卿 朕，周秋艷，孫文斌，駱海玉，戴梅清，鄧業(yè)成

(廣西師范大學 生命科學學院/珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護省部共建教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004)

廣西地不容內(nèi)生真菌疣孢漆斑菌DBR-11的抑菌活性

卿 朕，周秋艷，孫文斌，駱海玉，戴梅清，鄧業(yè)成*

(廣西師范大學 生命科學學院/珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護省部共建教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004)

為了研究廣西地不容內(nèi)生真菌的抑菌活性，從廣西地不容塊根中分離純化出18株內(nèi)生真菌，采用拮抗試驗測定了其對10種植物病原真菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)疣孢漆斑菌DBR-11對多數(shù)供試菌有很好的抑制活性。進一步測定了DBR-11菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物對病原菌的抑制活性較高，質(zhì)量濃度為5 g/L時，對10種植物病原真菌的抑菌率均在90%以上，有效中濃度(EC50)為0.007 2～0.446 5 g/L，其中對煙草黑脛病菌的毒力最高,EC50值為0.007 2 g/L；發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物質(zhì)量濃度為2 g/L時，72 h對15種供試動物病原菌中的7種能完全抑制，最低抑制濃度(MIC)為0.062 5～0.25 g/L，其中對痢疾志賀氏菌的抑制活性最高,MIC值為0.062 5 g/L。DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物有廣譜的抗菌活性，具有潛在的應用價值。

廣西地不容； 內(nèi)生真菌； 疣孢漆斑菌； 抑菌活性； 發(fā)酵產(chǎn)物

廣西地不容(StephaniakwangsiensisLo.)為防己科千金藤屬植物，主產(chǎn)于廣西西北部至西南部，生于山地灌叢的石灰?guī)r地區(qū)[1]。目前多數(shù)文獻都是對廣西地不容生物堿的研究[2]，也有一部分研究它的其他藥理性質(zhì)，如抑菌活性[3]、殺蟲活性[4]等。近年來，由于藥用植物過度使用，使得許多藥用植物瀕臨滅絕。為了解決資源短缺問題，藥用植物內(nèi)生菌成為藥用植物新資源研究的一個熱點[5]。植物內(nèi)生菌(endophtic)是指生活在健康的植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細菌，是與宿主植物在長期的共同進化過程中衍生的一類微生物[6]。植物內(nèi)生真菌在植物微生態(tài)系統(tǒng)中長期與宿主建立了和諧的聯(lián)合關系，不但能夠產(chǎn)生與其宿主相同或者相似的活性物質(zhì)，而且其次生代謝產(chǎn)物十分豐富[7]，從而可以用于多種生理活性研究，如抗腫瘤、抗菌、殺蟲和免疫抑制等活性[6,8]。疣孢漆斑菌屬殼霉目杯霉科，對菌株疣孢漆斑菌的研究包括產(chǎn)酶[9-10]、殺蟲[11]等方面。目前，國內(nèi)外有關植物內(nèi)生真菌抑菌活性的研究雖然較多,但有關廣西地不容內(nèi)生真菌以及疣孢漆斑菌代謝物抑菌活性的研究尚未見報道。本研究對廣西地不容塊根中內(nèi)生真菌進行分離、活性篩選和鑒定,并對疣孢漆斑菌DBR-11進行發(fā)酵培養(yǎng),對其發(fā)酵產(chǎn)物各萃取相進行抑菌活性測定，以期為DBR-11 菌株的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物內(nèi)生真菌 供試的18個植物內(nèi)生真菌菌株從采自廣西植物研究所的廣西地不容塊根中分離獲得[12-14]，采用形態(tài)學和分子生物學(ITS序列分析)技術相結(jié)合的方法鑒定DBR-11菌株為疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)。

1.1.2 供試植物病原真菌 包括玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasitica)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、甘藍黑斑病菌(Alternariaoleracea)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、甘蔗鳳梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、茶輪斑病菌(Pestalotiopsistheae)、貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri)、水稻胡麻葉斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)10種，除金橘砂皮病菌和貢柑鏈格孢菌由廣西特色作物研究所提供以外，其余8種均由廣西大學農(nóng)學院植物病理室提供。

1.1.3 供試動物病原菌 包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、普通變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、乙型副傷寒桿菌(BacteriumparatyphosumB)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)15種，由桂林醫(yī)學院微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵 挑取保存的純化菌種接種于PDA平板上，待活化后，用0.4 cm打孔器在菌落平板上打取菌餅，用鑷子挑取1個菌餅，接種于裝有400 mL滅菌液體PDA的1 000 mL錐形瓶中，置于恒溫培養(yǎng)箱中(27±1)℃培養(yǎng)，每天搖晃2～3次，培養(yǎng)30 d。

1.2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的制備及初步分離 將內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物用無水乙醇按1∶1比例浸泡3 d[13]，再用2層紗布過濾，過濾得到的發(fā)酵產(chǎn)物進一步抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得發(fā)酵濃縮液。用液-液萃取法分離內(nèi)生真菌粗提物，把發(fā)酵濃縮液置于分液漏斗中，依次用等量的乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取3～5次，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及萃余物。

1.2.3 抑菌活性測定

1.2.3.1 植物內(nèi)生真菌對植物病原真菌的拮抗試驗 采用平板對峙法[15-16]，預先在培養(yǎng)皿底面用記號筆做記號，記號點以培養(yǎng)皿中心軸對稱，兩點間距3 cm。將直徑為0.4 cm的打孔器滅菌后，在培養(yǎng)5 d的內(nèi)生真菌和病原菌的菌落邊緣打出菌餅，然后在無菌條件下取菌餅接種在平板培養(yǎng)基的標記點上，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d后觀察。依據(jù)對峙菌落之間有無抑菌帶來確定它們之間是否有拮抗作用。用尺子量取其抑菌帶寬度(單位為mm)，每個皿測量3個點，取其平均值作為評判抑菌效果大小的依據(jù)。每組處理3個重復，取其平均值記錄。

1.2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物對植物病原真菌菌絲生長的抑制活性測定 采用菌絲生長速率法[17]測定。首先把樣品配成質(zhì)量濃度為50 g/L的藥液，溶劑為丙酮或者丙酮和水(1∶1)。在無菌潔凈工作臺中，把1 mL藥液(對照組用溶樣溶劑代替)與9 mL熱熔培養(yǎng)基混合均勻，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中制成厚薄均勻的帶藥培養(yǎng)基(5 g/L)。在已活化的供試菌落邊緣，用直徑為0.4 cm的無菌打孔器切取菌餅，并使菌絲面朝下接于帶藥培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿接3個菌餅成“品”字形分布，每個處理設3個重復。置于(27±1)℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用十字交叉法測量菌落直徑，根據(jù)下列公式計算抑制率：

抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.4)×100%。

測定有效中濃度(EC50)時，配制7個系列質(zhì)量濃度(2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/L)的帶藥培養(yǎng)基，測定各個質(zhì)量濃度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回歸方程、相關系數(shù)(r)、EC50及EC50的95%置信限和相對毒力。

1.2.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物對動物病原菌的抑制活性測定 采用帶毒平板法[18]。將菌種接到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，置于(37±1)℃的水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)12～14 h進行活化。把樣品配成質(zhì)量濃度為20 g/L的藥液，溶劑為丙酮或丙酮和水(1∶1)。在無菌潔凈工作臺中，將1 mL藥液與9 mL熱熔牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，制成厚薄均勻的帶藥培養(yǎng)基。將已活化的菌種搖勻，吸取0.1 mL于9.9 mL無菌水中稀釋成菌懸液。吸取0.1 mL菌懸液，加到帶藥培養(yǎng)基上，涂布均勻。每個處理設3個重復。陽性對照組用溶樣溶劑代替藥液，其他條件不變，用于觀察細菌能否正常生長。陰性對照則涂0.1 mL無菌水，其他條件不變，用于觀察培養(yǎng)基、藥液或無菌水是否污染。(37±1)℃條件下培養(yǎng)72 h后觀察并記錄結(jié)果。

測定樣品對病原菌24 h的最低抑制濃度(MIC)時，采用常量肉湯稀釋法。將已活化的菌種搖勻，吸取0.1 mL于9.9 mL液體培養(yǎng)基中稀釋成菌懸液。再將樣品配成系列質(zhì)量濃度的藥液，取0.1 mL與0.9 mL菌懸液混合于10 mL的無菌試管中，制成系列質(zhì)量濃度(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/L)的含菌帶毒培養(yǎng)液。每個處理設3個重復。陽性對照組用溶樣溶劑代替藥液，其他條件不變，用于觀察細菌能否正常生長。陰性對照則為液體培養(yǎng)基，其他條件不變，用于觀察培養(yǎng)基是否污染。(37±1)℃條件下培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄結(jié)果，以不長菌的最低濃度作為樣品對動物病原菌的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 18株廣西地不容內(nèi)生真菌對植物病原真菌的抑制活性

試驗結(jié)果顯示(表1)，18株廣西地不容內(nèi)生真菌對植物病原真菌的抑制效果不盡相同，DBR-11對玉米小斑病菌、金橘砂皮病菌、辣椒炭疽病菌有極強的抑制效果，對玉米大斑病菌、水稻胡麻葉斑病菌、甘蔗鳳梨病菌和茶輪斑病菌有強的抑制效果。DBR-5、DRB-6、DRB-14和DRB-18只對10種植物病原真菌中的1種抑制效果強。而DBR-3、DRB-7、 DRB-8、 DRB-10、DRB-12、DRB-15和DRB-23對10種病原真菌都沒有抑制效果。其余的內(nèi)生菌僅對少數(shù)病原真菌有較強抑制效果或者有抑制效果。

注：根據(jù)抑菌帶寬度(T)評判抑菌活性，并分為5個級別：“—”代表無抑菌活性，菌絲交叉，T=0；“+”表示有抑菌活性，0 mm

2.2 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對10種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

采用菌絲生長速率法測定DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物在質(zhì)量濃度為5 g/L 時對10種植物病原真菌菌絲生長的72 h抑制活性，結(jié)果見表2。由表2可知，乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最好，對10種植物病原真菌的抑制率均達到90%以上，對其中8種病原真菌的抑制率達到100%。正丁醇萃取物也有較好的抑菌活性，對3種植物病原真菌的抑制率達到80%以上，對其余病原真菌的抑制率為40.40%～65.74%。萃余物基本沒有抑菌活性。由此可知，活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯萃取物中。

表2 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對10種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

注：同列數(shù)據(jù)后字母相同者表示在5%水平上差異不顯著(DMRT法)。

2.3 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌菌絲的毒力

為進一步明確 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物的抑菌效果，測定了乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌菌絲的毒力，結(jié)果見表3。由表3可知，DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對煙草黑脛病菌的毒力最高，EC50為0.007 2 g/L，對甘藍黑斑病菌的毒力最低，EC50為 0.446 5 g/L，最大毒力是最小毒力的62.01倍，對其余8種植物病原真菌的EC50值為0.038 2～0.228 5 g/L。

表3 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對10種植物病原真菌菌絲的毒力

注：具有最大EC50值樣品的相對毒力為1.00，其他各樣品的相對毒力用最大EC50值除以該樣品的EC50值而得。

2.4 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對15種動物病原菌的抑制活性

用帶毒平板法測定DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對15種動物病原菌的72 h抑制活性，結(jié)果見表4。由表4可知，當萃取物質(zhì)量濃度為2 g/L時，DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對7種供試動物病原菌有抑制活性，并且對革蘭氏陽性菌的抑制活性較革蘭氏陰性菌好。DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物正丁醇萃取物和萃余物對15種供試動物病原菌均無抑制活性。以上結(jié)果表明，DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物對動物病原菌的抑菌物質(zhì)也主要存在于乙酸乙酯萃取物中。

2.5 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對7種動物病原菌的最低抑制濃度

根據(jù)表4的結(jié)果，將 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物配成系列質(zhì)量濃度梯度，并制成含菌帶毒培養(yǎng)液，測定其對7種動物病原菌的24 h最低抑制濃度，結(jié)果見表5。由表5可知，DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對痢疾志賀氏菌的抑制活性最高，MIC值為0.062 5 g/L，對其余6種動物病原菌的MIC值為0.125～0.25 g/L。

表4 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對15種供試動物病原菌的抑制活性

注：“+”表示有菌生長，“—”表示無菌生長，下同。

表5 DBR-11 乙酸乙酯萃取物對7種供試動物病原菌的最低抑制濃度

3 結(jié)論與討論

在拮抗試驗中疣孢漆斑菌DBR-11對多數(shù)供試植物病原真菌有很好的抑制活性。該試驗采取了平板對峙法，初步、定性判斷菌株是否對供試菌有抑菌活性，可減少不必要的工作量，節(jié)約試驗時間。拮抗試驗中沒有抑制效果的菌株并非說明其不能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，可能是5 d的時間太短而不能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)或者所使用的平板對峙法阻礙了抑菌物質(zhì)的擴散，所以還可以用內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對病原菌進行生長抑制試驗，進一步確認和篩選抑菌優(yōu)良菌株。

有研究結(jié)果[13,19-20]顯示，內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物有廣泛的抑菌活性，本試驗也表明，疣孢漆斑菌DBR-11乙酸乙酯萃取物有較強的抑菌活性，在5 g/L的質(zhì)量濃度下，其對10種植物病原菌的72 h抑制率均在90%以上，對煙草黑脛病菌的毒力最高，EC50為0.007 2 g/L；在2 g/L的質(zhì)量濃度下，其對15種動物病原菌中的7種具有72 h的完全抑制能力，對痢疾志賀氏菌抑制效果最好，24 h最低抑制濃度為0.062 5 g/L。DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物有廣譜的抗菌活性，具有潛在的應用價值，可以進一步研究其中活性物質(zhì)的組分和單體結(jié)構(gòu)，探究其與廣西地不容抗菌成分的關系。

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Antimicrobial Activity of Endophytic FungusMyrotheciumverrucariaDBR-11 fromStephaniakwangsiensis

QING Zhen,ZHOU Qiuyan,SUN Wenbin,LUO Haiyu,DAI Meiqing，DENG Yecheng*

(College of Life Science,Guangxi Normal University/Key Laboratory of Ecology and Environmental Protection of Rare and Endangered Species，Ministry of Education of China,Guilin 541004,China)

To study the antimicrobial activity of endophytic fungi fromStephaniakwangsiensis,eighteen strains of endophytic fungi were isolated from the earthnuts ofStephaniakwangsiensis.Antagonism test was used for determining the inhibitory activity of the endophytic fungi against 10 plant pathogenic fungi.The results showed thatMyrotheciumverrucariaDBR-11 had good inhibitory activities against most tested pathogens.By further determining the antimicrobial activity of DBR-11 fermentation product,it found that ethyl acetate extract from its fermentation product had high inhibitory activity against the tested pathogentic microbes.The inhibition rates against 10 kinds of plant pathogenic fungi were more than 90% when the concentration of ethyl acetate extract of fermentation product was 5 g/L,with EC50value from 0.007 2 to 0.446 5 g/L,and it had highest virulence againstPhytophthoraparasiticawith the EC50value of 0.007 2 g/L.While there was a utterly inhibitory activity against seven species among fifteen animal pathogenic bacteria when the concentration of ethyl acetate extract of fermentation product was 2 g/L after 72 h observation,with the MIC values of 0.062 5—0.25 g/L,and it showed the best inhibitory activity againstShigelladysenteriaewith the MIC value of 0.062 5 g/L.The ethyl acetate extract of DBR-11 fermentation product has a broad spectrum of antimicrobial activity,with potential applications.

Stephaniakwangsiensis； endophytic fungi；Myrotheciumverrucaria； antimicrobial activity; fermentation product

2015-10-28

廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019058)；廣西高校科研資助項目(2013YB037)

卿 朕(1988-)，男，廣西桂林人，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物。E-mail：491520293@qq.com

*通訊作者：鄧業(yè)成(1965-)，男，廣西全州人，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及植物保護等研究工作。 E-mail:dyecheng@163.com

S476;S482.2+92

A

1004-3268(2016)05-0077-06