩沖液：50×TAE溶液：取Tris-HCl 242 g，乙酸 57.1 mL，EDTA-Na2 37.2 g加蒸餾水溶解后定容到1 000 mL。

凝膠：取1.5 g瓊脂糖加入到三角瓶中，加入100 mL稀釋50倍的50×TAE緩沖液，加熱，充分溶解。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳之前，將凝膠加熱熔解后使用。

1.2.2DNA的提取采用試劑盒法，按照深加工產(chǎn)品DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）說明步驟操作。

1.2.2.1醬油樣品預(yù)處理取醬油30 mL，加入60 mL無水乙醇混勻，置冰箱（-20 ℃）放置10 min后，10 000 r/min離心10 min。棄上清。在沉淀中加入30 mL 0.1 mol/L Tris-Cl（pH值8.0）溶液，用力搖勻，全部轉(zhuǎn)移到100 mL燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌2 h。分裝至1.5 mL離心管中，12 000 r/min 離心10 min。棄上清。沉淀中焦糖色素及鹽等小分子已全部去除，可用于DNA提取 （注：棄上清之后要將分裝后所有沉淀取到1個(gè)1.5 mL離心管中，用于后續(xù)DNA的提?。?。

1.2.2.2DNA提取取上述預(yù)處理所得樣品，加500 μL緩沖液GMO1和20 μL Proteinase K（20 g/mL），渦旋振蕩1 min。56 ℃孵育1 h，孵育過程中每15 min振蕩1次。加入200 μL緩沖液GMO2，充分混勻，渦旋振蕩1 min，室溫靜置10 min。12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入1 μL Carrier RNA，再加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻。12 000 r/min離心3 min，棄上清，保留沉淀。加入700 μL 70%乙醇，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心 2 min，棄上清。重復(fù)2次。開蓋倒置，室溫5～10 min，徹底晾干殘余的乙醇。加入20 ～50 μL洗脫緩沖液TE，渦旋振蕩 1 min，最終得到DNA緩沖液。

1.2.3PCR引物設(shè)計(jì)引物參照王媛等的設(shè)計(jì)[15]，由三博遠(yuǎn)志公司合成（表1）。

1.2.4PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

1.2.4.1普通PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件在96孔板上同時(shí)分別對(duì)醬油DNA提取液中凝集素（Lectin）基因、CaMv35S啟動(dòng)子、NOS終止子、18S基因和EPSPS外源基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，另外，對(duì)Lectin基因、CaMv35S啟動(dòng)子、NOS終止子、18S基因標(biāo)準(zhǔn)樣品以同樣條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL。其中含2×PCR Reagent 12.5 μL；上、下游引物分別0.5 μL；模板DNA 4 μL，用滅菌雙蒸水定容至25 μL。陰性對(duì)照不含樣品。

PCR擴(kuò)增條件：退火 94 ℃ 3 min；退火及延伸 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，37個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后70 ℃ 5 min。

1.2.4.2RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件在96孔板上同時(shí)分別對(duì)醬油DNA提取液中Lectin基因、CaMv35S啟動(dòng)子、NOS終止子、18S基因和EPSPS外源基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL。其中含2×PCR Reagent 12.5 μL；上、下游引物各0.5 μL；模板DNA 4 μL，用滅菌雙蒸水定容至25 μL。陰性對(duì)照不含樣品。

RT-PCR擴(kuò)增條件：退火 94 ℃ 30 s；退火及延伸 94 ℃ 5 s，60 ℃ 80 s，40個(gè)循環(huán)。 循環(huán)結(jié)束后開始熔解階段，溫度從65 ℃升至95℃，每升高0.5 ℃儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。

按照以上反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行PCR和RT-PCR反應(yīng)，普通PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物與1 μL loading buffer混勻，加入到進(jìn)樣孔中在180 V/0.1 A下進(jìn)行凝膠電泳，38 min后取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1基因組的提取結(jié)果

要成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增，首先需保證DNA樣品的純度。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)量，試劑盒提取的樣品DNA的濃度為100～500 ng/μL，DNA純度較好，適合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2醬油中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR和凝膠電泳分析

Lectin基因作為內(nèi)源性的大豆看家基因，在大豆細(xì)胞中基因組的表達(dá)量基本恒定，很少受外部環(huán)境影響，因此，本研究選取了Lectin基因作為內(nèi)部參照[16]，考察Lectin基因的擴(kuò)增，也可以判斷提取的DNA的量和純度是否合適進(jìn)行PCR分析，排除假陰性結(jié)果的存在。根據(jù)圖1的3、4條帶可以看出，醬油中提取的DNA中含有足夠的Lectin基因用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效果良好。擴(kuò)增產(chǎn)物約100 bp。然而Lectin的陰性對(duì)照組出現(xiàn)模糊的亮帶，可能來自于外部基因污染。

此外，由圖1可以看出，在醬油所提取的DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果中，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆中的調(diào)控元件CaMv35S啟動(dòng)子、NOS終止子和18S基因均得到明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物，其對(duì)照組均為陰性。而外源基因EPSPS沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表示醬油樣品中的轉(zhuǎn)基因成分含有CaMv35s啟動(dòng)子、Nos終止子和18S基因，而抗草甘膦基因中的EPSPS成分可能已被降解。

各種基因標(biāo)準(zhǔn)樣品PCR擴(kuò)增后的結(jié)果與圖1的條帶結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了在醬油基因組提取中，無需進(jìn)一步分離就能夠得到純度較高的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，其結(jié)果較為準(zhǔn)確（圖2）。值得特別注意的是，之前Lectin基因陰性對(duì)照中的條帶已經(jīng)基本消失不見，進(jìn)一步證明在圖1的試驗(yàn)中，PCR反應(yīng)或凝膠電泳過程中對(duì)Lectin基因陰性對(duì)照組造成了外部污染。同時(shí)，圖2-B中的NOS陰性對(duì)照中出現(xiàn)

了模糊的亮帶，而圖1中NOS陰性對(duì)照組并未出現(xiàn)條帶。這個(gè)現(xiàn)象也進(jìn)一步說明了陰性對(duì)照存在著假陽(yáng)性外部污染。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

目前，定性PCR和凝膠電泳分析僅能夠?qū)︶u油中的轉(zhuǎn)基因成分完成初步的定性和篩選，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其結(jié)果容易因外部污染造成假陽(yáng)性，因此準(zhǔn)確性較差。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR可對(duì)醬油樣品中提取出的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行進(jìn)一步定性確認(rèn)和定量標(biāo)定。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)醬油樣品DNA提取物中的Lectin基因、CaMv35S啟動(dòng)子、NOS終止子、18S基因、EPSPS外源基因進(jìn)行了研究（圖3）。上述前4種基因都存在擴(kuò)增產(chǎn)物，EPSPS 外源基因不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)軟件分析結(jié)果，其中Lectin、CaMv35S、NOS、18S、EPSPS的CT平均值分別為 33.46、33.15、30.16、35.45、0.00，該結(jié)果與定性PCR結(jié)果一致。同時(shí)所有5組陰性對(duì)照試驗(yàn)均沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步證明了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，與定性PCR相比，避免了外部污染引起的假陽(yáng)性。因?yàn)樵撫u油樣品來源于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，而EPSPS基因是抗草甘膦基因的重要序列。因此，該檢測(cè)結(jié)果也準(zhǔn)確地說明了EPSPS基因在食品中存在著降解和損耗。

為驗(yàn)證該方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性， 開展了4次實(shí)時(shí)熒光

定量PCR的重復(fù)試驗(yàn)（圖4）。結(jié)果表明，對(duì)于相同批次的醬油樣品，PCR擴(kuò)增結(jié)果重現(xiàn)性較好，Lectin、CaMv35S、NOS、18S 這4種基因都產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物，其相對(duì)豐度基本一致，EPSPS基因均沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.4熔解曲線分析

本研究中使用的是SYBR Green染料，能與雙鏈DNA發(fā)生非特異性結(jié)合，引發(fā)其熒光增強(qiáng)，由于這種結(jié)合的非特異性，所以假陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物也可能引發(fā)熒光信號(hào)的增強(qiáng)，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度[14]。因此，需要結(jié)合熔解曲線來分析PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。

在完成PCR擴(kuò)增后，逐漸增加反應(yīng)體系的溫度，同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光值（RFU），隨著反應(yīng)產(chǎn)物中雙鏈DNA在高溫下逐步解鏈，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸降低。做-d（RFU）/dT與溫度的關(guān)系圖，則得到PCR產(chǎn)物的熔解曲線，這里T為時(shí)間。一般的，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度的峰值（Tm值，即雙鏈DNA解鏈50%的溫度）比非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值高，因此可區(qū)別出特異性信號(hào)和非特異性信號(hào)。

由圖5可見，醬油樣品中提取的轉(zhuǎn)基因成分里，CaMv35S、NOS、18S基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線均為單峰，為典型的特異性擴(kuò)增，解鏈溫度分別為83.1、75.8、84.5 ℃。Lectin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線在82.8 ℃有1個(gè)明顯的特異性擴(kuò)增峰，另外，在77.5 ℃處還有1個(gè)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的小峰，這個(gè)結(jié)果也一定程度說明了定性PCR陰性對(duì)照中的凝膠電泳亮帶的來源（圖1條帶3），為非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生。同時(shí)，與前面的結(jié)果一致，因?yàn)镋PSPS基因沒有產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，所有其熔解曲線沒有任何特征峰。

3結(jié)論與討論

PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因組DNA的檢測(cè)中，具有特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用信號(hào)的采集和積累來實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)度，根據(jù)反應(yīng)CT值做到對(duì)基因的定量檢測(cè)。這種方法的定量信息更準(zhǔn)確，方法更加靈敏，因此可以用于大豆轉(zhuǎn)基因制品的檢測(cè)。

本研究完成了對(duì)醬油這樣的實(shí)際樣品中所含的多種大豆抗草甘膦轉(zhuǎn)基因成分的快速、高通量檢測(cè)。首先，采用試劑盒成功從醬油樣品中提取出了基因組DNA，并設(shè)計(jì)5組探針，針對(duì)樣品中大豆的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了定性PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)樣品，對(duì)定性PCR的結(jié)果進(jìn)行了凝膠電泳分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆（或豆粕）為原料產(chǎn)出的醬油中含有抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的調(diào)控元件CaMv35s啟動(dòng)子、Nos終止子、以及18S基因，并同時(shí)可以檢測(cè)到內(nèi)源基因Lectin。然而，EPSPS外源基因并沒有檢測(cè)到。說明EPSPS外源基因在食品加工中可能被降解。

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)同時(shí)成功檢出了多種醬油中所含的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆成分，內(nèi)源參照基因Lectin的CT值和目的基因的CT值相近，說明結(jié)果可靠有效，達(dá)到了極高的檢測(cè)靈敏度。試驗(yàn)儀器采用的BIO-RAD MJ Mini PCR為96孔，可同時(shí)測(cè)定32個(gè)樣本，每個(gè)樣本為3個(gè)平行，可以進(jìn)行高通量實(shí)時(shí)分析，與傳統(tǒng)PCR相比節(jié)約了大量的時(shí)間。

與傳統(tǒng)PCR相比，RT-PCR方法具有更好的分析特異性[17]。凝膠電泳分析結(jié)果顯示，定性PCR反應(yīng)結(jié)果Lectin基因陰性對(duì)照組中有1條模糊的條帶，即造成了外界污染；而在相應(yīng)的RT-PCR中，Lectin基因陰性對(duì)照組并沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。該現(xiàn)象表明傳統(tǒng)PCR容易在定性分析中因外界污染造成假陽(yáng)性，具有技術(shù)上的缺陷，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR克服了這一缺陷。熔解曲線的分析能夠很好地區(qū)分特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步證實(shí)了Lectin基因擴(kuò)增中產(chǎn)生了非特異性產(chǎn)物，有效地提高了分析的準(zhǔn)確性。

本研究建立的RT-PCR方法作為一種更直觀、更準(zhǔn)確和更快速的轉(zhuǎn)基因成分高通量檢測(cè)方法可以為食品質(zhì)量監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供更好的技術(shù)支持，有利于管理市場(chǎng)上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和規(guī)范轉(zhuǎn)基因原料的流通。

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