杜國豐，關云虎（營口理工學院 化學工程系，遼寧 營口 115014）

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油田本源微生物胞外聚合物產(chǎn)生菌AD-05發(fā)酵條件的實驗室評估

杜國豐，關云虎
（營口理工學院 化學工程系，遼寧 營口 115014）

摘要：對一株篩選自遼河油田油水樣的生物聚合物產(chǎn)生菌AD-05進行了發(fā)酵條件的室內(nèi)評估。結果表明：菌株AD-05為一株革蘭氏陰性桿菌，菌落數(shù)、發(fā)酵液黏度及多糖產(chǎn)量具有很好的相關性。菌株在pH=8.0下，培養(yǎng)27 h，多糖產(chǎn)量達到25.2 mg·mL-1，黏度為59.96 mPa·s；能夠耐受8%NaCl。發(fā)酵產(chǎn)物胞外多糖在80 ℃下放置30 h黏度變化不明顯。菌株AD-05的發(fā)酵特性為其應用于油藏出油率低、地層條件復雜的采油礦場提供了可能性。

關鍵詞：菌株AD-05；生物聚合物；黏度；聚合物驅(qū)油

微生物采油技術是一項利用微生物的代謝產(chǎn)物來調(diào)節(jié)、改善油藏條件，降低滲透率，擴大水驅(qū)范圍，從而提高采收率的技術。用于采油的微生物代謝產(chǎn)物主要有表面活性劑、有機酸、氣體、生物聚合物等，它們能夠改善油藏條件，使原油易于流動，從而提高采收率［1］。目前，國內(nèi)多數(shù)油田在聚合物驅(qū)后，地下油層中仍有近50%的原油未被開采，僅依靠常規(guī)技術進一步采出剩余油的難度非常大［2］。

本試驗前期從遼河油田金馬采油作業(yè)二區(qū)2083井附近油水樣中篩選出一株高產(chǎn)生物聚合物的菌株AD-05，經(jīng)初步鑒定產(chǎn)物為胞外多糖。本文對該菌的發(fā)酵特性進行了實驗室評估，并對產(chǎn)物的高溫穩(wěn)定性進行了考察，以期用于微生物驅(qū)油的現(xiàn)場試驗。

該菌與已報道的用于驅(qū)油的微生物相比，它的產(chǎn)量在50 ℃時仍能達到7.3 mg·mL-1，是一株高產(chǎn)生物聚合物的菌株，在中溫油藏環(huán)境下對于微生物的調(diào)驅(qū)有著很好的應用前景。一方面產(chǎn)物溶于水黏度較高，增強了注入水的推動力，提高驅(qū)油效率；另一方面，大量的微生物菌體可對滲透層進行封堵，擴大注入水的波及范圍，使三次、四次采油的采收率大大提高［3］。

1　實驗部分

1.1菌體及培養(yǎng)基

生物聚合物產(chǎn)生菌 AD-05（篩選自遼河油田油水樣）；

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，NaCl 5 g/L，pH=7.2；

生物聚合物發(fā)酵培養(yǎng)基：4 g葡萄糖+2 g玉米漿+ 0.l g Na2HPO4+0.05 g K2HPO4+0.3 g NaNO3+0.05 g MgSO4+0.05 g CaC12+100 mL蒸餾水；

1.2儀器及試劑

儀器：BJ-2CD型超凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司），KZD-C型雙層空氣恒溫振蕩器（金壇市國旺實驗儀器廠），TDL-40B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），PHS-3C型精密pH計（上海虹益儀器儀表有限公司），0.8、1.0、1.2、1.5 mm品氏黏度計（上海睿齊實業(yè)有限公司）、GZX-9146MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）。

試劑：革蘭氏染液、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、無水乙醇等，上述藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗方法

1.3.1革蘭氏染色觀察

將生物聚合物產(chǎn)生菌AD-05按2%接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，取發(fā)酵液進行革蘭氏染色，觀察菌落形態(tài)。

1.3.2胞外多糖粗品的制備

將1.3.1中的發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，向上清液中添加無水乙醇（上清液：無水乙醇=1：2），放置于4 ℃冰箱中3 h后取出5 000 r/min離心10 min，沉淀再次用少許無水乙醇洗滌，烘干至恒重，得胞外多糖粗品［4］。

1.3.3 發(fā)酵液中菌落數(shù)、黏度、胞外多糖產(chǎn)量的測定

按照2%的接種量將LB富集液轉(zhuǎn)接到生物聚合物發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)30 h，每隔3 h取100 μL菌液，稀釋到相應倍數(shù)，使得平板涂布菌落數(shù)在 30～300之間，菌落計數(shù)后計算菌液中菌落形成單位數(shù)（cfu）、利用品氏黏度計測定發(fā)酵液黏度、利用苯酚硫酸法［5］測定發(fā)酵液中生物聚合物胞外多糖的產(chǎn)量。

1.3.4 不同溫度下發(fā)酵液黏度、胞外多糖產(chǎn)量的測定

分別在30、40、50、60、70 ℃下，按照2%的接種量將菌株 AD-05接種于生物聚合物發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min振蕩培養(yǎng)27 h，測定不同溫度下發(fā)酵液的黏度及多糖產(chǎn)量。

1.3.5 不同pH下發(fā)酵液黏度、胞外多糖產(chǎn)量的測定

分別在pH=3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下，按照2%的接種量將菌株AD-05接種于生物聚合物發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min振蕩培養(yǎng)27 h，測定不同pH下發(fā)酵液的黏度及多糖產(chǎn)量。

1.3.6 不同NaCl濃度下發(fā)酵液黏度、胞外多糖產(chǎn)量的測定

在生物聚合物發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的NaCl，按照2%的接種量將菌株AD-05接種于培養(yǎng)基中，150 r/min振蕩培養(yǎng)27 h，測定不同鹽度下發(fā)酵液的黏度及多糖產(chǎn)量。

1.3.7高溫下產(chǎn)物黏度的測定

將AD-05發(fā)酵所產(chǎn)的胞外多糖粗品配成2%的溶液，放置于80 ℃鼓風干燥箱內(nèi)，每隔3 h測定其黏度，記錄其黏度隨時間的變化情況。

2　結果與討論

2.1菌落形態(tài)

AD-05的菌落形態(tài)如圖1所示。平板上菌落單一，表層干燥，邊緣較光滑，輕輕挑動有拉絲現(xiàn)象。菌株AD-05經(jīng)革蘭氏染色觀察呈桿狀，為革蘭氏陰性菌（圖2）。

圖1　菌株AD-05在LB平板上的狀態(tài)Fig.1 The state of strain AD-05 on LB plate

圖2　菌株AD-05革蘭氏染色形態(tài)Fig.2 Strain AD-05 gram stain morphology

2.2多糖粗品的外觀形態(tài)

菌株AD-05的發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心后上清液利用2倍的無水乙醇沉淀，加入乙醇立即出現(xiàn)絮狀沉淀，且呈可挑掛的狀態(tài)（如圖3、圖4），說明AD-05發(fā)酵所產(chǎn)的生物聚合物為胞外多糖。

圖3　AD-05上清液乙醇沉淀多糖析出Fig.3 AD-05 supernatant ethanol precipitation

2.3發(fā)酵液中菌落數(shù)、黏度、胞外多糖產(chǎn)量之間的相關性

菌株AD-05在接種的前12 h，基本上處于生長延滯期，到15 h以后菌株生長進入對數(shù)生長旺期，至27 h后逐漸進入穩(wěn)定期，此時多糖產(chǎn)量可達22.3 mg·mL-1，發(fā)酵液黏度為54.68 mPa·s，從圖5中可以看出，菌落數(shù)、多糖含量、發(fā)酵液黏度三者之間呈現(xiàn)很好的相關性。

圖4　呈可挑掛的AD-05胞外多糖Fig.4 AD-05 extracellular polysaccharide

圖5　不同培養(yǎng)時間下菌落數(shù)與黏度、多糖產(chǎn)量三者之間的關系曲線圖Fig.5 The relationship curves of the colony number，viscosity and the yield of polysaccharide in different culture

2.4溫度對發(fā)酵液黏度、胞外多糖產(chǎn)量的影響

圖6　溫度對AD-05發(fā)酵液黏度及多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of temperature on viscosity and yield of polysaccharide in AD-05 fermentation broth

菌株AD-05在30、40、50、60、70 ℃下振蕩培養(yǎng)27 h后，多糖含量與黏度之間的關系如圖6所示。從圖6中可以看出，升高溫度對AD-05發(fā)酵代謝產(chǎn)胞外多糖不利，在40 ℃時，多糖產(chǎn)量達到22.6 mg·mL-1，此時的黏度為55.87 mPa·s；在50 ℃下，培養(yǎng)27 h，多糖產(chǎn)量、發(fā)酵液黏度均明顯降低，但仍可達7.3 mg·mL-1和25.32 mPa·s；當溫度升高到60 ℃時，仍可見AD-05代謝產(chǎn)物有多糖產(chǎn)生；但當溫度升高至70 ℃時，AD-05幾乎不生長，說明菌株AD-05的最佳發(fā)酵溫度在40 ℃左右。

2.5 pH對發(fā)酵液黏度、胞外多糖產(chǎn)量的影響

利用生物聚合物發(fā)酵培養(yǎng)基，在 pH=3.0～11.0范圍內(nèi)150 r/min振蕩培養(yǎng)27 h后，多糖產(chǎn)量與黏度之間的關系如圖 7所示。從圖中可以看出，pH=8.0的條件對AD-05發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖是有利，且此時多糖產(chǎn)量達到25.2 mg·mL-1，黏度達到59.96 mPa·s，初步說明弱堿性的環(huán)境對AD-05產(chǎn)聚合物是有利的。

圖7　pH對AD-05發(fā)酵液黏度及多糖產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of pH on viscosity and yield of polysaccharide in AD-05 fermentation broth

2.6鹽度對發(fā)酵液黏度、胞外多糖產(chǎn)量的影響

如圖8所示，培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl時，隨著鹽濃度的增大AD-05生長狀況越來越差，不過AD-05在不高于8% NaCl濃度時，多糖的產(chǎn)量均在30 mg·mL-1以上，甚至在12% NaCl濃度的條件下培養(yǎng)，亦有胞外多糖產(chǎn)生。說明菌株AD-05是一株耐高礦化度的胞外多糖高產(chǎn)菌種。

圖8　NaCl濃度對AD-05發(fā)酵液黏度及多糖產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of NaCl concentration on viscosity and yield of polysaccharide in AD-05 fermentation broth

2.7高溫對產(chǎn)物黏度的影響

將AD-05發(fā)酵液利用乙醇沉淀后，5 000 r/min離心，再次用無水乙醇洗滌，于80 ℃下烘干至恒重。用去離子水配成 2%的粗多糖溶液，其初始黏度為50.71 mPa·s，將此水凝膠溶液放置于80 ℃下，每隔3 h測定一次黏度，記錄其黏度的變化情況（見圖9）。從圖中可以看出，隨著時間的延長，黏度有些許下降，但經(jīng)過30 h黏度也僅僅是下降到47.78 mPa·s。說明菌株 AD-05所產(chǎn)的生物聚合物胞外多糖在80 ℃下具有較好的穩(wěn)定性，對其黏度影響不大。

圖9　80 ℃時，AD-05胞外多糖黏度的變化曲線Fig.9 The change curve of viscosity of AD-05 polysaccharides at 80 ℃

3　結 論

本文中生物聚合物產(chǎn)生菌 AD-05篩選自遼河油田的油水樣，經(jīng)革蘭氏染色觀察為一株革蘭氏陰性桿菌，代謝產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀為呈可調(diào)掛的胞外多糖聚合物。該聚合物在添加了玉米漿的生物聚合物培養(yǎng)基中培養(yǎng)27 h達到對數(shù)生長頂峰期，此時多糖產(chǎn)量可達22.3 mg·mL-1，發(fā)酵液黏度為54.68 mPa·s；在50 ℃下，培養(yǎng)27 h，多糖產(chǎn)量仍可達7.3 mg·mL-1，發(fā)酵液黏度為25.32 mPa·s。通過在不同pH下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌株AD-05在偏堿性的條件（pH=8.0）下多糖產(chǎn)量和發(fā)酵液黏度均達到最佳，分別為25.2 mg·mL-1和59.96 mPa·s；在模擬地下巖層礦化度（本文以NaCl濃度為參考）情況下，發(fā)現(xiàn)菌株AD-05能夠耐受一定的鹽度，在8%以下的NaCl濃度下，AD-05可以很好的生長，且多糖產(chǎn)量及發(fā)酵液黏度也具有很好的相關性；最后對AD-05所產(chǎn)的胞外多糖的耐溫性進行了考察，在80 ℃的條件下放置30 h，黏度變化不明顯。菌株AD-05的這些發(fā)酵性能為其應用于目前油藏出油率低、地層條件復雜的采油礦場提供了可能性。

本源微生物在油藏條件下能夠生長，發(fā)酵周期短，能夠在廉價原料制成的培養(yǎng)基中生長，且代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高，易于回收。大多數(shù)成功的油田試驗所采用的菌種都具有產(chǎn)氣、產(chǎn)酸、生物聚合物和表面活性劑的能力，這些代謝產(chǎn)物對提高驅(qū)油效率非常有益［6］。從經(jīng)濟角度來看，營養(yǎng)物最好是以烴類為主，添加少量其它營養(yǎng)物質(zhì)［7］。糖蜜是微生物生長的良好營養(yǎng)物，已在許多礦場試驗中采用［8］。從安全角度來看，本文中的菌種屬非致病菌，不產(chǎn)生任何有害的生物毒素，對動物和植物都不產(chǎn)生毒害作用。

生物聚合物產(chǎn)生菌在多孔介質(zhì)中生長狀況良好，對高滲透層有良好的封堵作用，生物聚合物注入巖心后有效封堵高滲層，使得調(diào)剖后注入壓力明顯提高，從而提高原油的采收率［9-11］。

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Laboratory Evaluation of the Fermentation Conditions of the Bio-polymer Producing Bacteria AD-05 From Oil Field Source

DU Guo-feng，GUAN Yun-hu
（Department of Chemical Engineering，Yingkou Institute of Technology，Liaoning Yingkou 115014，China）

Abstract：In this paper，a screening of the bio-polymer producing bacteria AD-05 from the oil samples of the Liaohe oil field was carried out to evaluate the fermentation conditions.The results show that the strain AD-05 is gram negative bacilli；the number of colonies，the viscosity of the fermentation broth and the yield of polysaccharide have a good correlation.The yield of polysaccharide is 25.2 mg·mL-1，the viscosity is 59.96 mPa·s at pH=8.0；the strains are able to tolerate 8% NaCl.The extracellular polysaccharide of fermentation products was placed 30 h at 80 degree，the change of viscosity was not obvious.The fermentation characteristics of strain AD-05 can provide the possibility for its application in the oil production field with low oil yield and complex formation conditions.

Key words：Strain AD-05；Bio-polymer；Viscosity；Polymer flooding

中圖分類號：TQ 028

文獻標識碼：A

文章編號：1671-0460（2016）01-0044-04

收稿日期：2015-10-15

作者簡介：杜國豐（1984-），男，遼寧營口人，實驗師，碩士，2009年畢業(yè)于沈陽農(nóng)業(yè)大學生物化學與分子生物學專業(yè)，研究方向：從事生物化工方面的研究。E-mail：duguofeng885624@163.com。