胡云 徐如宏++程劍平

摘要：利用分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法，將來(lái)自美國(guó)的小麥高蛋白基因GPC-B1與抗白粉病基因Pm21，優(yōu)質(zhì)亞基1Dx5、1Dy10等優(yōu)良基因聚合到同一植株。首先將攜帶高蛋白含量基因GPC-B1小麥分別與抗白粉病基因Pm21、優(yōu)質(zhì)亞基1Dx5、1Dy10小麥雜交得到F2，利用分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)親本及雜交后代進(jìn)行篩選，結(jié)合小麥抗病性鑒定、小麥籽粒蛋白質(zhì)含量測(cè)定等方法對(duì)結(jié)果做進(jìn)一步鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2群體中100個(gè)株系中有6株聚合了GPC-B1、Pm21、1Dx5、1Dy10 4種基因，11株聚合高蛋白基因GPC-B1和抗白粉病基因Pm21，8株聚合了GPC-B1和5+10亞基。本研究為培育具有高蛋白含量及多個(gè)優(yōu)質(zhì)基因的小麥優(yōu)良品系提供了育種材料和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥；優(yōu)質(zhì)；基因；聚合；高蛋白

中圖分類號(hào)： S512.103文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0050-03

收稿日期：2015-05-13

基金項(xiàng)目：貴州省省長(zhǎng)基金 （編號(hào)：2005175）。

作者簡(jiǎn)介：胡云（1982—），女，貴州織金人，講師，從事作物遺傳育種研究。E-mail：705498263@qq.com。

通信作者：徐如宏，教授，碩士生導(dǎo)師，從事小麥遺傳育種及分子標(biāo)記研究，E-mail：xrhgz@163.com；程劍平，教授，博士生導(dǎo)師，從事野生麥類作物和我國(guó)西南巖溶地區(qū)石漠化綜合治理研究，E-mail：chengjianping@gmail.com。傳統(tǒng)育種技術(shù)通常受環(huán)境條件和顯隱性關(guān)系等因素的影響，存在效率低、選擇時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。分子標(biāo)記輔助選擇則可降低育種盲目性、縮短育種時(shí)間、提高選擇效率[1-2]。在聚合育種方面，相關(guān)報(bào)道并不少見(jiàn)，如通過(guò)聚合育種獲得了帶有抗白粉病基因Pm2+Pm4a，Pm4a+Pm21的新品系[3-4]，以及具有優(yōu)質(zhì)亞基HNW-GS 1、14+15、5+10的聚合體[5-8]。但是，相關(guān)報(bào)道基本上是針對(duì)不同基因控制的同一表現(xiàn)性狀，而本研究是利用傳統(tǒng)育種和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法，將高蛋白含量基因GPC-B1、抗白粉病基因Pm21以及優(yōu)質(zhì)亞基1Dx5和1Dy10等控制不同性狀的優(yōu)良基因進(jìn)行雜交，選育出聚合有GPC-B1、Pm21、1Dx5和1Dy10等優(yōu)質(zhì)基因的植株，為小麥選育優(yōu)良種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本研究選用11個(gè)試驗(yàn)小麥材料，詳見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用CTAB法[9]提取小麥親本、雜交F1總DNA，以及100個(gè)F2抗病單株的DNA。待小麥長(zhǎng)至3～4片葉時(shí)，取0.2 g新鮮幼嫩葉片放入研缽中，加入750 μL的提取緩沖液磨碎，緩沖液為50 mmol/L EDTA-Na2，100 mmol/L Tris-HCl，2% CTAB，100 mmol/L NaCl；倒入1.5 mL 離心管65 ℃下水浴1 h，其間上下顛倒2次；加入等體積的氯仿-異戊醇（24 ∶ 1），混勻10 min，18 ℃、13 000 r/min 冷凍離心機(jī)內(nèi)離心10 min；取上清液放入1.5 mL 離心管中，加入750 μL異丙醇混勻10 min；去上清液，加入1 mL 70%乙醇清洗DNA，室溫下放置5～10 min，7 500 r/min 離心5 min，去上清液、干燥。加入100 μL 0.1×TE混勻，37 ℃下水浴1 h，取2 μL總DNA，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)其純度和濃度。其余DNA在4 ℃條件下保存。

1.2.2小麥優(yōu)質(zhì)基因的分子標(biāo)記輔助選擇（1）小麥高蛋白基因的SSR分析。與高蛋白基因GPC-B1連鎖的特異引物為Xuhw89[9]，其序列為：UHW89-BF：5′-TCTCCAAGAGGGGAGAGACA-3′，UHW89-R：5′-TTCCTCTACCCATGAATCTAGCA-3′。特異引物UHW89-BF、UHW89-R擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記為SSR122。所有PCR反應(yīng)都在Perkin-Thermocycle 480上進(jìn)行，反應(yīng)總體積為20 μL。SSR反應(yīng)體系中含有10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.8），50 mmol/L KCl；2 mmol/L MgCl2；100 μmol/L dNTP；0.5 μmol/L 特異引物；1U Taq DNA聚合酶（上述藥品均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；50～100 ng模板DNA，加ddH2O至終體積 20 μL。加1滴礦物油覆蓋后進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)40次；最后 72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保存。

（2）小麥抗白粉病基因的SCAR分析。與Pm21基因連鎖的SCAR引物序列：D-R： 5′-CCTCGTTGTCAGCCTCTATG-3′，D-L：5′-CTATGGAGTATCAATACGACTCCT-3′。 其擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記SCAR140。SCAR反應(yīng)體系中含有 10 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.8），50 mmol/L KCl；2 mmol/L MgCl2；100 μmol/L dNTP；0.5 μmol/L 特異引物；1 U Taq DNA聚合酶；50～100 ng模板DNA，加ddH2O至終體積20 μL。加1滴礦物油覆蓋后進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)40次；最后 72 ℃ 延伸 5 min，4 ℃保存。

（3）小麥高分子量谷蛋白亞基的PCR分析[10-15]。1對(duì)Glu-D1y位點(diǎn)的特異引物設(shè)計(jì)[7]，其序列為：10S-1：5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，10S-2：5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；與Glu-D1x位點(diǎn)連鎖的特異引物序列為：P1：5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P2：5′-GAAACCTGCTGCGGACAAGT-3′。1Dx5基因擴(kuò)增片段為450 bp，1Dy10基因擴(kuò)增片段為576 bp。擴(kuò)增程序同上。

1.2.3小麥白粉病的抗性鑒定參照徐如宏等的方法[5]。當(dāng)感病對(duì)照萊州137發(fā)病嚴(yán)重時(shí)對(duì)田間所有小麥植株進(jìn)行白粉病抗性鑒定和記錄。

1.2.4小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用微量凱氏定氮法測(cè)定小麥籽粒的蛋白質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱取0.1 g干燥樣品3份于50 mL消化管內(nèi)，加0.5 g催化劑（硫酸鉀 ∶ 硫酸銅=3 ∶ 1）、5 mL 30%過(guò)氧化氫-濃硫酸-蒸餾水（3 ∶ 2 ∶ 1）混合液。稍加振蕩，斜置于電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行消化；消化到溶液顯淺藍(lán)綠色的透明狀時(shí)，繼續(xù)加熱沸騰10 min。撤離熱源，待消化液冷卻至室溫后，加水10～20 mL，待溶液溫度降至室溫后，轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶中，加水稀釋到刻度混勻備用。然后用Foss kjeltecTM2200型全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1小麥高蛋白含量基因GPC-B1的SSR標(biāo)記

引物Xuhw89 在122 bp的位置顯示特征帶，4個(gè)小麥高蛋白材料都在同一位置出現(xiàn)了1條特征DNA片段。對(duì)照材料萊州137和其他5個(gè)貴州地方小麥材料都不具有此特征帶（圖1）。再對(duì)F2群體的100個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)，其中76株中檢測(cè)出攜帶GPC基因，24株未檢測(cè)出特異帶（圖2）。

2.2Glu-1位點(diǎn)等位基因的PCR檢測(cè)

2.2.1小麥優(yōu)質(zhì)亞基1Dx5特異PCR標(biāo)記對(duì)F2群體的

100個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)，其中在38株中未檢測(cè)出特異帶，62株中檢測(cè)出攜帶1Dx5基因（圖3）。1Dx5亞基引物的特異性較強(qiáng)，可用作1Dx5基因的PCR檢測(cè)。

2.2.21Dy10亞基特異PCR標(biāo)記對(duì)F2群體的100個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)），其中42個(gè)樣本株中檢測(cè)出攜帶1Dy10基因，58株中未檢測(cè)出特異帶（圖4）。對(duì)HWM-GS基因檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為共顯性（10亞基的PCR標(biāo)記）或顯性（5亞基的PCR標(biāo)記），與梁榮奇等的研究結(jié)果[15]一致。

2.3抗白粉病基因的SCAR標(biāo)記

對(duì)F2群體中100個(gè)單株進(jìn)行抗白粉病基因Pm21分子標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5和表2。具有抗病標(biāo)記的單株有78株，無(wú)特異標(biāo)記的有22個(gè)單株。在F2群體中，抗白粉病性狀呈現(xiàn)近3 ∶ 1的比例，表明了抗白粉病基因Pm21是顯性單基

因控制的遺傳。

2.4小麥白粉病抗性鑒定

為驗(yàn)證小麥抗白粉病基因分子標(biāo)記結(jié)果，對(duì)親本材料及F2群體中的100個(gè)單株分別進(jìn)行了田間白粉病抗性鑒定。鑒定結(jié)果表明，親本材料中除X-2003、貴農(nóng)775、貴農(nóng)17號(hào)、貴農(nóng)21、laura×貴農(nóng)21 F1對(duì)白粉病免疫以外，萊州137和4份高蛋白材料A-GPC、R-GPC、PF638741、PI638740均感病。另外，PI638740的成熟期比其他研究材料提前1周左右；F2群體中100個(gè)單株的白粉病抗性見(jiàn)表2（此處僅列出前20個(gè)單株的鑒定結(jié)果）。

在F2群體中的100個(gè)單株中，同時(shí)具有5+10亞基、高蛋白基因GPC-B1和抗白粉病基因Pm21標(biāo)記的單株有6株；同時(shí)有高蛋白基因、抗白粉病基因標(biāo)記的有11株；具有高蛋白基因GPC-B1和5+10亞基的群體為8 株。

2.5小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

用微量凱氏定氮法對(duì)供試材料進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（表3）。 7個(gè)母本材料中小麥蛋白質(zhì)含量在13.05%～1861%，平均含量16.55%。4個(gè)父本中PI638740的蛋白質(zhì)含量比另外3個(gè)材料較高，為20.41%；其余3個(gè)高蛋白材料比部分貴州當(dāng)?shù)夭牧系牡鞍踪|(zhì)含量低，而分子標(biāo)記的結(jié)果表明它們均含有高蛋白含量基因GPC-B1，這可能是由于地理、氣候等方面的因素所致，使其性狀未表達(dá)。在4組雜交F1中，小麥籽粒蛋白質(zhì)含量有的在2個(gè)親本之間，有的比蛋白質(zhì)含量最低的親本稍小。

3討論

本研究表明，來(lái)自美國(guó)的高蛋白材料PI638740不僅蛋白質(zhì)含量比貴州當(dāng)?shù)匦←湼?，而且其成熟期也提?周左右[8-13]。對(duì)于4個(gè)攜帶高蛋白基因的育種材料而言，綜合其分子標(biāo)記輔助選擇、小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的測(cè)定、抗病性鑒定以及成熟時(shí)間來(lái)看，在今后的小麥育種過(guò)程中，我們將首選PI638740作為父本材料來(lái)進(jìn)行下一步的聚合研究。蛋白質(zhì)含量低一直是貴州小麥品質(zhì)發(fā)展的一個(gè)瓶頸，GPC基因是小麥育種者眼中的一個(gè)亮點(diǎn)，是提高貴州小麥蛋白質(zhì)含量的一個(gè)寶貴資源，將其轉(zhuǎn)育到具有優(yōu)質(zhì)基因的小麥種質(zhì)中是一個(gè)重要育種目標(biāo)，有望進(jìn)一步改善貴州小麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以逐漸符合人們對(duì)小麥越來(lái)越高的飲食要求。

在本研究中，利用分子標(biāo)記輔助選擇和多基因聚合研究相結(jié)合，快速準(zhǔn)確鑒別所需轉(zhuǎn)移的目的基因，對(duì)選育優(yōu)質(zhì)、高蛋白質(zhì)、抗病的小麥品種（系）具有重要意義。跟傳統(tǒng)育種技術(shù)相比，分子標(biāo)記技術(shù)在育種過(guò)程中不僅可以對(duì)早代材料的目的基因進(jìn)行選擇，并且還能快速掌握親本的育種特點(diǎn)，對(duì)其選擇適合的雜交方式如回交、復(fù)交等，可縮短育種年限，大大提高育種效率，加快品種的繁育速度。

本研究通過(guò)傳統(tǒng)育種技術(shù)和分子標(biāo)記相結(jié)合的育種方式，將控制高蛋白含量的基因GPC-B1、與烘烤品質(zhì)有關(guān)的優(yōu)質(zhì)亞基1Dx5、1Dy10和抗白粉病基因Pm21中的2個(gè)或2個(gè)以上的基因聚合到同一植株中，為培育貴州小麥新品系提供了重要育種材料和理論依據(jù)。

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