汪文倫+++王丹+++牟云++許萬(wàn)云+++胡夢(mèng)薇++高劍峰

摘要：以建立小球藻（沙漠小球藻）表達(dá)系統(tǒng)為目的，為利用小球藻重組表達(dá)外源蛋白，以及GFP熒光特性研究沙漠中的小球藻生理及理化性質(zhì)提供基礎(chǔ)方法；同時(shí)也探索植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS能否在沙漠小球藻中表達(dá)。通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證E.coli DH5α是否含有目的基因（GFP基因）的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，然后從E.coli DH5α中提取也構(gòu)建完成的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS；利用電轉(zhuǎn)化的方法將重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS轉(zhuǎn)入到小球藻細(xì)胞中；將電轉(zhuǎn)的小球藻在含有 100 mg/L 卡那霉素的BBM固體培養(yǎng)基中篩選出單克隆，將單克隆在含有15 mg/L卡那霉素的BBM液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，然后利用PCR和RT-PCR預(yù)測(cè)綠色熒光蛋白基因（GFP基因）的存在與否和表達(dá)情況，再利用SDS-PAGE和熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。通過(guò)SDS-PAGE和熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果表明綠色熒光蛋白（GFP）在小球藻中表達(dá)成功。試驗(yàn)結(jié)果表明重組植物表達(dá)pCAMBIA2300-35S-OCS能夠在小球藻中表達(dá)外源蛋白，以及利用GFP的熒光特性研究小球藻的生理生化差異；也為小球藻在沙漠環(huán)境上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：沙漠小球藻；電轉(zhuǎn)化；植物表達(dá)載體；綠色熒光蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)： S917.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0041-04

微藻是地球上出現(xiàn)最早的生命之一，是一種能利用光合作用生活和生長(zhǎng)的微生物，廣泛分布于海洋、陸地、湖泊以及干旱的沙漠之中。它們的形態(tài)各異，呈絲狀、球形和橢圓形等等，只要是有光和潮濕的地方都能找到這些生命的痕跡[1]。新疆古爾班通古特沙漠是我國(guó)第二大沙漠，年降水量70～150 mm，冬季有積雪，其最低溫度可達(dá)-25 ℃，而最高溫度可達(dá)35 ℃[2]。即使在這樣的條件下，也分布著百余種藻類(lèi)，小球藻就是其中之一[3]。小球藻和其他生長(zhǎng)在沙漠里的藻類(lèi)一樣，適應(yīng)了沙漠的極端環(huán)境，表現(xiàn)出較強(qiáng)的生命力。

小球藻是綠藻門(mén)的一種，細(xì)胞呈球形或橢圓形，細(xì)胞的大小在3～8 μm之間，也是單細(xì)胞藻類(lèi)植物和真核生物的一種。由于遺傳的相對(duì)保守性﹑生長(zhǎng)快﹑分布廣﹑營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單和成本低廉等特點(diǎn)，是在單細(xì)胞水平上研究基因表達(dá)及其生理生化的理想材料。而基因工程也是研究熱點(diǎn)之一，目前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有鳥(niǎo)槍法[4]﹑根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[5]和電轉(zhuǎn)化法[6]。由于電轉(zhuǎn)化法有效率較高、簡(jiǎn)單、方便、成本低等特點(diǎn)，在微藻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中也被廣泛使用。

啟動(dòng)子是外源基因是否表達(dá)的關(guān)鍵，這決定著基因表達(dá)與否及其表達(dá)量，所以在小球藻基因工程的研究中也起著至關(guān)重要的作用。目前，CaMV35S 是基因工程中常用的啟動(dòng)子之一。CaMV35S 是一種花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子，能夠在植物表達(dá)系統(tǒng)中啟動(dòng)基因的表達(dá)[7]，也有研究表明CaMV35S可以在小球藻表達(dá)外源基因[5，8]。

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP） 是由238個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，分子量約為27 ku，基因編碼序列約 750 bp。純化的GFP蛋白與體內(nèi)表達(dá)的GFP蛋白的發(fā)光光譜相似，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下，無(wú)論其表達(dá)在原核或真核細(xì)胞中，都能利用熒光顯微鏡在不需要其他輔助條件下看見(jiàn)綠色熒光。綠色熒光蛋白還具有低毒性和不干擾細(xì)胞正常生活等優(yōu)點(diǎn)，使得GFP在生物研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。目前GFP已在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域、基因表達(dá)的蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞定位以及藥物的篩選等諸多方面得到廣泛應(yīng)用[9]。

本試驗(yàn)將利用GFP的特點(diǎn)和已經(jīng)構(gòu)建好的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到細(xì)胞中，讓其表達(dá)綠色熒光。這將為在小球藻中表達(dá)外源蛋白和利用GFP研究其生理及理化性質(zhì)提供試驗(yàn)的基本操作和基礎(chǔ)；同時(shí)也為表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS在小球藻中的表達(dá)做1個(gè)預(yù)測(cè)。

1材料與方法

1.1材料

小球藻GTD8A1由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離、純化和鑒定得到；植物表達(dá)載體PCAMBIA2300-35S-GFP-OCS （帶有CaMV35S調(diào)控下的GFP基因）由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃先忠老師饋贈(zèng)；大腸桿菌DH5α菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；卡那霉素（kanamycin，Kan）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

小球藻GT8A1所用的BBM培養(yǎng)基[10]：NaNO3 250 mg/L，KH2PO4 175 mg/L，K2HPO4 75 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，NaCl 25 mg/L，EDTA 50 mg/L，KOH 31 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO4 11.42 mg/L，ZnSO4·[JP3]7H2O 8.82 mg/L，MnCl2 1.44 mg/L，MoO3 0.71 mg/L[JP]，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98% H2SO4 2 μL/L（可以在以上組中加入15～20 g瓊脂，加入蒸餾水補(bǔ)至1 L制成固體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存）。

E.coli DH5α所用的LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L（加去離子水溶解至終體積1 L，用2 mol/L NaOH調(diào)pH值范圍為7.0～7.4，同時(shí)加入15～20 g 瓊脂粉，制成固體培養(yǎng)基；在121 ℃高壓下滅菌20 min，4 ℃ 保存）。

1.2方法

1.2.1藻種培養(yǎng)及其條件取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的小球藻培養(yǎng)液，按10%的接種量接入裝有100 mL BBM培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度為100 μmol/（m2·s），光暗周期12 h/12 h，培養(yǎng)溫度（23±0.5） ℃。

轉(zhuǎn)化子克隆的篩選：將轉(zhuǎn)化好的小球藻GT8A1涂布于含有100 mg/L卡那霉素[1]的BBM固體平板上，4～5周會(huì)有單克隆長(zhǎng)出。然后進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，得到陽(yáng)性克隆。

陽(yáng)性克隆的擴(kuò)大培養(yǎng)：將陽(yáng)性克隆接入到含有15 mg/L卡那霉素的BBM液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2提取pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS和GFP引物設(shè)計(jì)GFP基因引物設(shè)計(jì)：從NCBI上得到GFP蛋白的序列，通過(guò)Primer 5 軟件從頭開(kāi)始設(shè)計(jì)GFP基因引物，使其能完全地表達(dá)GFP蛋白。引物序列如下：GFP-F：5′-ATGATGGTGAGCAAG-3′；GFP-R：5′-TGTACAGCTCGTCCATG-3′。

pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS載體也由黃先忠老師實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成，并且成功地在擬南芥中表達(dá)[11]。也將其保存到E.coli DH5α中，在做電擊轉(zhuǎn)化之前需要將E.coli DH5α進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)后，才能進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。然后采用質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN Plasmid Kit）進(jìn)行提取，其過(guò)程見(jiàn)圖1。

[FK（W19][TPWWL1.tif][FK）]

PCR反應(yīng)體系：ddH2O 8 μL，單克隆變性液2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China） 8 μL共20 μL擴(kuò)增體系，可以擴(kuò)增出約750 bp的片段。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3電擊轉(zhuǎn)化法取培養(yǎng)4 d后的小球藻細(xì)胞3～5 mL（細(xì)胞數(shù)量控制在1×108個(gè)/mL），75 000 g離心 5 min 收集小球藻細(xì)胞后再用無(wú)菌的BBM培養(yǎng)基清洗3次培養(yǎng)基，然后分別在5 000、4 000、3 000 g下離心以收集比較干凈的小球藻細(xì)胞；將收集好的小球藻細(xì)胞置于高滲溶液中（甘露醇、山梨醇各100 μL）在冰上處理約1 h，后3 000 g離心收集比較干凈的小球藻細(xì)胞，去掉上清，在沉淀中加入pH值為7.2的HEPS電擊緩沖液[取23.8 g HEPES溶于 90 mL 雙蒸水中，采用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.5～8.0，然后用蒸餾水定容至100 mL，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（2 mL/瓶），4 ℃保存]，將藻細(xì)胞稀釋成1×108個(gè)/mL放置冰上備用；用紫外光處理干凈的電擊杯約30 min，將其放置在冰上備用；按藻細(xì)胞 ∶[KG-*3]質(zhì)粒=3 ∶[KG-*3]1的比例混勻樣本加入到電擊杯中，在冰上放置10 min后，在電擊儀上電擊，電擊條件為脈沖電壓1 500 V，持續(xù)時(shí)間0.2 s，脈沖距離2 mm；電擊后的藻細(xì)胞置于含有 3 mL 復(fù)活培養(yǎng)基的6孔板中，在黑暗的條件下復(fù)活24～48 h；7 000 g離心1 min收集轉(zhuǎn)化小球藻細(xì)胞，再用無(wú)菌的BBM培養(yǎng)基清洗3次，然后分別5 000、4 000、3 000 g下離心收集比較干凈的小球藻細(xì)胞涂布于含有100 mg/L卡那霉素的BBM固體平板上，篩選單克隆。培養(yǎng)4～6周后會(huì)有單克隆長(zhǎng)出，然后將平板上所長(zhǎng)的單克隆用無(wú)菌的牙簽挑起后置于10 μL的ddH2O中，95 ℃預(yù)變性后作為PCR反應(yīng)的模板，用PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆。

PCR反應(yīng)體系：ddH2O 8 μL，單克隆變性液2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China） 8 μL共20 μL擴(kuò)增體系，可以擴(kuò)增出約750 bp的片段。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。 PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4基因組DNA和總RNA的提取及目的基因檢測(cè)基因組DNA的提?。翰捎肈NA提取試劑盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）提取，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

總RNA的提?。翰捎肨RIzol試劑（Invitrogen USA）進(jìn)行提取，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

總RNA采用TaKaNa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA后，和總DNA一樣采用PCR檢測(cè)目的基因。

PCR反應(yīng)體系：ddH2O 8 μL，單克隆變性液 2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China）8 μL共20 μL擴(kuò)增體系，可以擴(kuò)增出約750 bp的片段。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5綠色熒光蛋白的SDS-PAGE和熒光檢測(cè)經(jīng)過(guò)基因組DNA和總RNA的檢測(cè)后。將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，取 10～15 mL的培養(yǎng)藻液75 000 g離心2 min收集轉(zhuǎn)化子的小球藻細(xì)胞后，用無(wú)菌的ddH2O清洗3次，然后利用梯度離心法：分別再5 000、4 000、3 000 g離心5 min后收集到轉(zhuǎn)化子小球藻細(xì)胞，采用蛋白試劑盒提?。≒lant Protein Extraction Kit）提取GFP蛋白，提取過(guò)程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將提取到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；然后采用熒光倒置顯微鏡（北京斯內(nèi)克創(chuàng)新科技有限公司）進(jìn)行熒光檢測(cè)。操作過(guò)程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，檢測(cè)GFP蛋白的表達(dá)情況。

2結(jié)果與分析

2.1提取pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS和菌落PCR檢測(cè)

通過(guò)菌落PCR檢測(cè)含有pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS載體的E.coli DH5α菌株，將含有陽(yáng)性克隆的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS的E.coli DH5α進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并用于后續(xù)試驗(yàn)，過(guò)程和結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

2.2單克隆PCR檢測(cè)

通過(guò)涂布篩選得到的單克隆藻細(xì)胞，菌落PCR檢測(cè)結(jié)果（圖3）表明，重組質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS可能轉(zhuǎn)化進(jìn)入到小球藻細(xì)胞中。

2.3基因組DNA和總RNA的提取以及PCR鑒定

經(jīng)過(guò)DNA提取試劑盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）提取的總基因組DNA，通過(guò)PCR檢測(cè)750 bp的GFP基因片段?？偦蚪MDNA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明GFP基因整合在小球藻基因組中。

經(jīng)過(guò)TRIzol試劑（Invitrogen USA）提取總RNA，結(jié)果見(jiàn)圖5-A。然后通過(guò)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄出cDNA作為模板，通過(guò)PCR檢測(cè)750 bp的GFP基因片段，結(jié)果見(jiàn)圖5-B，通過(guò)結(jié)果預(yù)測(cè)GFP基因整合在小球藻基因組中，同時(shí)GFP基因也在小球藻細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成功。

2.4綠色熒光蛋白的SDS-PAGE和熒光檢測(cè)

通過(guò)植物蛋白提取試劑盒對(duì)GFP蛋白提取后，用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6。然后將通過(guò)梯度離心獲得的轉(zhuǎn)化小球藻細(xì)胞，在綠色熒光倒置顯微鏡下觀察其表達(dá)結(jié)果（圖7）。結(jié)果表明GFP蛋白成功表達(dá)于小球藻中。說(shuō)明植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S可以在小球藻中表達(dá)外源蛋白，同時(shí)也可以做小球藻生理生化的研究載體。

3討論

我們都知道綠色熒光蛋白在植物和動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)成功的例子不勝枚舉，但是在微藻中的研究少之又少。近年，隨著微藻優(yōu)勢(shì)及其有關(guān)基因組基因測(cè)序[12]開(kāi)發(fā)而來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)此的研究也越來(lái)越熱。從國(guó)外的研究進(jìn)展來(lái)看，有研究表明GFP蛋白在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）細(xì)胞中成功表達(dá)[13-14]?？梢钥吹絿?guó)外多是以萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作為模式生物來(lái)研究外源基因的表達(dá)系統(tǒng)；因此，在國(guó)內(nèi)Jiang等研究者以小球藻為模式生物來(lái)研究其外源基因的表達(dá)系統(tǒng)，并且和萊茵衣藻進(jìn)行了表達(dá)的相關(guān)比較得知，小球藻表達(dá)外源基因系統(tǒng)優(yōu)于萊茵衣藻[15]。與此同時(shí)，Song等利用相關(guān)的技術(shù)和pAnFP為表達(dá)載體，在魚(yú)腥藻（Anabeana）中成功表達(dá)了綠色熒光蛋白，并通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察到了綠色熒光[16]。

同樣，Guo等利用相似的轉(zhuǎn)基因技術(shù)和pCAMBIA1302為載體，在斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）細(xì)胞中成功表達(dá)了綠色熒光蛋白[17]。由于GFP易于標(biāo)記和辨認(rèn)，這使得使用GFP來(lái)研究表達(dá)系統(tǒng)及其生理生化也越來(lái)越重要。然而通過(guò)上面的討論，知道不同宿主需要不同的表達(dá)載體。提示在進(jìn)行基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化研究時(shí)，特別是表達(dá)一些藥用外源蛋白時(shí)，進(jìn)行表達(dá)載體的表達(dá)篩選也顯得尤為重要，這將確定最佳的表達(dá)載體以及減少不必要的浪費(fèi)。

目前，有關(guān)綠色熒光蛋白（GFP）在小球藻中表達(dá)還未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，利用電轉(zhuǎn)化的方法將重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS導(dǎo)入到小球藻中，通過(guò)基因組DNA和總RNA的理論分析和預(yù)測(cè)，得知綠色熒光蛋白基因可能整合在小球藻基因組中，并且進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄。然后再通過(guò)熒光倒置顯微鏡證實(shí)了GFP成功地表達(dá)于小球藻中，從而驗(yàn)證植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S能夠用于小球藻中表達(dá)外源蛋白基因，這對(duì)于小球藻這種低等植物來(lái)說(shuō)，將來(lái)可以利用此載體來(lái)研究小球藻的生理生化性質(zhì)和表達(dá)外源蛋白，這也為小球藻利用基因工程商業(yè)化和工業(yè)化提供基礎(chǔ)材料，同時(shí)也為沙漠環(huán)境上的開(kāi)發(fā)和利用提供基礎(chǔ)技術(shù)。

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