韓蕾 李俊林 蘇彥華

摘要：對擬南芥kea突變體表型分析的結(jié)果表明，在黑暗條件下，單個KEA缺失后下胚軸和主根伸長與野生型相比沒有明顯差異，而多個KEA缺失導(dǎo)致幼苗出現(xiàn)去黃化現(xiàn)象，表現(xiàn)為下胚軸伸長受到抑制，子葉完全打開，真葉開始出現(xiàn)，主根發(fā)育良好。qRT-PCT結(jié)果表明，呈現(xiàn)去黃化現(xiàn)象的kea多突變體內(nèi)生長素合成基因[WTBX][STBX]IAA1、IAA3、IAA17[WTBZ][STBZ]的表達下調(diào)，而生長素轉(zhuǎn)運基因[WTBX][STBX]AUX1、PIN1、PIN3、PIN7[WTBZ][STBZ]的表達沒有明顯變化。外源施加生長素類似物NAA能夠恢復(fù)kea多突變體去黃化現(xiàn)象。上述結(jié)果暗示KEA在調(diào)控擬南芥光調(diào)控發(fā)育的某些方面發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：擬南芥；去黃化；生長素；暗形態(tài)建成

中圖分類號： Q945.12文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）06-0030-03

植物在光照下和黑暗中表現(xiàn)為不同的生長特性；光照下萌發(fā)的幼苗表現(xiàn)為：下胚軸伸長受抑制、主根伸長、子葉展開、葉綠素累積，稱為光形態(tài)建成（photomorphogenesis）。在黑暗中，植物的生長呈現(xiàn)出多種黃化特征，稱為暗形態(tài)建成（skotomorphogenesis）[1]。黃化苗主要特點為迅速生長和伸長的下胚軸、發(fā)育遲緩的主根、閉合的子葉形成頂端彎鉤（apical hook）[2]。在自然界中，種子發(fā)芽起始于暗形態(tài)建成過程：種子萌發(fā)后，大部分營養(yǎng)資源流向下胚軸，用于下胚軸伸長而不是子葉和根系的發(fā)育，這種快速伸長的方式為幼苗更早的接收光照提供了物理支持。此外，子葉通過緊閉形成頂端彎鉤以保護地上部分生組織在幼苗破土而出時免遭傷害。這一生長策略能夠保證幼苗在光合作用之前種子中貯備的有限營養(yǎng)物質(zhì)更有效利用[3]。

暗形態(tài)建成過程受多種植物激素如生長素、脫落酸、細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯、赤霉素和乙烯的調(diào)控[2，4-7]。生長素能夠促進多種植物器官的伸長，例如：下胚軸、胚芽鞘和根，其機理早在20世紀(jì)70年代由酸生長理論所解釋[8-9]。此理論表明在數(shù)分鐘內(nèi)，通過細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATPase生長素促進質(zhì)子外排，此過程降低了質(zhì)外體間pH值，促進細(xì)胞壁松弛[10]。本研究篩選到幾個kea突變體，其暗形態(tài)過程發(fā)生改變，通過分析下胚軸、主根的表觀特征，并利用基因表達和藥理學(xué)試驗初步研究了其去黃化特征對生長素響應(yīng)的改變，以期探討KEA基因在擬南芥發(fā)育過程中的功能，為進一步闡述擬南芥光發(fā)育的相關(guān)機制提供良好的試驗材料。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1[JP2]植物材料擬南芥野生型Col-0，單突變體[WTBX][STBX]kea3、kea4、kea5、kea6[WTBZ][STBZ]；雙突變體[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]，多突變體體[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]。其中[WTBX][STBX]kea3、kea4、kea5、kea6[WTBZ][STBZ]單突變體種子從ABRC擬南芥種子資源庫購得。雙突變體和多突變體通過雜交方法得來。[JP]

1.1.2生長條件和培養(yǎng)基光照培養(yǎng)箱（MMM，Germany）的培養(yǎng)條件為：溫度23 ℃，相對濕度70%，連續(xù)黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)基修改自Pilot 等的配方[11]，成分包括：1 mmol/L CaSO4，2 mmol/L NH4NO3，1 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgSO4，50 μmol/L NaFe-EDTA，50 μmol/L H3BO3，12 μmol/L MnCl2，1 μmol/L CuCl2，1 μmol/L ZnCl2，30 nmol/L （NH4）6Mo7O24，2.4 mmol/L MES（2-嗎啉己磺酸），10 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，用1 mmol/L KOH調(diào)至pH值5.7，121 ℃，100 kPa 滅菌20 min。

1.2試驗方法

1.2.1擬南芥種子消毒和播種擬南芥種子，先用70%乙醇沖洗30 s，再用含有體積分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉和5 g/L SDS （十二烷基硫酸鈉）的消毒液沖洗，并且劇烈振蕩5 min，然后用無菌水沖洗5次，最后再加少量無菌水，4 ℃冰箱放置 48 h。播種于培養(yǎng)基，用醫(yī)用膠帶密封后豎直放置在生長箱培養(yǎng)。

1.2.2激素處理試驗配制10 mmol/L 生長素類似物NAA，待培養(yǎng)基滅菌冷卻至65 ℃左右，在超凈工作臺中，將NAA母液按照一定的稀釋倍數(shù)添加到培養(yǎng)基。

1.2.3下胚軸和主根長測量擬南芥野生型和突變體在正常培養(yǎng)基或含有不同濃度NAA的培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)8 d后，以直尺為參照進行拍照（Cannon G8），使用ImageJ軟件按照直尺比例分析下胚軸和主根長。

1.2.4擬南芥RNA提取及反轉(zhuǎn)錄采用Trizol（TaKaRa）分別提取野生型和突變體總RNA，并且用DNA酶去除基因組DNA污染。取2份RNA，一份用于測定在260 nm和 280 nm 處的吸光度，通過D260 nm/D280 nm的值得出總RNA的純度，此比值介于1.8～2.2之間為佳；另一份通過變性膠檢測RNA完整性，如果28S和18S清晰無拖尾，而且亮度比值約為 2 ∶[KG-*3]1，說明提取的總RNA無降解且完整性較高。取2 μg RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）合成cDNA。

1.2.5實時定量熒光PCR采用熒光染料SYBR Green I （TaKaRa） 進行分析。本研究所用引物見表1。定量PCR加樣量：2 × SYBR green Ⅰ Premix 10 μL，PrimerF （10 μmol/L） 0.4 μL，PrimerR （10 μmol/L）0.4 μL，cDNA模板（稀釋4倍）2.5 μL，去離子水補充至20 μL。PCR程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，45個循環(huán)；熔解曲線從 65 ℃ 到95 ℃，每0.5 ℃進行記錄；最后16 ℃。PCR結(jié)束后先分析熔解曲線，每對引物的溶解曲線一致，說明該PCR特異，數(shù)據(jù)可信。另外分析擴增曲線，我們用Actin2為內(nèi)參，以2-ΔΔCT相對定量的方法計算目的基因的相對表達量。cDNA模板的CT值基本保證在15～30之間，超出此范圍，數(shù)據(jù)不可信。根據(jù)經(jīng)驗，一般稀釋4倍。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖所得統(tǒng)計結(jié)果用Microsoft Excel軟件進行計量，用Sigmaplot 10.0軟件進行計算和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1KEA多突變體黃化苗出現(xiàn)去黃化現(xiàn)象

試驗發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下生長5 d，與野生型（WT）相比，KEA單突變體的下胚軸長度略長或者沒有差別（圖1-A）；而KEA多突變體，除了[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]外，[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]與單突變體或野生型相比，下胚軸長度較小，主根較長，特別是[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，其下胚軸長度比野生型減小了2/3（圖1-B、圖1-C）。另外還發(fā)現(xiàn)，除了[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]，大多數(shù)多突變體[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]子葉已經(jīng)完全展開，而野生型和單突變體子葉還處于彎鉤（hook）狀態(tài)（圖1-B）。

為了更進一步了解多突變體黃化苗發(fā)育狀況，連續(xù)測量黃化苗在生長3 d至8 d的生長情況。如圖2-A、圖2-B所示，從生長4 d開始，多突變體就開始表現(xiàn)為根伸長量增加而下胚軸伸長量減少。具體到生長8 d時，野生型和雙突變[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]表現(xiàn)為典型的黃化現(xiàn)象（etiolated），即較長的下胚軸，較短的主根；而多突變體則表現(xiàn)出明顯的去黃化現(xiàn)象（de-etiolated），除了主根和下胚軸外，子葉完全展開，真葉開始冒出，呈現(xiàn)出類似于光照下的表型（圖2-C）。

2.2kea突變體內(nèi)生長素合成基因表達下調(diào)

通過定量PCR，發(fā)現(xiàn)突變體內(nèi)生長素合成相關(guān)基因下調(diào)，如[WTBX][STBX]IAA1、IAA3、IAA17[WTBZ][STBZ]，而生長素運輸基因[WTBX][STBX]AUX1[WTBZ][STBZ]或PIN等表達沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化（圖3），因此推斷，突變體的去黃化表型可能是與生長素的合成有關(guān)，而與生長素運輸關(guān)系不大。

2.3生長素類似物NAA能夠恢復(fù)kea突變體去黃化現(xiàn)象

為了驗證kea突變體去黃化現(xiàn)象是否與生長素合成有關(guān)，向培養(yǎng)基添加一系列濃度 （0.01、0.1、1 μmol/L） 生長素類似物萘乙酸NAA，如圖4所示，黑暗條件下，低濃度NAA （0.01、0.1 μmol/L）對野生型和突變體[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]下胚軸生長沒有明顯的抑制作用，當(dāng)NAA濃度達到1 μmol/L時，其下胚軸生長明顯受到抑制，抑制率約為17%、21%。[JP2]而對于突變體[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，NAA對其下胚軸生長有明顯的促進作用，[JP]

[FK（W30][TPHL4.tif；S+1mm][FK）]

特別是對[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，1 μmol/L NAA使其下胚軸伸長增加約82%。同時發(fā)現(xiàn)，NAA（0.01、0.1 μmol/L）對野生型和突變體根系都有明顯抑制作用，尤其是當(dāng)濃度達到 1 μmol/L，所試株系的主根伸長均被抑制。

總之，NAA處理后，去黃化突變體[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]恢復(fù)或部分恢復(fù)黃化苗特征：較長的下胚軸，較短的主根，子葉保持彎鉤狀態(tài)或部分展開。

3討論

在正常生長條件下，不同于單突變，kea多突變體[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]呈現(xiàn)出明顯的發(fā)育表型：下胚軸較短，主根較長，彎鉤消失，子葉完全展開，真葉開始出現(xiàn)，這說明KEA基因在控制擬南芥生長發(fā)育的某些方面發(fā)揮重要作用。同樣作為雙突變體，[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]的表型明顯不同于[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]，這可能是由于[WTBX][STBX]KEA4[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]KEA5[WTBZ][STBZ]之間存在功能冗余。生長素在植物地上部和根系發(fā)育過程起著重要的調(diào)控作用，kea多突變體內(nèi)生長素合成基因表達變化，暗示KEA基因突變可能影響了擬南芥體內(nèi)的生長素相關(guān)路徑。外源添加一定濃度的生長素類似物NAA，kea多突變體下胚軸長度能夠恢復(fù)到野生型的水平。生長素也促進植物根系的伸長生長，但生長素促進根系生長的最適濃度比促進下胚軸生長的最適濃度要低，稍高濃度的生長素就會抑制根系的伸長生長。在本研究所使用的NAA濃度下，野生型和突變體主根均被抑制。此外，黑暗條件下萌發(fā)的幼苗，頂端彎鉤的作用在于，降低其地上部頂端分生組織在沖破泥土接收光照過程中所受的傷害[13]。如果在地上部沖破泥土前彎鉤過早打開，其子葉和分生組織會遭到破壞；此外，黑暗條件下，下胚軸快速生長能夠加速地上部沖破泥土的進程。以上結(jié)果顯示，KEA參與了擬南芥暗形態(tài)建成過程。[JP]

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