曹建美

(中國科學院上海辰山植物研究中心，上海辰山植物園，上海松江 201602)

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雙分子熒光互補技術(BiFC)分析玉米MAPK5與bZIP72蛋白的相互作用

曹建美

(中國科學院上海辰山植物研究中心，上海辰山植物園，上海松江 201602)

摘要[目的]分析玉米MAPK5與bZIP72蛋白之間的相互作用。[方法]構建雙分子熒光互補表達載體pN-MAPK5和pC-bZIP72，應用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞瞬時表達，在激光共聚焦顯微鏡下觀察MAPK5與bZIP72蛋白相互作用產生的熒光信號。[結果]ZmMAPK5與ZmbZIP72的BiFC融合載體同時轟擊洋蔥表皮細胞，細胞核中能發(fā)出黃色熒光。[結論] ZmMAPK5與ZmbZIP72在植物細胞核內相互作用。

關鍵詞ZmMAPK5；ZmbZIP72；雙分子熒光互補(BiFC)；蛋白互作

植物作為固著生物，在長期的進化過程中發(fā)展出復雜的信號響應系統(tǒng)來增強自身對各種不利環(huán)境條件的抵抗。其中，最保守的信號系統(tǒng)即為MAPK 信號級聯(lián)系統(tǒng)，它通過一系列的磷酸化作用將胞外刺激信號轉導到胞內，保護細胞免受脅迫傷害。典型的MAPK信號轉導系統(tǒng)為三級磷酸化傳遞系統(tǒng)[1]。MAPKKK接受生物的或非生物的刺激，通過2次磷酸化過程將刺激信號逐級放大傳遞給MAPK，MAPK接收到信號后可能有3種反應[2]：繼續(xù)停留在細胞質中激活其他蛋白激酶；進入細胞核，與轉錄因子相互作用，調控轉錄因子活性；在細胞質中使細胞骨架磷酸化。

轉錄因子(Transcription factors, TFs)也稱反式作用因子，能夠與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，并對轉錄有激活或抑制作用。植物轉錄因子基因家族中研究最多的一類是堿性亮氨酸拉鏈(basic region/leucine zipper motif, bZIP)類轉錄因子。植物bZIP轉錄因子含有60～80個氨基酸殘基，由一個二聚化作用的亮氨酸拉鏈區(qū)域和一個DNA結合的堿性結構域組成。研究表明，植物bZIP轉錄因子在細胞中主要定位于細胞核。bZIP轉錄因子家族成員在植物中有的呈組成型表達，有的呈器官特異性表達，有的呈發(fā)育相關性表達，有的受各種非生物脅迫，包括鹽害、冷害、干旱等誘導表達。除轉錄水平上受誘導表達調控活性外，植物bZIP轉錄因子在轉錄后水平上也被調控，包括磷酸化調控、二聚化調控和蛋白蛋白相互作用等[3]。這些調控方式可以改變轉錄因子對順式元件結合的親和力，從而增強或減弱轉錄因子的轉錄調控活性。

玉米(Zeamays)是重要的糧食作物和工業(yè)生產原料，環(huán)境非生物脅迫因子如干旱、高鹽等嚴重影響玉米的生長發(fā)育。因此，研究其逆境響應機制，對提高玉米產量和質量具有重要意義。目前，玉米中關于MAPK蛋白激酶與bZIP轉錄因子之間相互作用的研究鮮見報道。筆者根據玉米MAPK5和bZIP72基因序列設計特異性引物，從玉米葉片cDNA中擴增ZmMAPK5和ZmbZIP72的CDS片段，分別構建ZmMAPK5與ZmbZIP72的BiFC融合載體，基因槍轟擊洋蔥表皮細胞瞬時表達分析ZmMAPK5與ZmbZIP72的蛋白相互作用。

1材料與方法

1.1植物材料以玉米(ZeamaysL.)雜交種農大108為試驗材料。選取飽滿一致的玉米種子，浸泡過夜，25 ℃催芽48 h，挑選發(fā)芽一致的種粒播種于石英砂中，置于光照培養(yǎng)箱(28 ℃、RH 90%、光照16 h/d)中生長。待幼苗第2葉完全展開，取葉片液氮速凍備用。新鮮的洋蔥，撕表皮待用。

1.2菌株、載體和酶類E.coli菌株(DH5α)、BiFC載體(pUC19-N，pUC19-C)由中國科學院辰山植物研究中心保存；pMD19-T載體、限制性內切酶、T4連接酶、Trizol等購自寶生物大連有限公司(TaKaRa);KOD購自TOYOBO公司；DNA質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程公司；引物合成和測序由上海生工生物工程公司完成。

1.3方法

1.3.1玉米MAPK5和bZIP72基因克隆。采用Trizol方法提取玉米葉片總RNA，反轉錄成cDNA為模板，根據ZmMAPK5和ZmbZIP72基因序列通過Primer 5.0設計相應的引物進行PCR擴增。ZmMAPK5上游引物F1：5′-ATGATTTTATTTTGACTGAT-3′,下游引物F2：5′-CTACTGATAATCAGGGTTGA-3′；ZmbZIP72上游引物F3：5′-ATGGACGAGCTGCTCCAGA-3′,下游引物F4：5′-ATGGACGAGCTGCTCCAGA-3′。PCR擴增條件：預變性94 ℃ 2 min；98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 30 min加A尾。擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收連接到pMD19-T載體，由上海生工生物工程有限公司測序，測序結果比對正確的陽性質粒待用。

1.3.2BiFC融合載體的構建及鑒定。通過分析ZmMAPK5和ZmbZIP72基因序列上的克隆位點，在上下游引物中分別添加HindIII和BamHI以及XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點，以連入目的基因的T載體質粒為模板進行PCR擴增。PCR產物和BiFC載體經相應的內切酶雙酶切后回收，回收產物用T4連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR初步驗證挑取陽性單菌落提取質粒，進一步用相應的內切酶酶切鑒定，鑒定成功的克隆送上海生工生物工程有限公司測序。構建成功的載體分別命名為pN-MAPK5、pC-bZIP72。

1.3.3基因槍轟擊洋蔥表皮細胞瞬時表達。在超凈工作臺中，將洋蔥剝去外表皮后，取第4層鱗莖切成2 cm × 2 cm的方塊，撕下內表皮貼在滅好菌的2%瓊脂糖培養(yǎng)基上，盡可能減少氣泡，待用。取7.5 μL金粉懸液于Eppendorf管，依次加入1 μL質粒DNA(1 μg/μL)，15 μL 2.5 mol/L CaCl2和6 μL 0.1 mol/L亞精胺。振蕩3 min，冰上靜置10 s，10 000 r/min離心10～20 s，棄上清。加80 μL無水乙醇，振蕩重懸，10 000 r/min離心10～20 s，棄上清。用10 μL無水乙醇重懸，待用。將壓力膜和轟擊膜在70%乙醇中浸泡10 min后取出，在超凈工作臺上晾干；金屬擋板用70%乙醇清洗晾干。將10 μL無水乙醇重懸的金粉-DNA復合體均勻涂布于轟擊膜的中間位置，晾干，安裝到發(fā)射裝置上。將可裂膜安裝到氣體加速管的下端，洋蔥表皮集中于培養(yǎng)皿的中部，放入真空室內，取下培養(yǎng)皿蓋。抽真空指針到所需值(27 in，Hg)，放氦氣于氣體加速管，直至管中壓力達到可裂圓片所能承受的壓力時，可裂膜破開，氣體沖至轟擊膜上，金屬顆粒透過金屬擋板的網孔射向洋蔥細胞，可裂膜壓力為1 100 psi。轟擊完的洋蔥細胞25 ℃培養(yǎng)24 h后用激光共聚焦顯微鏡(LSM 510 META)觀察，黃色熒光蛋白(Yellow Fluorescent Protein, YFP)最適激發(fā)光波長490 nm，發(fā)射光波長515 nm。

2結果與分析

2.1玉米MAPK5和bZIP72基因的克隆以反轉錄的玉米葉片cDNA為模板，用相應的引物進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到1 200和890 bp的特異性條帶(圖1)，與ZmMAPK5和ZmbZIP72預期的CDS序列大小一致。用凝膠回收試劑盒分別回收，將回收的目的條帶連接到克隆載體pMD19-T上，轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經菌落PCR驗證后挑取陽性單菌落提取質粒，由上海生工生物工程有限公司測序，測序結果通過BLAST比對證實，擴增序列與ZmMAPK5和ZmbZIP72的基因序列完全一致。

2.2BiFC融合載體的構建及驗證ZmMAPK5和ZmbZIP72基因擴增的片段經HindⅢ+BamHⅠ、XbaⅠ+SmaⅠ雙酶切后，分別連接至同樣經HindⅢ+BamHⅠ、XbaⅠ+SmaⅠ雙酶切的BiFC載體pUC19-N和pUC19-C上，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR驗證后挑取陽性單菌落提取質粒，經雙酶切鑒定，ZmMAPK5條帶約為1 200 bp，ZmbZIP72條帶約為890 bp，與預期結果一致(圖2)。測序結果通過BLAST比對與NCBI報道的序列完全一致，表明重組質粒pN-MAPK5和pC-bZIP72融合表達載體構建成功。

注：A中M.DNA Marker，Marker III, 1. ZmMAPK5 (1 200 bp); B中M.DNA Marker，DL2 000; 1.ZmbZIP72(890 bp)。Note:As for A, M.DNA Marker, MarkerIII; 1.ZmMAPK5 (1 200 bp); As for B, M.DNA Marker; DL2000; 1.ZmbZIP72 (890 bp).圖1　ZmMAPK5和ZmbZIP72基因的PCR擴增Fig.1　PCR products of ZmMAPK5 and ZmbZIP72 genes

注：A中M.DNA Marker，Trans 2K plus DNA Marker, 1.重組質粒pN-MAPK5雙酶切結果(HindⅢ+ BamHⅠ); B中M.Trans 2K plus DNA Marker, 1.重組質粒pC-bZIP72雙酶切結果(XbaⅠ+ SmaⅠ)。Note: As for A, M.DNA Marker, Trans 2K plus DNA Marker; 1.Identification of recombinant plasmid of N-MAPK5by HindⅢ+ BamHⅠ; As for B, M.Trans 2K plus DNA Marker; 1.Identification of recombinant plasmid ofC-bZIP72by XbaⅠ+ SmaⅠ.圖2　BiFC融合表達載體pN-MAPK5和pC-bZIP72酶切鑒定Fig.2　Enzyme cut products of N-MAPK5 and C-bZIP72 plasmids

2.3BiFC檢測ZmMAPK5和ZmbZIP72蛋白相互作用將構建好的BiFC融合載體pN-MAPK5和pC-bZIP72利用基因槍轟擊至洋蔥下表皮細胞中，25 ℃培養(yǎng)16 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光信號，設置pN-MAPK5和pC-ABA2為陽性對照；pN-MAPK5和pC-bZIP71為陰性對照。結果顯示，在激光共聚焦顯微鏡下陰性對照無熒光信號，陽性對照MAPK5和ABA2在整個細胞質中均檢測到黃色熒光信號，而MAPK5和bZIP72僅在細胞核中檢測到黃色熒光信號(圖3)。說明ZmMAPK5和ZmbZIP72在植物體內存在蛋白互作，且相互作用發(fā)生在細胞核中。

注：A試驗組(pN-MAPK5和pC-bZIP72)的洋蔥表皮細胞，1.明場，2.黃色熒光蛋白激發(fā)熒光；3.1和2疊合；bar=150 μm; B陰性對照(pN-MAPK5和pC-bZIP71)的洋蔥表皮細胞，1.明場，2.無黃色熒光，3.1和2疊合，bar=150 μm; C陽性對照(pN-MAPK5和pC-ABA2)的洋蔥表皮細胞，1.明場，2.黃色熒光蛋白激發(fā)熒光，3.1和2疊合，bar=75 μm。Note:A Experiment groups (pN-MAPK5 and pC-bZIP72)of bombarding onion epidermal cells:1.Light; 2.Fluorescence; 3.Merge; bar=150 μm;BNegative control (pN-MAPK5 and pC-bZIP71)of bombarding onion epidermal cells:1.Light; 2.Fluorescence; 3.Merge; bar = 150 μm;B Positive control(pN-MAPK5 and pC-ABA2)of bombarding onion epidermal cells:1.Light; 2. Fluorescence; 3.Merge; bar = 75 μm.圖3　ZmMAPK5和ZmbZIP72在洋蔥表皮細胞中互作的BiFC檢測Fig.3　BiFC assay of ZmMAPK5 and ZmbZIP72 in onion epidermal cells

3結論與討論

研究表明，玉米MAPK5參與ABA誘導的抗氧化防護且可增強植物對干旱、高鹽以及氧化脅迫等逆境的耐受性[4-5]。玉米bZIP72蛋白是ABA依賴的逆境響應途徑的轉錄激活子，且bZIP72蛋白的活性可能受到轉錄后調控。Ying等[6]研究玉米SAPK8調控bZIP72蛋白時發(fā)現兩者之間無相互作用。玉米MAPK5能否調控bZIP72是該研究的重點。

BiFC技術是研究蛋白質相互作用的最直觀方法，該技術將2個蛋白分別連到YFP截斷的N末端(YN，1～173)和C末端(CN，173～238)，當這2個蛋白相互作用靠近時，YFP截斷的N末端和C末端便形成完整的YFP發(fā)出黃色熒光，這個系統(tǒng)最初被應用在動物細胞中研究蛋白之間的相互作用[7-8]。隨著瞬時表達的建立，結合BiFC技術相繼建立了原生質體的BiFC系統(tǒng)研究植物中蛋白之間的相互作用[9-11]。Xu等[12]利用擬南芥原生質體的BiFC系統(tǒng)證實了CIPK23與CBL1、CBL9，CIPK23與AKT1在擬南芥原生質體中相互作用調控K+的吸收，作用位置均在細胞膜上。該研究構建了ZmMAPK5和ZmbZIP72熒光表達載體，以已知有相互作用的pN-MAPK5和pC-ABA2為陽性對照,充分說明兩者在細胞內相互作用。

該研究成功建立了基因槍轟擊洋蔥表皮細胞瞬時表達

體系，結合BiFC技術發(fā)現ZmMAPK5和ZmbZIP72在植物體內存在蛋白互作，且相互作用發(fā)生在細胞核中。該研究結果為MAPK在玉米逆境脅迫響應途徑中的機理研究提供了思路。

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作者簡介曹建美(1985- )，女，江蘇金壇人，工程師，博士，從事植物抗逆研究。

收稿日期2016-04-10

中圖分類號S 188+.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)14-152-03

Interaction Between MAPK5 and bZIP72 of Maize Using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay

CAO Jian-mei

(Shanghai Chenshan Plant Science Research Center, Chinese Academy of Science, Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai 201602)

Abstract[Objective] To analyze the interaction between MAPK5 and bZIP72.[Method] Two BiFc plasmids (pN-MAPK5 and pC-bZIP72) were constructed, then transfected into onion epidermal cells via gene-gun approach.The interaction between MAPK5 and bZIP72 was examined by confocal laser scanning microscopy.[Result] Yellow fluorescence was observed in the onion epidermal cells transfected with ZmMAPK5 and ZmbZIP72.[Conclusion] This research indicates that ZmMAPK5 and ZmbZIP72 interacts with each other in vivo.

Key wordsZmMAPK5; ZmbZIP72; Bimolecular fluorescence complementation (BiFC); Protein interaction