李京，張祥林，羅明，李亞偉，王翀中， 張小菊

(1新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，烏魯木齊　830052；2新疆出入境檢驗檢疫局，烏魯木齊　830063)

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實時熒光PCR法快速檢測地中海實蠅的研究

李京1,2，張祥林2，羅明1，李亞偉2，王翀中2， 張小菊2

(1新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，烏魯木齊830052；2新疆出入境檢驗檢疫局，烏魯木齊830063)

摘要：【目的】設計用于擴增地中海實蠅的特異性引物，建立快速、靈敏檢測地中海實蠅的實時熒光PCR方法。【方法】采用實蠅科昆蟲線粒體DNA COI基因的通用引物擴增地中海實蠅以及其它三種供試實蠅的DNA片段，經(jīng)測序、比對分析，設計出擴增地中海實蠅的特異性引物，用SYBR Green 實時熒光PCR方法驗證該引物的特異性與靈敏度。【結果】設計的引物對DZH-F/DZH-R能特異性檢測出地中海實蠅，擴增產(chǎn)物的溶解曲線峰值Tm為79.2。該對引物檢測地中海實蠅的靈敏度為10-3ng/μL。【結論】所建立的SYBR Green 實時熒光PCR方法檢測地中海實蠅特異性強、靈敏度高。

關鍵詞：地中海實蠅；COI基因；實時熒光PCR；快速檢測

0引 言

【研究意義】實蠅科(Tephritidae)是雙翅目(Diptera)昆蟲中的重要類群，全球有40余種實蠅是為害農(nóng)作物的檢疫性害蟲，其中果實蠅屬(Ceratitis)是最具經(jīng)濟重要性的實蠅類群[1]。許多實蠅種類對多種果實造成巨大危害，如橘小實蠅 (B.dorsalis)能夠危害芒果、番石榴、楊桃等250余種水果，果實受蟲害后，可造成落果或果實失去經(jīng)濟價值；瓜實蠅(B.cucurbitae)對果蔬的危害范圍也達到80余種，并且主要對葫蘆科植物危害較嚴重；棗實蠅(C.vesuviana)雖然寄主較為單一，但其對棗果危害十分嚴重，該蟲2007年在我國新疆地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，對當?shù)貤棶a(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。地中海實蠅(C.capitata)是世界性果蔬害蟲，在全世界 80 多個國家和地區(qū)有分布，由于地中海實蠅經(jīng)濟意義十分巨大，被各國公認為“果蔬頭號殺手”[2-5]。1929年，美國佛羅里達州首次發(fā)現(xiàn)了地中海實蠅，此次造成了700多萬美元的經(jīng)濟損失，此后在該州陸續(xù)發(fā)生了多次，所造成的經(jīng)濟損失難以估計[6]。近年來，新疆檢驗檢疫局在新疆多個地區(qū)分別監(jiān)測到棗實蠅、瓜實蠅和橘小實蠅，但尚未發(fā)現(xiàn)地中海實蠅傳入我區(qū)。隨著絲綢之路經(jīng)濟帶核心區(qū)的建設與發(fā)展，新疆同周邊國家的農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易量逐年增加，地中海實蠅的傳入風險也相對增加，同時由于地中海實蠅具有寄主多且繁殖能力超強的特點，其在新疆的傳播概率也因此相對增大。新疆是我國的水果、蔬菜種植大省，一旦地中海實蠅傳入造成的經(jīng)濟損失將難以估計。因此研究建立能夠快速檢測出地中海實蠅的分子生物學方法意義重大?！厩叭诉M展】吳佳教等[7](2005)從實蠅線粒體DNA(mtDNA)COII基因序列中篩選出特異性引物，并用PCR-RFLP法和限制性內(nèi)切酶MSEI、DRAI成功將9種檢疫性實蠅區(qū)分開[6]；朱振華等[8](2005)研究表明mtDNA Cytb基因也可以作為鑒別實蠅的方法[7]；余道堅[9](2005)應用SS-PCR、TaqMan MGB探針實時熒光PCR等方法將10種檢疫性實蠅(地中海實蠅、桔小實蠅、瓜實蠅、南瓜實蠅、番石榴實蠅、木瓜實蠅、菲律賓實蠅、芒果實蠅、楊桃實蠅、辣椒實蠅)區(qū)分開；程曉甜等[10](2013)對于線粒體DNA(mtDNA)COI基因，采用SS-PCR、SYBR Green實時熒光PCR等方法從設計的一對引物中篩選出檢測棗實蠅的特異性引物，成功將棗實蠅與其他5種實蠅區(qū)分開(桔小實蠅、瓜實蠅、南瓜實蠅、番石榴實蠅、桃果實蠅)[10]；姜帆等[11](2015)用SS-PCR、TaqMan MGB探針實時熒光PCR方法對27種檢疫性實蠅線粒體DNA(mtDNA)COI基因的比對設計出了27對特異性引物并篩選出TaqMan MGB探針，成功將27種實蠅一一區(qū)分開?！颈狙芯壳腥朦c】由于mtDNA被看作檢測物種進化的較為重要的分子標記方法[12-13]，因此研究以四種實蠅的DNA為模板、運用COI引物擴增出目的片段，經(jīng)測序后運用生物信息學分析四種實蠅COI序列，設計出一對特異性引物，用SYBR Green實時熒光PCR方法特異性檢測地中海實蠅?！緮M解決的關鍵問題】指導口岸檢驗檢疫局從口岸疫情截獲或在出口注冊果園監(jiān)測點，誘捕到的實蠅樣品中快速檢測，并確定有無地中海實蠅。

1材料與方法

1.1 材 料

地中海實蠅成蟲樣品由廣東出入境檢驗檢疫局和中國檢驗檢疫科學研究院提供，橘小實蠅、瓜實蠅和棗實蠅的成蟲樣品來源于新疆出入境檢驗檢疫局近幾年在當?shù)卣T捕到的樣品。供試實蠅標本均用100%酒精浸泡。表1

1.2方 法

1.2.1基因組DNA提取

無菌操作條件下，用磁珠法基因組提取試劑盒(天根DP329)提取供試實蠅樣品DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　供試實蠅及來源

1.2.2目的片段DNA擴增

用mtDNA COI基因通用引物COI-F/ COI-R擴增4種供試實蠅，該引物序列為：COI-F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，COI-R：5'-TAAACT TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ 。PCR反應體系：DNA模板1 μL，2×Mix預混液12.5 μL，上游引物COI-F 0.5 μL，下游引物COI-R 0.5 μL，加水至25 μL。PCR反應程序：94℃/3 min；94℃/30s，53℃/30s，72℃/1 min，共36 個循環(huán)；最后 72℃延伸 7 min。取 PCR 產(chǎn)物 5 μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳 30 min(90V)，置于凝膠成像分析系統(tǒng)進行觀察照相，取20 μL PCR產(chǎn)物送生物技術公司測序。

1.2.3設計特異性引物

用DNAMAN8.0及GENEDOC法將該實驗測序得到的地中海實蠅的mtDNA COI基因序列(已在Genbank獲得序列號：KU096056)為靶序列，與本實驗測序得到的桔小實蠅(已獲得Genbank序列號：KU131575)、瓜實蠅(已獲得Genbank 序列號：KU096057)和棗實蠅(已獲得Genbank 序列號：KU131576)，以及在Genbank中下載的南瓜實蠅Bactroceratau(序列號：AY398753)、油欖實蠅Bactroceraoleae(序列號：AY210702)、辣椒實蠅Bactroceralatifrons(序列號：AF423103)等COI基因序列進行比對分析。根據(jù)分析結果，采用Primer Permier 5.0軟件設計檢測地中海實蠅的特異性引物對DZH-F/DZH-R，送至生物技術公司合成。

1.2.4SYBR Green 實時熒光PCR檢測

1.2.4.1DZH-F/DZH-R引物的特異性驗證

用實時熒光PCR儀(ABI QuantStudioTM7 Flex Real-Time PCR system)進行SYBR Green PCR擴增。反應條件：SYBRPremixExTaqTM(2×)10 μL，上下游引物(10 μM)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，dH2O補至20 μL。反應程序：第一步：95℃/30s；第二步(擴增曲線)：95℃/5s，60℃/30s,共40個循環(huán)；第三步(溶解曲線)：95℃/15s，60℃/1 min，95℃/15s。用桔小實蠅、瓜實蠅、棗實蠅來驗證引物DZH-F/DZH-R的特異性。

1.2.4.2引物DZH-F/DZH-R的靈敏度檢測

將模板的DNA進行倍比稀釋，共設置7個濃度梯度，分別為：20、10、1、10-1、10-2、10-3和、10-4ng/μL，用以檢測該引物的靈敏度，PCR反應條件及反應程序同上。

2結果與分析

2.1通用引物COI-F/ COI-R擴增結果

用通用引物COI-F/ COI-R擴增供試地中海實蠅、桔小實蠅、瓜實蠅和棗實蠅，擴增產(chǎn)物電泳結果表明：4種實蠅均有泳帶，大小均為670 bp。圖1

2.2引物DZH-F/DZH-R特異性驗證結果

用所設計的特異性引物DZH-F/DZH-R對4種供試實蠅進行SYBR Green 實時熒光PCR擴增，結果表明，僅地中海實蠅有擴增曲線，其Ct值為15.2，其它3種實蠅未出現(xiàn)擴增曲線。圖2

實時熒光PCR擴增產(chǎn)物的溶解曲線結果顯示，4種供試實蠅中僅地中海實蠅有產(chǎn)物峰出現(xiàn)，其Tm=79.2。圖3

M:DL2000 Marker；1～2：地中海實蠅；3：桔小實蠅；4：瓜實蠅；5：棗實蠅；6：空白

2.3引物DZH-F/DZH-R靈敏度檢測結果

將提取的地中海實蠅DNA倍比稀釋成7個濃度梯度：20、10、1、10-1、10-2、10-3和L、10-4ng/μL，進行SYBR Green 實時熒光PCR擴增。結果顯示，當?shù)刂泻嵪塂NA濃度為10-3ng/μL 時，該引物仍能檢測到(Ct>35時，其擴增視為陰性)，不同濃度的DNA平均Ct值分別是：18.8(20 ng/μL)、22.7(10 ng/μL)、26.2(1 ng/μL)、29.4(10-1ng/μL)、32.6(10-2ng/μL)、35.0(10-3ng/μL)、38.2(10-4ng/μL)。圖4

此外，不同濃度的DNA所擴增產(chǎn)物的溶解曲線峰值相同(Tm=79.2)。圖5

1～2: 地中海實蠅的擴增曲線；3～5: 其它實蠅的擴增曲線

1: 地中海實蠅的PCR產(chǎn)物溶解曲線；2～4: 其它實蠅的PCR產(chǎn)物溶解曲線

A-G：不同濃度的地中海實蠅DNA實時熒光PCR擴增曲線，A:20 ng/μL; B:10 ng/μL; C:1 ng/μL; D:10-1 ng/μL;

A-C：不同濃度的地中海實蠅模板DNA SYBR Green 實時熒光PCR產(chǎn)物溶解曲線；D：空白對照

3討 論

由于新疆截獲橘小實蠅、瓜實蠅、棗實蠅的頻率較高，因此研究用該三種實蠅檢測設計的地中海實蠅的引物的特異性。盡管余道堅[9]2005年建立了地中海實蠅快速鑒定方法，但該方法設計的引物并不能證明擴增不出幾種常見的檢疫性實蠅，如：橘小實蠅、瓜實蠅、棗實蠅。針對四種常見的檢疫性實蠅(地中海實蠅、橘小實蠅、瓜實蠅、棗實蠅)設計出特異性檢測地中海實蠅的引物。同時，相對于2015年姜帆等[11]建立的用SS-PCR、TaqMan MGB探針實時熒光PCR方法檢測27種檢疫性實蠅線粒體DNA(mtDNA)COI基因的方法，此項研究依然具有一些優(yōu)勢：對于建立的SS-PCR技術，該技術的靈敏度更高，更具有可信度；相對于建立的TaqMan MGB探針技術該項技術更為經(jīng)濟，更為適用于大量的實蠅檢測。但相對于前兩項的研究，設置的對照組較少。

用SYBR Green 實時熒光PCR方法驗證引物特異性時，雖然PCR產(chǎn)物的溶解曲線除地中海實蠅外其他兩種實蠅出現(xiàn)了微弱的峰，但SYBR Green 實時熒光PCR擴增僅地中海實蠅有擴增曲線出現(xiàn)，因此認為該引物能特異性鑒定地中海實蠅。在驗證引物的靈敏度實驗中，當?shù)刂泻嵪墲舛葹?0-4ng/μL時，其擴增曲線的Ct值為38.2，有相關文獻表示當擴增曲線的Ct值大于35時可認為該樣品或該濃度不被擴增[14]，因此認為引物DZH-F/DZH-R擴增為陰性即檢測不到10-4ng/μL濃度的地中海實蠅。

4結 論

研究比對、分析地中海實蠅、橘小實蠅、瓜實蠅、棗實蠅四種常見的檢疫性實蠅的線粒體COI基因序列，建立了一種特異性鑒定地中海實蠅的SYBR Green 實時熒光PCR方法，成功將地中海實蠅與其他三種實蠅區(qū)分開，該方法為后人的相關研究提供了可靠的依據(jù)與參考。

近年來，新疆地區(qū)已經(jīng)有橘小實蠅實蠅、瓜實蠅、棗實蠅的相關報道，但地中海實蠅還未發(fā)現(xiàn)。但隨著新疆與周邊的中亞地區(qū)的國家貿(mào)易的頻繁，比如，從哈薩克斯坦進口芒果，在當?shù)孛⒐幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了地中海實蠅，建立地中海實蠅快速檢測方法，為口岸檢疫性害蟲的監(jiān)測與預防提供了技術支持。

參考文獻(References)

[1] White, I. M., & Elson-Harris, M. M. (1992). Fruit flies of economic significance: their identification and bionomics.FruitFliesofEconomicSignificanceTheirIdentification&Bionomics, 22(6):1,408-1,408(1).

[2] Hardy, D. E. (1973). The fruit flies (tephritidae-diptera) of thailand and bordering countries.PacificInsectsMonograph. (31):1-353.

[3] Hardy, D. E. (1974). The fruit flies of the Philippines (Diptera - Tephritidae). Entomology Dept., Bernice P.BishopMuseum.,(32):1-266.

[4] Drew, R., A. I., Hancock, & D., L. (1994). The bactrocera dorsalis complex of fruit flies (diptera: tephritidae: dacinae) in asia.BulletinofEntomologicalResearchSupplement, 2(2):1-68.

[5] Drew, R. A. I. (1989). The tropical fruit flies (diptera: tephritidae: dacinae) of the australasian and oceanian regions.MemoirsoftheQueenslandMuseum.

[6] 周永淑.美國佛羅里達州發(fā)生地中海實[J] .植物檢疫,1997,(S1):45,50.

Zhou Y S. (1997). The occurrence of the Mediterranean fruit fly in Florida in the United States[J] .PlantQuarantine,(S1):45,50.(in Chinese)

[7] Vigilant, L.,Stoneking, M.,Harpending, H.,Hawkes, K.,& Wilson, A. C. (2004). African populations and the evolution of human mitochondrial dna..Evolution;internationaljournaloforganicevolution,58(9):1,891-1,900.

[8] 施偉,葉輝.云南桔小實蠅五個地理種群的遺傳分化研究[J].昆蟲學報,2004,47(3):384-388.

SHI Wei, YE Hui. (2004).Genetic differentiation in five geographic populations of the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera:Tephritidae) in Yunnan Province [J].ActaEntomol.Sinica, 47(3):384-388.(in Chinese)

[9] 余道堅.檢疫性實蠅分子生物學快速鑒定技術的研究[D].上海：中國科學院研究生院(上海生命科學研究院)博士論文,2005.

YU Dao-jian. (2005).Studyonrapididentificationofquarantinefruitflybasedonmoleculartechniques[D]. PhD Dissertation. Chinese Academy of Sciences, Shanghai. (in Chinese)

[10] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉,等.棗實蠅特異引物PCR鑒定技術[J].林業(yè)科學，2013,(11):98-102.

CHENG Xiao-tian, Adili Shataer, ZHANG Wei, et al.(2013). Species-specific PCR Primers for identification of Carpomyia vesuviana [J].ForestScience, (11):98-102.(in Chinese)

[11] 姜帆.我國檢疫性實蠅分子鑒定技術體系的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學博士論文,2015.

JIANG Fan.(2015).TechniqueSystemforMolecularIdentificationofQuarantineFruitFliesinChina[D]. PhD Dissertation. China Agricultural University，Beijing.(in Chinese)

[12] 吳佳教,胡學難,趙菊鵬,等.9 種檢疫性實蠅 PCR-RFLP 快速鑒定研究[J].植物檢疫,2005,19(1):2-6．

WU Jia-jiao, HU Xue-nang, ZHAO Ju-peng, et al.(2005).Rapid identification among 9 species of quarantine fruit flies[J].PlantQuarantine, 19(1):2-6. (in Chinese)

[13] 朱振華,葉輝,張智英.基于mtDNA Cytb的六種果實蠅的分子鑒定(雙翅目:實蠅科)[J].昆蟲學報,2005,(3):386-390.

ZHU Zhen-hua, YE Hui, ZHANG Zhi-ying. (2005). Molecular identification of six Bactrocera Species (Diptera: Tephritidae) based on mtDNA [J].EntomologicaSinica, (3):386-390. (in Chinese)

[14] Montes-Borrego, M., Mu?oz-Ledesma, F. J., I+D+I, A., Carmona, C., Viso, E., & Alcor, D., et al. (2011). Real-time PCR quantification of peronospora arborescens, the opium poppy downy mildew pathogen, in seed stocks and symptomless infected plants.PlantDisease, 95(2):143-152.

Fund project:Supported by Public welfare industry scientific research project of General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (201310091); Xinjiang Agriculture University research joint graduate training program (xjaucxy-yjs-20131023)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.018

收稿日期(Received)：2016-01-14

基金項目:國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研項目(201310091)；新疆農(nóng)業(yè)大學產(chǎn)學研聯(lián)合培養(yǎng)研究生項目(xjaucxy-yjs-20131023)

作者簡介:李京(1990-)，女，山東人，碩士研究生，研究方向為植物檢疫病害，(E-mail)13579981032@163.com 通訊作者(Cotresponding author):張祥林(1964-)，男，新疆人，研究員，研究方向為分子植物病理學，(E-mail)XL6479@163.com

中圖分類號：S412

文獻標識碼：A

文章編號：1001-4330(2016)06-1107-07

Study on Rapid Detection Method of Mediterranean Fruit Fly by Real-Time PCR Assay

LI Jing1,2，ZHANG Xiang-lin2，LUO Ming1，WANG Chong2，LI Ya-wei2，ZHANG Xiao-ju2

(1.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China2.XinjiangEntryandExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi830063,China)

Abstract：【Objective】 Fruit flies (Tephritidae) described all over the world are more than 450 insect species and 4，300 kinds, there were more than 70 kinds including the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitate) in Xinjiang, which endanger agriculture greatly. It is of significance in plant quarantine to set up quarantine fruit fly, especially immature worm state fast and reliable identification method.【Method】Using the fruit flies general primer amplification of mitochondrial DNA COI gene to amplify targeted fragments, sequence, blast, then design specific primers which verified its specificity and sensitivity using SYBR Green real-time PCR.【Result】The primers DZH-F/DZH-R could specific amplify ceratitis capitate. The production peaks was 79.2. This primer could detect 10-3ng/μL of ceratitis capitate template DNA.【Conclusion】A assay of SYBR green real-time PCR has been established to detect the Mediterranean fruit fly, which has strong specificity and high sensitivity.

Key words:Mediterranean fruit fly; mtDNA; SYBR Green real-time PCR; rapid detection