樊　川，安　琦，曹亞彬，李艷波，楊　瑤

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.哈爾濱學院，哈爾濱 150000）

?

微生物肥料中蘇云金芽孢桿菌洗脫條件的優(yōu)化

樊川1，安琦1，曹亞彬1，李艷波2，楊瑤2

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.哈爾濱學院，哈爾濱 150000）

摘要：本研究以蘇云金芽孢桿菌作為供試液，分別以草炭、褐炭、雞糞作為載體，通過改變pH、時間、溫度、離子強度、緩沖液等環(huán)境條件，分別測出蘇云金芽孢桿菌的解析率，確定出最佳解析條件，從而提高菌體洗脫率和回收率。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；肥料；洗脫條件；優(yōu)化

測定微生物肥料中的有效活菌數(shù)的方法起源于經(jīng)典的微生物計數(shù)方法——平板計數(shù)法。在實際工作中，對固體樣品的檢測一直存在回收率低的問題，不能準確反映固體樣品中真實有效菌數(shù)量，具體表現(xiàn)為：發(fā)酵液體菌劑在加入固體載體后，立即依據(jù)標準方法進行檢測，測定出的有效活菌數(shù)總數(shù)，但也低于加入的發(fā)酵液體中總數(shù)1～2個數(shù)量級，嚴重偏離理論結果。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生，其本質(zhì)原因是微生物菌體與吸附載體之間的吸附作用，導致樣品中菌體在洗脫階段沒有被充分洗脫［1］。如何減少微生物與載體間的吸附作用，提高菌體洗脫率和回收率成為急需解決的關鍵環(huán)節(jié)。本項目以蘇云金芽孢桿菌作為供試菌，分別以草炭、褐炭、雞糞為載體，通過改變pH、震蕩時間、溫度、離子強度、緩沖液等環(huán)境條件，確定出最佳吸附條件，從而為提高菌體洗脫率和回收率，為蘇云金芽孢桿菌的更好應用奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌種

蘇金芽孢桿菌（拉丁名），黑龍江省科學院微生物研究所保存。

1.1.2其他材料

草炭來自黑龍江雞西，pH約5.0，腐殖酸含量36.1%；褐煤來自黑龍江雞西，腐殖酸含量超過40%；雞糞來自正大養(yǎng)雞場，已腐熟。

1.2方法

1.2.1菌液的制備

用接種環(huán)挑取4℃保藏的蘇云金芽孢桿菌，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃、120r/min的搖床上培養(yǎng)10h。取1mL活化菌液接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100mL，37℃、120r/min培養(yǎng)48h后備用。

1.2.2載體的處理

對草炭、褐煤和雞糞3種載體分別采用高壓蒸汽滅菌，121℃，滅菌處理lh，無菌檢查后備用。

1.2.3菌體吸附

在無菌條件下，將蘇云金芽孢桿菌菌劑按10%體積比均勻混合到經(jīng)高壓蒸汽滅菌的草炭、褐煤和雞糞3種載體中，混勻，室溫放置48h后，作為微生物肥料樣品。

1.2.4菌體洗脫試驗

參照國家標準GB 20287-2006中規(guī)定的有效活菌數(shù)的檢驗方法，以不同pH值的替代生理鹽水進行菌體的提取或洗脫，研究洗脫液對菌體提取的影響；控制不同的提取時間，研究提取時間對菌數(shù)測定的影響；控制不同的提取溫度，研究溫度對菌數(shù)測定的影響；以不同離子強度的氯化鈉替代生理鹽水，研究離子強度對菌數(shù)測定的影響；以不同濃度的磷酸鹽緩沖液替代生理鹽水，研究緩沖液濃度對菌數(shù)測定的影響；使用不同的吸附載體，研究載體對菌數(shù)測定的影響。

2　結果與分析

2.1吸附試驗前蘇云金芽孢桿菌的有效活菌數(shù)

對接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后的蘇云金芽孢桿菌進行計數(shù)，采用平板計數(shù)法測定其有效活菌數(shù)。制備的菌液中，蘇云金芽孢桿菌的有效活菌數(shù)為1.3×109cfu/mL。

2.2不同解吸條件的篩選結果

2.2.1不同pH 下蘇云金芽孢桿菌的解吸的影響

吸附于3種不同載體的蘇云金芽孢桿菌，在pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9下的解析細菌數(shù)見表1，由表可見，蘇云金芽孢桿菌在不同載體、不同pH的解吸數(shù)是不同的，蘇云金芽孢桿菌在雞糞中的解吸數(shù)高于褐煤的解吸數(shù)，高于草炭的解吸數(shù)。隨著pH不斷升高，其解吸數(shù)逐漸提高，pH 8時其解吸數(shù)達到最大值，因而解吸率最高。

表1 不同pH 下蘇云金芽孢桿菌的解吸數(shù)量Tab.1 Desorption under different pH of Bacillus thuringiensis number

2.2.2不同震蕩時間對解吸的影響

吸附于3種不同載體的蘇云金芽孢桿菌在不同的震蕩時間下，解析數(shù)見表2，由表可見，其解吸數(shù)量隨著震蕩時間的不同而變化，震蕩40min時達到最大值，解吸率最高，隨后逐漸降低。

表2 不同震蕩時間下蘇云金芽孢桿菌的解吸數(shù)量Tab.2 Different shock time of desorption of Bacillus thuringiensis number

2.2.3不同溫度下蘇云金芽孢桿菌解吸數(shù)的影響

吸附于3種不同載體的蘇云金芽孢桿菌在不同溫度下，其解析數(shù)如表3所示，其解吸數(shù)受溫度影響不明顯。隨著溫度的升高，蘇云金芽孢桿菌在載體表面的解吸數(shù)先是呈下降趨勢，而后逐漸上升，當溫度達到40℃時解吸數(shù)達到最大值，解吸率最高。

表3 不同溫度下蘇云金芽孢桿菌的解吸數(shù)量Tab.3 Under different temperature of Bacillus thuringiensis desorption quantity

2.2.4不同離子強度下蘇云金芽孢桿菌的解吸數(shù)的影響

吸附于3種不同載體的蘇云金芽孢桿菌在不同離子強度下的解吸率不同，結果見表4，由表可見，蘇云金芽孢桿菌的吸附受溶液中離子強度的制約，隨Na+濃度增加解吸數(shù)逐漸降低，解吸率在離子強度為0時解吸率最高。

表4 不同離子強度下蘇云金芽孢桿菌的解吸數(shù)量Tab.4 Desorption at different ionic strength of Bacillus thuringiensis number

2.2.5不同稀釋緩沖液對解吸數(shù)的影響

本研究分別以生理鹽水、無菌水、磷酸鹽緩沖液、添加表面活性劑4種稀釋緩沖液，測定其對解吸數(shù)的影響，結果如表5所示，可以看出，不同的稀釋緩沖液中其解吸率不同，蘇云金芽孢桿菌在磷酸鹽緩沖液中解吸率高于滅菌水中解吸數(shù)，添加表面活性劑的稀釋緩沖液更有助于蘇云金芽孢桿菌的釋放，解吸率最高。

表5 不同稀釋緩沖液下蘇云金芽孢桿菌的解吸數(shù)量Tab.5 The number of desorption of Bacillus thuringiensis under different dilution buffer

2.2.63種吸附載體的解吸效果比較

采用pH= 8，震蕩培養(yǎng)40min，培養(yǎng)溫度40℃、離子強度為0和添加表面活性劑的緩沖液稀釋等最佳的解吸條件對3種載體中的蘇云金芽孢桿菌進行菌落計數(shù)。結果在雞糞、褐煤及草炭中的有效活菌數(shù)分別為8.47×108、7.76×108、6.44×108。由此說明解吸效果最佳的載體為雞糞，解吸率最高。

3　結論

蘇云金芽孢桿菌在溶液pH= 8，震蕩培養(yǎng)40min，培養(yǎng)溫度40℃解吸率最高；且該菌的解吸率隨Na+濃度增加解吸率逐漸降低；在不同緩沖液中的解析率不同，在表面活性劑中的解吸率最高，其次為磷酸鹽緩沖液，再次為滅菌水；該菌在不同吸附載體中的解析率不同，在雞糞中的解吸率高于褐煤的解吸率，褐煤高于草炭的解吸。本研究為進一步提高蘇云金芽孢桿菌的洗脫率和回收率，更好應用該菌奠定了實驗基礎。

參考文獻：

［1］Audtho M， Valaitis A P， Alzate O and Dean D H.Production of chymotrypsin-resistant Bacillus thuringiensis Cry2 Aal-endotoxin by protein engineering［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，（65）：4601-4605.

［2］VECEREK B，KYSLIK P.Cloning and seuencing of the neutral proteinase encoding gene from a thermophilic strain of Bacillus sp［J］.Gene，1995，158（1）：147-148.

［3］Bictlot H P， Schernthaner J P， Milne R E， Clairmont F R， Bhella R S and Kaplan H. Evidence that the CrylA crystal prote in from Bacillus thuringiensis is associated with DNA［J］.The joumal of Biological Chemistry，1993，（268）：8240-8245.

［4］芙蓉，王利剛，王金斌，等.蘇云金芽孢桿菌及其殺蟲晶體蛋白基因資源的研究進展［J］.上海農(nóng)業(yè)學報，2010，26（4）：135-139.

［5］朱瑋，趙兵，王曉東，等.生物農(nóng)藥蘇云金芽孢桿菌的研究進展［J］.過程工程學報，2004，4（3）：282-288.

［6］丁學知，鄒先瓊，孫運軍，等.蘇云金芽孢桿菌4.0718菌株晶體毒素性質(zhì)的研究［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2005，13（3）：365-371.

［7］MILONO A，MANACHINI P L，PARINI C，et a1.Sequence ofthe gene encoding an alkaline serine protease of thermophilic Bacillus smithii［J］.Gene，1994，145 （1）：149-150.

［8］KUMAR C G.Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkealiphilic Bacillus pumilus［J］.Leg Appl Micoobiol，2002，34（1）：13-17.

中圖分類號：S476.1

文獻標志碼：A

文章編號：1674-8646（2016）10-0005-03

收稿日期：2016-04-02

基金項目：哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項基金（青年后備大才）“甜菜專用微生物肥料的產(chǎn)品化技術研究”（RC2015QN002116）

通訊作者：曹亞彬（1964-），男，黑龍江哈爾濱人，學士，研究員，從事微生物學研究，e-mail：caoyabin642050@sina.com。

Optimization of elution conditions of Bacillus thuringiensis in microbial fertilizer

FAN Chuan1， AN Qi1， CAO Ya-bin1， LI Yan-bo2， YANG Yao2
（1. Institute of Microbiology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150010， China；2. Harbin University， Harbin 150000， China）

Abstract：In this study， the Bacillus thuringiensis as probational liquid， respectively to peat， lignite， chicken manure as a carrier，through alter the pH，time，temperature，ionic strength，buffer conditions were measured rate of Bacillus thuringiensis analytical，and determines the optimum analytical conditions，so as to improve cell elution rate and recovery rate.

Key words：Bacillus thuringiensis； Fertilizer； Elution conditions； Optimization