郝榮華++張曉元++劉飛++朱希強(qiáng)++凌沛學(xué)+王桂蘭

摘要：以綠豆為材料，采用一定濃度不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子進(jìn)行處理，研究了不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。結(jié)果表明：不同分子量的γ-聚谷氨酸能夠不同程度地提高種子的發(fā)芽率，增加幼苗的株高、根長、鮮質(zhì)量等生理指標(biāo)，相應(yīng)地，種子的淀粉酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性也有不同程度的提高。其中相對分子質(zhì)量為120 ku的γ-聚谷氨酸處理種子的效果最好。

關(guān)鍵詞：聚谷氨酸；綠豆；相對分子質(zhì)量；生理指標(biāo)；酶活性

中圖分類號： S184；S522.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0169-03

收稿日期：2015-02-15

基金項(xiàng)目：山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（編號：2014GGZH1306）；山東省濟(jì)南市自主創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)化重大專項(xiàng)（編號：201403009）。

作者簡介：郝榮華（1983—），女，山東泰安人，博士，助理研究員，主要從事基因工程藥物研究。Tel：（0531）81213080；E-mail：ronghua34@163.com。

通信作者：朱希強(qiáng)，博士，研究員，主要從事生物技術(shù)藥物研究。Tel：（0531）81213080；E-mail：xistrong@sina.com。γ-聚谷氨酸是一種水溶性的可生物降解的高分子聚合物，最早于1937年由Lvanovics等人從炭疽芽孢桿菌的莢膜中發(fā)現(xiàn)的[1]，隨后Bovarnick的研究發(fā)現(xiàn)有些芽孢桿菌屬細(xì)菌在胞外積累可以獲得γ-聚谷氨酸[2]。近年來，國內(nèi)外對γ-聚谷氨酸的微生物發(fā)酵的研究也越來越多，采用不同菌株和不同發(fā)酵工藝生產(chǎn)的γ-聚谷氨酸分子量也會(huì)不同，其分子量大約為10～2 000 ku。 γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸以α-胺基和γ-羧基之間經(jīng)酰胺鍵聚合而成，其結(jié)構(gòu)式如圖1。

γ-聚谷氨酸具有極佳的成膜性、可塑性、黏結(jié)性、保濕性和可生物降解等獨(dú)特的理化和生物學(xué)特性，具有保鮮、增稠、乳化、凝膠、保濕等功效，是一種對人和環(huán)境無毒害的新型天然高分子，因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化妝品、制藥等領(lǐng)域[3]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，γ-聚谷氨酸可以作為藥物的緩釋、靶向載體及外科手術(shù)的黏膠劑、止血?jiǎng)┖兔芊鈩┑萚4-5]，這是由于γ-聚谷氨酸作為生物降解型高分子，其降解產(chǎn)物能通過正常的新陳代謝或被機(jī)體吸收利用或被排出體外。在化妝品工業(yè)領(lǐng)域，γ-聚谷氨酸高保濕性能使得其用于提升皮膚水分的保水量，有效減少水分散失，增強(qiáng)皮膚彈性。另外，聚谷氨酸還可抑制體內(nèi)酪氨酸酶活性，從而抑制皮膚黑色素的生成，具有皮膚美白效果[6-8]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，γ-聚谷氨酸良好的生物可降解性和高吸水性已被開發(fā)應(yīng)用于植物種子的包衣材料，增強(qiáng)土壤的吸水性，從而使沙漠及缺水干旱地區(qū)的綠化及固沙有了可靠的保障[9]。另外，γ-聚谷氨酸還可作為土壤的增肥劑，促進(jìn)作物吸收養(yǎng)分，減少肥料使用，增加作物產(chǎn)量，改良作物品質(zhì)，提高作物的抗病能力[10-13] 。同時(shí)，γ-聚谷氨酸在土壤中具有很強(qiáng)的保水性，是種子萌發(fā)的促進(jìn)劑，有明顯的抗旱促苗效應(yīng)，可以有效地提高作物的發(fā)芽率和種子活力[14-15] 。γ-聚谷氨酸的成膜性還可以作為保鮮劑用來延長鮮花和蔬菜的保鮮時(shí)間[16]。這些研究都充分展示了聚谷氨酸在農(nóng)業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的巨大潛質(zhì)，使其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更重要的作用。綜合γ-聚谷氨酸在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用及研究成果，γ-聚谷氨酸對植物的抗旱促苗效應(yīng)已有報(bào)道，但不同分子量的γ-聚谷氨酸對植物種子的萌發(fā)及幼苗生長是否具有不同作用還未得到深入研究。本試驗(yàn)采用不同分子量的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子，研究其對綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。

1材料和方法

1.1材料

以市售綠豆種子為試驗(yàn)材料，γ-聚谷氨酸（分子量分別為10、70、120、1 200、2 000 ku），山東福瑞達(dá)生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1種子萌發(fā)試驗(yàn)選擇籽粒飽滿、大小均勻一致、完好無損的綠豆種子，用γ-聚谷氨酸溶液浸種6 h，然后將種子擺放在直徑為15 cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置400粒種子，種臍向下，分別加入20 mL相應(yīng)的γ-聚谷氨酸溶液，各設(shè)置3次重復(fù)。γ-聚谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)為0.02%，γ-聚谷氨酸相對分子質(zhì)量分別為0、10、70、120、1 200、2 000 ku。種子在室溫（溫度為28±1 ℃）下萌發(fā)。

1.2.2指標(biāo)測定種子萌發(fā)指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

發(fā)芽勢=發(fā)芽初期（前5 d）發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽率=發(fā)芽終期（前8 d）發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)處理中分別隨機(jī)取10株幼苗，測量其株高、根長、地上部分鮮質(zhì)量、地下部分鮮質(zhì)量。種子萌發(fā)的1～2 d測定淀粉酶、過氧化氫酶及過氧化物酶活性，分別采用DNS法、愈創(chuàng)木酚法及高錳酸鉀滴定法。

1.3數(shù)據(jù)分析

測定數(shù)據(jù)均用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)作圖比較。

2結(jié)果與分析

2.1不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

2.1.1不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子萌發(fā)的影響由表1可知，不同分子量的γ-聚谷氨酸處理對綠豆種子萌發(fā)有明顯的差異。γ-聚谷氨酸相對分子質(zhì)量為10～120 ku 時(shí)，隨著γ-聚谷氨酸相對分子質(zhì)量的升高，發(fā)芽勢和發(fā)芽率逐漸提高，其中用120 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子，其發(fā)芽勢最高，達(dá)到81.85%，較對照提高了21.25百分點(diǎn)，發(fā)芽率達(dá)到了98.15%。 用1 200 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子，種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均呈下降趨勢，但仍比對照略高。當(dāng)γ-聚谷氨酸的相對分子質(zhì)量提高至 2 000 ku 時(shí)，綠豆種子的萌發(fā)受到了抑制，發(fā)芽勢較對照減少了11.03百分點(diǎn)，發(fā)芽率也有所降低。由此可見，低分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子的萌發(fā)起促進(jìn)作用，而高分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子萌發(fā)起抑制或延緩作用。

2.1.2不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆幼苗生長的影響從圖2可知，10～1 200 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆幼苗時(shí)，主根長、株高以及鮮質(zhì)量均有顯著提高，其中120 ku的 γ-聚谷氨酸處理綠豆幼苗主根最長，達(dá)到14.25 cm，相應(yīng)地，120 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆幼苗的株高、地上部分鮮質(zhì)量和地下部分鮮質(zhì)量也最大，差異均達(dá)到顯著水平。這與其主根最長有很大的相關(guān)性，因?yàn)楦侵参镒钪匾奈账趾瓦\(yùn)輸養(yǎng)料的器官，根系的生長直接影響到幼苗的生長發(fā)育狀況。2 000 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆主根長、株高以及鮮質(zhì)量較對照值小，相比差異不明顯。由此可見，10～1 200 ku 的γ-聚谷氨酸處理對綠豆萌發(fā)期幼苗的主根長、株高和鮮重均有不同程度的促進(jìn)作用，說明低分子量的γ-聚谷氨酸處理對綠豆幼苗的地上部分和地下部分的生長發(fā)育都有很好的促進(jìn)作用，而高分子量的γ-聚谷氨酸可能使幼苗生長受到抑制。

2.2不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆萌發(fā)期淀粉酶、過氧化氫酶及過氧化物酶活性的影響

種子內(nèi)部的一切生理生化反應(yīng)都是在特定酶的催化下進(jìn)行的，酶的活性高低與種子的活力密切相關(guān)。由圖3可知，10～120 ku 的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子時(shí)，種子萌發(fā)后的淀粉酶活性、過氧化氫酶活性及過氧化物酶活性均顯著增強(qiáng)，與對照相比差異較顯著。而1 200 ku和2 000 ku高分子量的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子時(shí)，種子的淀粉酶活性、過氧化氫酶活性及過氧化物酶活性均呈下降趨勢。由此可見，低分子量的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子時(shí)，隨著γ-聚谷氨酸相對分子質(zhì)量的提高，種子萌發(fā)期的淀粉酶活性、過氧化氫酶活性及過氧化物酶活性逐漸增強(qiáng)，其中120 ku的γ-聚谷氨酸處理，除了過氧化氫酶，其余各種酶活性達(dá)到最大，淀粉酶活性、過氧化氫酶活性及過氧化物酶活性分別是對照的2.29倍、1.41倍和1.87倍。

3結(jié)論與討論

植物種子發(fā)芽指標(biāo)是反映種子活力大小的最可靠指標(biāo)，也是反映種子萌發(fā)耐逆性能的最直接指標(biāo)。種子在適宜條件下萌發(fā)時(shí)，淀粉酶活性隨萌發(fā)時(shí)間延長迅速提高，將胚乳中的淀粉分解成糖類供幼苗生長發(fā)育。種子的萌發(fā)狀態(tài)與淀粉酶的活性有關(guān)，酶活性越高，種子活力越高。綠豆經(jīng)γ-聚谷氨酸處理后，種子的淀粉酶活性提高，這與種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和幼苗的根長、株高及鮮質(zhì)量提高具有一致性。種子活力的提高，能夠促進(jìn)種子發(fā)芽，促進(jìn)幼苗的生長發(fā)育，因此，γ-聚谷氨酸在種子萌發(fā)及苗期生長過程中具有重要的作用。

低分子量的γ-聚谷氨酸（10～1 200 ku）促進(jìn)了綠豆萌發(fā)和幼苗的生長，而高分子量的γ-聚谷氨酸（2 000 ku）可能使種子萌發(fā)和幼苗生長處于受脅迫的狀態(tài)，這種脅迫可導(dǎo)致植物代謝系統(tǒng)紊亂，產(chǎn)生大量的活性氧，使脂質(zhì)過氧化并導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，而植物為避免活性氧對膜的損害，將啟動(dòng)抗氧化機(jī)制。生物體中的過氧化氫酶和過氧化物酶是活性氧的主要消除系統(tǒng)，植物體靠增加抗氧化酶的生成量來消除活性氧，保護(hù)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)免受傷害。經(jīng)γ-聚谷氨酸處理的綠豆種子，過氧化氫酶和過氧化物酶活性明顯提高，這樣可以更有利地保護(hù)膜免受活性氧傷害，使種子在一定程度上免受自由基侵害。

在正常生理?xiàng)l件下，植物在代謝過程中超氧化物自由基等活性氧的產(chǎn)生及其消除存在一個(gè)平衡，因此植物不會(huì)累積活性氧。在低分子量（10～1 200 ku）的γ-聚谷氨酸誘導(dǎo)下，綠豆通過提高保護(hù)酶的活性增強(qiáng)植物的抗氧化能力，而高分子質(zhì)量（2 000 ku）的γ-聚谷氨酸可能使種子萌發(fā)和幼苗生長處于受脅迫狀態(tài)而產(chǎn)生更多的活性氧，隨著活性氧的增加，超過抗氧化酶系統(tǒng)的自我清除能力，從而引起過氧化氫酶和過氧化物酶活性降低。

已有研究表明，γ-聚谷氨酸具有提高作物種子對逆境的耐受性，在以PEG-6000模擬干旱脅迫的條件下，施用外源γ-聚谷氨酸可提高小麥和黑麥草的發(fā)芽率，減緩干旱脅迫下鉀離子含量降低的速率，參與植物的滲透調(diào)節(jié)作用，從而增強(qiáng)植物耐旱性[14-18]。2013年，張言芳等研究表明，低溫脅迫下，γ-聚谷氨酸處理水稻種子可以提高抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化程度，提高水稻的耐冷性[19]。2007年Jaleel等發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫條件下長春花體內(nèi)聚谷氨酸激酶活性會(huì)顯著提高[20]。這些研究都表明γ-聚谷氨酸具有抗旱保水的潛力，植物體內(nèi)抗氧化酶的活性直接決定了其抗逆性能的強(qiáng)弱。

γ-聚谷氨酸廣闊的發(fā)展前景和巨大的開發(fā)潛力使其成為2l世紀(jì)氨基酸工業(yè)的發(fā)展趨勢之一。聚谷氨酸的生物可降解性、增肥效應(yīng)及抗旱促苗作用已成為農(nóng)業(yè)研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。我們的研究也表明，γ-聚谷氨酸能夠有效地促進(jìn)綠豆種子的萌發(fā)和幼苗的生長發(fā)育。γ-聚谷氨酸溶液浸種對植物生長發(fā)育的影響可能是個(gè)長期而復(fù)雜的過程，它對植物生長發(fā)育的作用能否持續(xù)到后期，是否可以提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)，還有待于進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Meynell G G，Meynell E. The biosynthesis of poly d-glutamic acid，the capsular material of Bacillus anthracis[J]. Journal of General Microbiology，1966，43（1）：119-138.

[2]Bovarnick M. The formation of extracellular D-glutamic acid polypeptide by Bacillus subtilis[J]. Journal of Biological Chemistry，1942，145（2）：415-424.

[3]游慶紅，張新民，陳國廣，等. γ-聚谷氨酸的生物合成及應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代化工，2002，22（12）：56-59.

[4]疏秀林，施慶珊，黃小茉，等. γ-聚谷氨酸及其衍生物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]. 中國組織工程研究，2012，16（16）：3009-3012.

[5]Auzenne E，Donato N J，Li C，et al. Superior therapeutic profile of poly-L-glutamic acid-paclitaxel copolymer compared with taxol in xenogeneic compartmental models of human ovarian carcinoma[J]. Clinical Cancer Research，2002，8（2）：573-581.

[6]何觀輝. 聚谷氨酸與聚谷氨酸水膠——化妝品原料家族中的新“明星”[J]. 中國化妝品：專業(yè)版，2006（11）：16-17.

[7]Liu X，Liu F，Liu S Y，et al. Poly-γ-glutamate from Bacillus subtilis inhibits tyrosinase activity and melanogenesis[J]. Applied Microbiology & Biotechnology，2013，97（22）：9801-9809.

[8]Ben-Zur N，Goldman D M. γ-Poly glutamic acid：a novel peptide for skin care[J]. Cosmetics & Toiletries，2007，122：64-72.

[9]Choi H J，Kunioka M. Preparation conditions and swelling equilibria of hydrogel prepared by γ-irradiation from microbial poly（γ-glutamic acid）[J]. Radiation Physics & Chemistry，1995，46（2）：175-179.

[10]王潤凡，尹業(yè)雄，胡世權(quán)，等. PGA增效劑在溫州蜜柑中施用效果的評價(jià)[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（4）；884-887.

[11]劉端義，梅金先，張旅峰，等. 聚-γ-谷氨酸及其增效肥在水稻上的應(yīng)用[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（10）；2390-2394，2400.

[12]李漢濤，楊國正，柯云，等. 聚γ-谷氨酸增效復(fù)合肥對油菜產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（10）：2395-2397.

[13]許宗奇，萬傳寶，許仙菊，等. 肥料增效劑γ-聚谷氨酸對小青菜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J]. 生物加工過程，2012，10（1）：58-62.

[14]王傳海，何都良，鄭有飛，等. 保水劑新材料γ-聚谷氨酸的吸水性能和生物學(xué)效應(yīng)的初步研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)氣象，2004，25（2）：19-22.

[15]尹成紅，雍曉雨，冉煒，等. 產(chǎn)γ-聚谷氨酸菌株的篩選及其對玉米幼苗生長的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（2）：91-96.

[16]疏秀林，施慶珊，馮勁，等. γ-聚谷氨酸對荔枝常溫貨架保鮮效果研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（21）：318-321.

[17]張新民，姚克敏，徐虹. 新型高效吸水材料（γ-PGA）的農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究初報(bào)[J]. 南京氣象學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，27（2）：224-229.

[18]朱安婷，蔣友武，謝國生，等. 外源聚γ-谷氨酸對水稻幼苗耐旱性和滲透調(diào)節(jié)的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，24（6）：1269-1273.

[19]張言芳，周慧梅，蔡克桐，等. 無機(jī)鹽混合試劑與γ-PGA復(fù)合處理對早稻苗期耐冷性的引發(fā)和分子效應(yīng)分析[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（12）：2323-2330.

[20]Jaleel C A，Manivannan P，Sankar B，et al. Water deficit stress mitigation by calcium chloride in Catharanthus roseus：effects on oxidative stress，proline metabolism and indole alkaloid accumulation[J]. Colloids & Surfaces B： Biointerfaces，2007，60（1）：110-116.