吳永繼++宋劍武++孫燕杰++劉增援++黃凱++司紅彬

摘要：研究穿心蓮水提取物與抗菌藥聯(lián)合誘導細菌傳代的體外抑菌活性。對臨床分離的細菌進行鑒定，確定細菌所含耐藥基因種類，用牛津杯法測定穿心蓮水提取物的抑菌活性和平板涂布法測定穿心蓮水提取物的殺菌活性，采用二倍微量稀釋法體外檢測穿心蓮水提取物與抗菌藥的最小抑菌濃度（MIC），穿心蓮水提取物與抗菌藥聯(lián)合誘導含fosA3型大腸桿菌細菌傳代。研究結果，分離到fosA3型耐藥基因大腸桿菌；穿心蓮水提取物的MIC為1 g/mL，穿心蓮水提取物與抗菌藥聯(lián)用后，可明顯地增強頭孢菌素類、青霉素類、氟喹諾酮類、喹啉類、磺胺類、氨基糖苷類、酰胺醇類和磷霉素對耐藥菌的抑制作用。結果表明，穿心蓮水提取物對含fosA3大腸桿菌有一定的抑菌活性和殺菌活性，與部分抗菌藥聯(lián)合應用后，抗菌藥體外抗菌活性顯著增強。

關鍵詞：穿心蓮水提取物；含fosA3大腸桿菌；聯(lián)合誘導；最小抑菌濃度（MIC）

中圖分類號： S853.74文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0348-03

收稿日期：2015-05-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：31460675）；國家科技支撐計劃（編號：2012BAD25B04）；廣西科技攻關（編號：0992014-2）；廣西自然科學基金（編號：2012GXNSFBA053052、2013GXNSFAA019070）；廣西南寧市科技攻關（編號：20141295）；廣西大學獸醫(yī)一級學科博士啟動基金（編號：2012GXNSFBA053052）；廣西高校優(yōu)勢特色專業(yè)建設項目。

作者簡介：吳永繼（1991—），女，河南駐馬店人，碩士，主要從事中獸藥研究。 E-mail：wyjalisa@163.com。

通信作者：司紅彬，博士，副教授，主要從事細菌耐藥性研究。E-mail：zhuli_2009@163.com。穿心蓮（Andrographis paniculata）是中國民間常用中藥，是一種具有廣泛應用開發(fā)前景的植物資源，具有解熱[1]、抗炎[2]、抗病毒感染[3]、免疫調節(jié)作用[4]、治療心血管疾病[5]、抗癌[6-8]、治療消化系統(tǒng)疾病[9]及抗生育[10]等作用，臨床應用于腸道感染、呼吸道感染、皮膚疾病等[11]以及急性菌痢、胃腸炎、感冒發(fā)熱、高血壓等心血管疾病的治療。研究結果表明，穿心蓮具有很好的體外抗菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、甲型鏈球菌、乙型鏈球菌均有明顯的抑菌作用[12]。磷霉素是一種廣譜抗菌藥，對常見革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抗菌活性，與其他抗菌藥無交叉耐藥性，并與多種抗菌藥聯(lián)合應用時呈協(xié)同作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，應用磷霉素治療各類尿路感染仍然高度有效，且細菌耐藥率低。近年來，隨著產(chǎn)ESBLs（Extended Spectrum β-Lactamases）細菌的流行，質粒介導的耐磷霉素基因fosA3（fosfomycin resistance gene）[13]的發(fā)現(xiàn)，且fosA3為產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細菌中常見的Fos基因類型，fosA3基因常與ESBLs基因共同轉移，這可能會造成不同耐藥的共同傳播。這將對畜牧養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生巨大的威脅。目前，抗菌藥的研發(fā)速度緩慢，遠遠趕不上細菌耐藥性產(chǎn)生的速度，這些耐藥基因可以在菌株間以質粒介導的形式傳播，甚至能夠通過直接與人體接觸傳播或者間接地通過食物鏈向人體進行傳遞，這將給人類安全及養(yǎng)殖業(yè)帶來很大的危害。因此，找到一種可以延緩耐藥性產(chǎn)生或逆轉病原菌耐藥性的藥物顯得尤為重要。目前，對含fosA3型耐藥基因細菌方面的聯(lián)合用藥，尤其是中藥成分與抗菌藥聯(lián)合作用鮮見研究報道。本試驗旨在探究穿心蓮水提取物聯(lián)合抗菌藥對含耐fosA3型大腸桿菌的體外抑菌作用。為減少細菌對臨床常用抗菌藥的耐藥性和對穿心蓮的進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

穿心蓮購自廣西萬豐藥業(yè)有限公司，批號20111206；牛肉膏蛋白胨、牛津杯、MH肉湯、LB肉湯、MH 瓊脂、普通瓊脂、麥康凱瓊脂、牛肉膏蛋白胨、伊紅美藍瓊脂、營養(yǎng)肉湯、生化試劑均購自杭州天和微生物試劑有限公司；Taq酶、dNTP、10×PCR buffer、引物、瓊脂糖均購自上海生工生物工程有限公司；抗菌藥：頭孢曲松鈉、阿莫西林、諾氟沙星、黏桿菌素、痢菌凈、磺胺間甲氧嘧啶、阿米卡星、頭孢他啶、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考、磷霉素，均在有效期范圍內。

1.2菌株分離鑒定

病原菌的分離培養(yǎng)從豬場采集患病豬的腸道病料，將其浸入滅菌生理鹽水，充分洗脫，將其懸浮液接種于普通平板，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h，挑取可疑菌落接種到麥康凱瓊脂和伊紅美藍瓊脂平板進行培養(yǎng)。依據(jù)標準[14-15 ]對所分離菌株進行糖發(fā)酵管試驗、吲哚試驗、MR試驗、V-P試驗、枸櫞酸鈉利用試驗。

1.3fosA3基因的檢測

1.3.1引物設計與合成參照GenBank中登錄的fosA3基因序列JX442754.1，設計fosA3引物，引物序列為：FosA3-F：5′-GCGTCAAGCCTGGCATTT-3′；FosA3-R：3′-GCCGTCAGGGTCGAGAAA-5′。引物由上海生物工程有限公司合成，fosA3型產(chǎn)物擴增長度為250 bp左右。

1.3.2PCR擴增PCR反應體系50 μL [16]：Taq酶0.5 μL，dNTP 4 μL，10×PCR Buffer 5 μL，模板2 μL，上、下游引物各2 μL，去離子水34.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結果并用凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.4穿心蓮水提取物制備

稱取中藥200 g，用蒸餾水清洗、浸泡12 h后煎煮，第1次加蒸餾水2 000 mL，加熱至沸騰改為文火，保持沸騰狀態(tài)煎煮60 min，過濾后得到第1次濾液。用相同方法繼續(xù)煎煮，第2次加水量為1 600 mL，第3次加水量為800 mL，分別得到第2、第3次濾液。合并3次濾液，加熱蒸發(fā)濃縮到200 mL，此時中藥濃度為1 g/mL。藥液經(jīng)高壓滅菌后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5制備菌懸液

將純化好的含fosA3大腸桿菌接種到MH肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出已培養(yǎng)好的大腸桿菌菌液，調節(jié)菌液濃度為107 CFU/mL。

1.6穿心蓮水提取物對含fosA3細菌抑菌活性和殺菌活性試驗

1.6.1穿心蓮水提取物對含fosA3基因細菌抑菌活性試驗采用牛津杯法[17]檢測穿心蓮水提取物對含fosA3細菌抑菌活性。首先在培養(yǎng)皿內倒入15 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，凝固后，將含有0.2 mL配好的含fosA3細菌菌懸液的牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基5 mL均勻倒入平板中。待徹底凝固后，在培養(yǎng)基上平均布置無菌牛津杯，1 min后，向其中加入 1 g/mL 的穿心蓮水提取物50 μL。置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，用直尺測定抑菌圈直徑。

1.6.2穿心蓮水提取物對含fosA3基因細菌殺菌活性試驗采用平板涂布法[18]測定穿心蓮水提取物對含fosA3細菌的殺菌活性。細菌經(jīng)活化培養(yǎng)后接種到MH肉湯，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h。然后將菌液稀釋至濃度為107 CFU/mL的菌懸液，取此菌液6 mL，加入穿心蓮水提取物使其終濃度為 0.5 g/mL，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別在2、6、8、10、12、16、24 h取菌液，經(jīng)適當稀釋后涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)24 h后計平板上菌落個數(shù)。以菌液不加藥為對照組，試驗重復3次，取平均值。殺菌率計算：殺菌率=（對照組-穿心蓮水提物組）/對照組×100 %。

1.7穿心蓮水提取物和抗菌藥最小抑菌濃度（MIC）檢測

參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會CLSI推薦的方法和結果判定標準[19]，采用微量稀釋法測定各受試藥對細菌的最小抑菌濃度值，具體操作參照NCCLS抗菌藥敏感性試驗操作標準[20]。細菌經(jīng)活化后，培養(yǎng)至生長對數(shù)期，將其稀釋至濃度為107 CFU/mL菌懸液。取100 μL于微量藥敏反應板的第1孔內，之后每孔加入100 μL至第12孔，在第1孔加入100 μL藥液，混勻后吸取100 μL至第2孔，依次稀釋混勻至第11孔，第11孔混勻后棄去100 μL，第12孔不加藥作為空白對照，加蓋于37 ℃恒溫箱內培養(yǎng)18～24 h。

1.8穿心蓮水提取物聯(lián)合抗菌藥誘導細菌傳代

用亞抑菌濃度1/2 MIC值穿心蓮水提取物聯(lián)合抗菌藥誘導耐藥菌傳代培養(yǎng)，并觀察穿心蓮水提取物作用前后的MIC變化，以便判斷穿心蓮水提取物對各抗菌藥作用細菌的效果，同時設1/2 MIC濃度的穿心蓮水提取物對照。

2結果與分析

2.1細菌鑒定結果

病原菌培養(yǎng)24 h后，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為粉紅色（圖1）、邊緣整齊的菌落；伊紅美藍瓊脂平板上生長為光滑邊緣整齊、黑色并有金屬光澤的小菌落。從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上挑取典型菌落，接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后可見灰白色隆起、濕潤、光滑、直徑1～3 mm的菌落。

將純化后的細菌分別接種到系列生化培養(yǎng)基，結果發(fā)現(xiàn)，該分離菌能分解葡萄糖、乳酸、甘露醇、麥芽糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不分解肌醇和尿素；不產(chǎn)生H2S；MR試驗陽性；V.P.試驗陰性；枸櫞酸鈉利用試驗陰性；不液化明膠：初步鑒定為大腸桿菌。

2.2PCR檢測結果

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，fosA3型產(chǎn)物擴增長度約250 bp（圖2），由上海生工生物有限公司測序，結果表明，該序列長度為258 bp，該菌為含fosA3基因的大腸桿菌。

2.3穿心蓮水提取物對含fosA3基因細菌抑菌活性和殺菌活性

研究結果顯示，穿心蓮水提取物對含fosA3基因大腸桿菌有較強的抑菌活性，當穿心蓮水提取物濃度為1 g/mL時，其抑菌圈直徑為13 mm，說明穿心蓮水提取物對含fosA3大腸桿菌有較強抑菌活性。從表1可以看出，穿心蓮水提取物對含fosA3大腸桿菌有較強殺菌作用，0.5 g/mL穿心蓮水提取物在12、16 h可以使含fosA3大腸桿菌的存活菌數(shù)由 109 CFU/mL 降低至108 CFU/mL，24 h時，存活菌數(shù)下降到107 CFU/mL， 其殺菌率隨著穿心蓮水提取物的作用時間的增加而提高，當穿心蓮水提取物作用24 h時，穿心蓮水提取物對含fosA3大腸桿菌的殺菌率為92.66%。

2.4單藥及聯(lián)合傳代結果

從表2可以看出，單獨使用多種抗菌藥MIC值均較大，說明含fosA3型大腸桿菌對多種抗菌藥不敏感，已經(jīng)產(chǎn)生很強的耐藥性；而中西聯(lián)合傳代作用后的MIC值普遍減小，頭孢曲松鈉、阿莫西林、諾氟沙星、黏桿菌素、痢菌凈、磺胺間甲氧嘧啶、阿米卡星、頭孢他啶、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考、磷霉素均從第1代就開始變小。亞抑菌濃度（1/2MIC=0.5 g/mL）穿心蓮水提取物培養(yǎng)基傳代引起含fosA3大腸桿菌抗菌藥MIC的變化。結果表明，穿心蓮水提取物與頭孢菌素類、青霉素類、氟喹諾酮類、喹啉類、磺胺類、氨基糖苷類、酰胺醇類和磷霉素等抗菌藥聯(lián)合誘導傳代后MIC顯著降低，可判斷穿心蓮水提取物與這些抗菌藥聯(lián)合應用對含fosA3耐藥基因大腸桿菌具有明顯抑菌作用。

3討論

本試驗采用微生物學常用的牛津杯法檢測了穿心蓮水提取物對含fosA3大腸桿菌的抑菌活性，試驗結果，穿心蓮水提取物對含fosA3大腸桿菌有較顯著的抑菌活性。本試驗就穿心蓮水提取物對含fosA3大腸桿菌的殺菌作用進行了研究，結果顯示，0.5 g/mL穿心蓮水提取物在12、16 h可以使大腸桿菌存活菌數(shù)由108 CFU/mL降低到107 CFU/mL，24 h時，存活菌數(shù)下降到106 CFU/mL，其殺菌率隨著穿心蓮水提取物作用時間的增加而提高，當穿心蓮水提取物作用24 h時，穿心蓮水提取物對含fosA3大腸桿菌的殺菌率為92.66%，表明穿心蓮水提取物對大腸桿菌的生長有著明顯的抑制作用。

本試驗采用二倍微量稀釋法來測定穿心蓮水提取物與抗菌藥聯(lián)合作用于含fosA3型耐藥基因大腸桿菌體外殺菌效果，結果穿心蓮水提取物與頭孢菌素類、青霉素類、氟喹諾酮類、喹啉類、磺胺類、氨基糖苷類、酰胺醇類和磷霉素等抗菌藥聯(lián)合誘導傳代后MIC顯著降低。該方法與傳統(tǒng)的影印藥理學方法相比具有以下優(yōu)勢：（1）能夠一次性篩選擬篩選中藥影響的大量抗菌藥物，1個96孔板至少能夠篩選8個抗菌藥物，效率高；（2）能夠判斷中藥和抗菌藥物之間的關系，如拮抗、協(xié)同、相加與是否隨著作用時間的延長而增加抗菌藥物的最小抑菌濃度值；（3）不受細菌被中藥作用后是否仍能存活和繼續(xù)培養(yǎng)的限制，能夠避免中藥殺菌作用和耐藥逆轉作用的沖突，擴大了中藥的篩選種類和范圍；（4）操作簡便。

本研究僅限于體外抑菌試驗，穿心蓮水提取物在體內作用機制比體外還要復雜，且臨床多采用復方治療，因此，穿心蓮水提取物在體內能否達到與體外相同效果尚無定論，下一步應深入研究穿心蓮水提取物體內外抗菌作用。

目前，抗感染治療方面的聯(lián)合用藥多為抗生素之間的聯(lián)合，中藥成分與抗生素的協(xié)同作用在臨床治療方案中很少有報道[21]。中藥成分和藥效的特殊性，細菌很少對其產(chǎn)生耐藥性。但是，中藥成分的抗菌活性一般較弱，限制了其臨床應用。因此，通過將活性微弱的中藥成分聯(lián)合抗生素使用，探索其對常用抗生素的增效作用，有望成為耐藥菌感染新的治療措施。

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