張燕新++張學(xué)文++楊娟++趙洪木++楊爽++王艷輝

摘要：分析油茶花期不同飼喂條件對(duì)蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響，以探討蜜蜂油茶花蜜中毒的原因。采用糖濃度為35%的糖水飼喂西方蜜蜂蜂群，試驗(yàn)組采用檸檬酸分別將糖水的pH值調(diào)整為3.5、4.5，對(duì)照組不添加檸檬酸。觀察并記錄不同飼喂條件下的蜂群群勢(shì)和爛子情況，測(cè)定蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性。結(jié)果表明，當(dāng)pH值為3.5時(shí)，蜜蜂爛子情況輕微，蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力隨喂食時(shí)間的增長(zhǎng)呈明顯升高趨勢(shì)，比活力差異顯著（P<0.05）；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，乙酰膽堿酯酶的比活力隨喂食時(shí)間的增長(zhǎng)呈緩慢升高趨勢(shì)甚至有所下降，飼喂1周后比活力差異不顯著（P>0.05），爛子情況比其他2組嚴(yán)重。飼料中添加檸檬酸喂食蜜蜂后，檸檬酸與蜜蜂采食的油茶花蜜中的生物堿結(jié)合，從而釋放乙酰膽堿酯酶，使乙酰膽堿酯酶活性升高。

關(guān)鍵詞：油茶花蜜；蜜蜂爛子；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號(hào)： S896.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0358-03

收稿日期：2015-05-11

基金項(xiàng)目：云南省科技廳重點(diǎn)新產(chǎn)品開發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2011BB012）；國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-45-SYZ 17）；云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所青年創(chuàng)新基金（編號(hào)：QC2015005）。

作者簡(jiǎn)介：張燕新（1987—），女，云南曲靖人，碩士研究生，主要從事蜂產(chǎn)品質(zhì)量與安全研究。E-mail：dreamfly0517@hotmail.com。

通信作者：王艷輝，副研究員，主要從事蠶桑蜜蜂資源利用研究。E-mail：wyh686686@sina.com。油茶（Camellia oleifera Abel.）別稱茶籽樹、茶油樹、白花樹等，屬山茶科山茶屬，為常綠灌木或小喬木，是我國(guó)重要的木本油料植物，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物，被譽(yù)為“東方橄欖油”[1]。油茶花花期長(zhǎng)、流蜜量大，是很好的蜜源植物。但油茶具有自花不育性，雖然樹大花多但結(jié)果很少，有“千花一果”之稱，亟需傳粉蜜蜂授粉。開發(fā)利用油茶蜜源[2]不僅可增加養(yǎng)蜂戶的收入，還能大幅提高茶籽的產(chǎn)量和出油率[3]。由于油茶花蜜中含有對(duì)蜜蜂具有毒性的物質(zhì)，蜜蜂采食后出現(xiàn)腹部膨脹、喪失飛翔能力等癥狀，成蜂在地面上爬行，幼蟲中毒后死亡腐爛，出現(xiàn)蜂群群勢(shì)下降等現(xiàn)象[4]。對(duì)于蜜蜂油茶花蜜中毒現(xiàn)象，康雪冬等研究認(rèn)為，油茶花蜜中含半乳糖的寡糖成分，棉子糖和水蘇糖是引起蜜蜂中毒的主要因素，可能是蜜蜂不能利用寡糖中的半乳糖而造成消化、代謝上的障礙所致[5]。棉子糖和水蘇糖中均結(jié)合有半乳糖成分，因此認(rèn)為半乳糖是油茶花蜜中導(dǎo)致蜜蜂中毒的物質(zhì)。黃堅(jiān)研究認(rèn)為，茶花引起蜜蜂中毒是由于茶樹花蜜、油茶花蜜中均含有較高濃度生物堿等不易消化的物質(zhì)[6]。蜜蜂幼蟲食后不易消化，后腸阻塞造成營(yíng)養(yǎng)不良而死亡。生物堿不僅會(huì)造成蜜蜂消化障礙，還是一種乙酰膽堿酯酶抑制劑[7-9]。乙酰膽堿酯酶是昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的酶系之一[10]，在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中與乙酰膽堿受體共同參與完成神經(jīng)-神經(jīng)、神經(jīng)-肌肉突觸之間動(dòng)作電位的傳遞。乙酰膽堿酯酶的主要生理功能是催化水解陽(yáng)離子性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，維持神經(jīng)沖動(dòng)正常傳遞[11]。油茶花蜜中的生物堿可能影響了蜜蜂神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶，導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞阻斷而致使昆蟲死亡。根據(jù)蜂農(nóng)多年的養(yǎng)蜂經(jīng)驗(yàn)，酸飼料可中和茶花蜜中的生物堿，并能促進(jìn)蜜蜂消化，是其常用的方法，包括檸檬酸、醋酸等。本試驗(yàn)采用喂食檸檬酸的方法，測(cè)定蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，以探討蜜蜂油茶花蜜中毒的現(xiàn)象，以期為油茶花蜜生物堿的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)，并有望將其作為新型乙酰膽堿酯酶抑制劑。

1材料與方法

1.1供試蟲源

采用濃度為35%且pH值分別為3.5、4.5、7.0的糖水喂食西方蜜蜂，每個(gè)梯度3群，共9群。白天蜜蜂正常采集油茶花蜜粉，隔天晚上飼喂1次，飼喂量為每群800 mL，連續(xù)飼喂4周。第1次測(cè)定蜂群群勢(shì)后，每周記錄蜂群的成蜂量（脾）、封蓋子數(shù)（包括健康和不健康封蓋子）、爛子數(shù)。每群蜜蜂取樣3只進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于西雙版納地區(qū)普文蜂場(chǎng)進(jìn)行，普文鎮(zhèn)位于東經(jīng)101°23′、北緯22°33′，地處云南省西雙版納地區(qū)景洪市最北部。該地區(qū)最高海拔1 797.3 m、最低海拔772 m、年平均氣溫20.2 ℃、年平均降水量1 675.6 mm、全年日照時(shí)數(shù)1 990 h，屬于北亞熱帶高原季風(fēng)氣候，適宜茶葉、咖啡、水果等植物的生長(zhǎng)。

1.3主要試劑和儀器

主要試劑為1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Albumin bovine serum，云科生物工程公司），考馬斯亮藍(lán)G-250（北京索萊寶科技有限公司），1.6 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATChI，ACROS ORGANICS公司），5，5′-二硫代雙硝基苯甲酸[5，5′-dithio-bis（2-nitrobenzoicacid）]（DTNB，Damas-beta公司）。主要儀器為高速冷凍離心機(jī)、xMark型酶標(biāo)儀、玻璃勻漿器。

1.4活體抑制粗酶液制備

采用0.9% NaCl溶液清洗蜜蜂樣品，以1 g ∶ 5 mL的比例于0.01 mol/L磷酸緩沖液（1 mmol/L EDTA、1% TritonX-100、1 mol/L NaCl，pH值8.0）中冰浴，研磨成勻漿，勻漿液于4 ℃、15 000 r/min離心20 min，取上清液作為待測(cè)酶液。

1.5蛋白質(zhì)及AChE活性測(cè)定

參照考馬斯亮藍(lán)G-250法[12]測(cè)定酶源蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。參照張瑩等的酶活性測(cè)定方法[13]測(cè)定AChE活性，以0.8 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿（ATChI）為反應(yīng)底物，以0.125 mmol/L 5，5′-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑。取50 μL待測(cè)酶液、100 μL ATChI底物，混勻后置于40 ℃酶標(biāo)儀中保溫10 min，加入100 μL DTNB顯色劑顯色并終止反應(yīng)。于412 nm處測(cè)定吸光度（D值），按以下公式計(jì)算AChE的比活力[14-15]。

AChE比活力=ΔD×Ve×L×V1×t×m

。

（1）

式中：V表示反應(yīng)體系的總體積，mL；V1表示反應(yīng)體系中所加酶液的體積，mL；m表示反應(yīng)體系中AChE的實(shí)際蛋白質(zhì)含量，mg；消光系數(shù)（e）為13.6，光程（L）為1 cm。

1.6數(shù)據(jù)處理分析

所有測(cè)定均重復(fù)3次，采用Origin 8.5、SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2結(jié)果與分析

2.1蜜蜂中毒癥狀

經(jīng)過(guò)1個(gè)月的觀察，采食了油茶花蜜的蜜蜂陸續(xù)出現(xiàn)幼蟲中毒后死亡腐爛、蜂群群勢(shì)下降等現(xiàn)象。在飼料中添加檸檬酸的蜂群，其爛子數(shù)低于未喂食檸檬酸的蜂群，飼料pH值為3.5的蜂群其爛子情況最為輕微。

2.2蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的變化

當(dāng)pH值為3.5時(shí)，乙酰膽堿酯酶的比活力隨著檸檬酸飼喂時(shí)間的增長(zhǎng)呈明顯增加趨勢(shì)（圖1）。當(dāng)pH值為4.5時(shí)，乙酰膽堿酯酶的比活力隨著檸檬酸飼喂時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，但有逐漸變緩的趨勢(shì)（圖2）。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，即糖水中未添加檸檬酸的3個(gè)蜂群，乙酰膽堿酯酶的比活力開始時(shí)隨著飼喂時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，但趨勢(shì)更加緩慢，甚至有下降的趨勢(shì)（圖3）。

2.3喂食檸檬酸對(duì)蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響

由表1可知，針對(duì)3個(gè)梯度中的第2個(gè)蜂群，喂食之前蜂

群之間蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力為0.16～0.18 U/mg。飼喂檸檬酸1個(gè)月之后，在pH值為3.5、4.5的2個(gè)組中，其蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力均升高至 0.23 U/mg，與飼喂檸檬酸前相比差異顯著；飼料中未添加檸檬酸的蜂群中，其蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力仍在0.17 U/mg 左右，與飼喂檸檬酸前相比差異不顯著（表1）。從整體來(lái)看，pH值為3.5的3個(gè)蜂群中，其蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性高于另外2個(gè)組（圖4、圖5）。

3結(jié)論與討論

蜜蜂自然中毒是指蜜蜂采食某種天然植物的花粉、花蜜、甘露蜜（蚜蟲、介殼蟲等昆蟲分泌的甜汁經(jīng)蜜蜂采集釀成）后出現(xiàn)的中毒現(xiàn)象。在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，多見于有毒植物中毒、棗花中毒、茶花中毒、油茶中毒、甘露蜜中毒[16]。對(duì)于蜜蜂棗花期中毒的原因，目前多認(rèn)為是由于花粉和花蜜中的生物堿、游離鉀離子濃度不當(dāng)所引起[17-18]。對(duì)于蜜蜂油茶中毒現(xiàn)象，目前認(rèn)為是蜜蜂不能消化棉子糖和水蘇糖等，并未探討油茶期蜜蜂體酶的變化。

本研究從乙酰膽堿酯酶活性變化的角度探討蜜蜂油茶花蜜中毒現(xiàn)象。結(jié)果表明，在飼料中添加檸檬酸并喂食4周后，蜂群蜜蜂體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶活性升高，與喂食檸檬酸前呈顯著性差異，爛子情況減弱；在空白組即未喂食檸檬酸的蜂群中，蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的升高趨勢(shì)緩慢，與喂食前酶活性的差異不顯著，爛子情況比其他2組嚴(yán)重。本研究證實(shí)，喂食檸檬酸可改善蜜蜂采食油茶花蜜后的爛子情況和蜂群群勢(shì)。油茶花蜜中含有生物堿，生物堿是一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，會(huì)與蜜蜂神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶結(jié)合，導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞阻斷而致使蜜蜂死亡。在飼料中添加檸檬酸，蜜蜂食用后，檸檬酸與蜜蜂采食的油茶花蜜中的生物堿結(jié)合，從而釋放乙酰膽堿酯酶，使乙酰膽堿酯酶活性升高。

對(duì)于蜜蜂油茶花蜜中毒現(xiàn)象，不僅要關(guān)注棉子糖、水蘇糖等蜜蜂不能消化的糖，還要重視生物堿的作用[19-21]。明確蜜蜂油茶花蜜中毒的真正原因，深入探討蜜蜂油茶花蜜中毒的作用機(jī)理，進(jìn)而找到更好的解毒劑，使蜜蜂安全有效地采集油茶蜜粉，對(duì)油茶進(jìn)行授粉并提高油茶籽產(chǎn)量。本研究為進(jìn)一步定量分析油茶花蜜中生物堿對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用奠定了基礎(chǔ)，并有望開發(fā)油茶花蜜生物堿作為新型乙酰膽堿酯酶抑制劑。

參考文獻(xiàn)：

[1]潘捷. 湖南省現(xiàn)有油茶林低產(chǎn)原因分析[J]. 湖南林業(yè)科技，2010，37（3）：46-47，50.

[2]郭冬生. 蜜蜂采集油茶蜜粉時(shí)蜂群的狀況分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（12）：125-126.

[3]鄧園藝，喻勛林，羅毅波.傳粉昆蟲對(duì)我國(guó)中南地區(qū)油茶結(jié)實(shí)和結(jié)籽的作用[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30（16）：4427-4436.

[4]張麗珠，陳穩(wěn)宏. 蜜蜂油茶花蜜中毒的預(yù)防與救治[J]. 中國(guó)蜂業(yè)中旬刊：學(xué)術(shù)，2013，64（3）：36-37.

[5]康雪冬，范正友. 蜜蜂油茶蜜中毒物質(zhì)的分析研究[J]. 蜜蜂雜志，1991（1）：8-10.

[6]黃堅(jiān). 淺談茶花爛子的防治[J]. 蜜蜂雜志，1994（8）：27.

[7]Cardoso-Lopes E M，Maier J A，Da-Silva M R，et al. Alkaloids from stems of Esenbeckia leiocarpa Engl.（Rutaceae）as potential treatment for alzheimer disease[J]. Molecules，2010，15（12）：9205-9213.

[8]羅萬(wàn)春，李云壽，慕立義，等. 苦豆子生物堿對(duì)蘿卜蚜的毒力及其對(duì)幾種酯酶的影響[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，1997（4）：358-365.

[9]黃華，丁伯平. 鉤藤生物堿對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28（5）：806-810.

[10]Fournier D，Mutero A. Modification of acetylcholinesterase as a mechanism of resistance to insecticides[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Pharmacology，Toxicology and Endocrinology，1994，108（1）：19-31.

[11]Li F H Z. Characterization of acetylcholinesterase from cotton aphid，Aphis gossypii Glover[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2002，51（1）：37-45.

[12]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（1）：248-254.

[13]張瑩，黃建，高希武. 兩種蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶對(duì)殺蟲藥劑敏感度比較[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，7（3）：221-226.

[14]黃曉，滕云，陶科，等. 天然產(chǎn)物對(duì)家蠶乙酰膽堿酯酶抑制作用研究[J]. 四川動(dòng)物，2008，27（3）：327-330.

[15]彭霞，陶科，滕云，等. 農(nóng)藥靶標(biāo)乙酰膽堿酯酶的分離純化及性質(zhì)研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，45（1）：189-193.

[16]余海波. 蜜蜂自然中毒的病因與診治[J]. 貴州畜牧獸醫(yī)，2015，65（1）：24-27.

[17]金豐. 棗花期蜜蜂中毒的防治[J]. 中國(guó)養(yǎng)蜂，1994（2）：22.

[18]李曉立，范正友.蜜蜂棗花病病因的探討[J]. 中國(guó)養(yǎng)蜂，1991（2）：5-8.

[19]劉海青，劉富平，胡文婷. 壯實(shí)鹿角珊瑚生物堿的體外抗菌活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：250-251.

[20]賢景春，陳小濱. 雞屎藤總生物堿提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（2）：209-211.

[21]賈書紅，李效振，張東升，等. 宮炎凈提取物中生物堿對(duì)子宮內(nèi)膜炎家兔的抗炎作用機(jī)理[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：209-211.