張冰雨, 曾瑞翔, 舒曉亮, 雷 濤

(1. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200065； 2. 復旦大學附屬金山醫(yī)院營養(yǎng)科，上海 201500； 3. 上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200062)

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·基礎研究·

糖化LDL對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞SOD活性及基因表達的影響

張冰雨1, 曾瑞翔1, 舒曉亮2, 雷 濤3

(1. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200065； 2. 復旦大學附屬金山醫(yī)院營養(yǎng)科，上海 201500； 3. 上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200062)

目的 觀察糖化低密度脂蛋白(gly-LDL)對人血管內(nèi)皮細胞生長及抗氧化相關(guān)因子的影響，探討糖尿病患者血管內(nèi)皮損傷與gly-LDL的相關(guān)性及可能機制。方法 用完全培養(yǎng)基及不同濃度(G1組 0.06mg/L, G2組0.12mg/L, G3組0.24mg/L)的gly-LDL處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)24h、48h及72h，設對照組(Ctr)，取細胞培養(yǎng)上清液檢測SOD和MDA水平，同時用細胞劃痕實驗觀察gly-LDL對內(nèi)皮細胞遷移功能的影響，用實時半定量PCR(realtime quantitative PCR，RT-qPCR)方法測定Mn-SOD和eNOS的mRNA的表達情況。結(jié)果 與 對照組相比不同濃度的gly-LDL均可抑制血管內(nèi)皮細胞的遷移功能。較低或較高濃度的gly-LDL作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞時，隨時間的增加SOD的活性及MDA的含量是升高的；中間濃度的gly-LDL作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞時，隨時間的增加SOD活性是逐漸下降的，MDA含量是先增高后降低的。各組Mn-SOD的mRNA表達水平48h和72h均下調(diào)，eNOS的表達水平于24h和48h均下調(diào)，72h時上調(diào)。結(jié)論 Gly-LDL與糖尿病患者血管并發(fā)癥可能存在一定的相關(guān)性，但不能肯定其是惡化因素之一。

糖基化； 低密度脂蛋白； 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞； 超氧化物歧化酶； 丙二醛

脂代謝紊亂尤其是低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)含量升高與心血管病變密切相關(guān)，修飾后LDL與心血管病變的相關(guān)性研究正逐漸增多，糖化LDL(glycated low density lipoprotein, gly-LDL)作為糖尿病的生化指標之一，是晚期糖化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end-products， AGEs)的重要組成部分，在糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生中起到了重要作用，多數(shù)研究表明AGEs與血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)[1-2]，可引起內(nèi)皮炎癥反應，加速糖尿病血管粥樣硬化的進程，但具體機制尚未完全明確。臨床上已經(jīng)對部分糖尿病患者采取了抗氧化治療，取得了一定的療效[3]，大部分研究也提示氧化應激在血管病變中發(fā)揮重要作用[4]，但Gly-LDL對血管內(nèi)皮的影響是否通過導致氧化應激作用而引起血管病變?nèi)杂写懻?。本研究通過檢測氧化應激的部分相關(guān)物質(zhì)評價gly-LDL對血管內(nèi)皮細胞的作用，探討gly-LDL與糖尿病血管并發(fā)癥的相關(guān)性及可能影響機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)、RPMI 1640培養(yǎng)基、(superoxide dismutase, SOD) 測試盒及(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，低密度脂蛋白(LDL)、葡萄糖和丁基羥基甲苯購自美國Sigma-Aldrich公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol 以及 RT-qPCR相關(guān)試劑PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒和SYBR?Premix Ex TagTM購自美國TaKaRa公司。PCR儀為ABI PRISM?7900HT。

1.2 方法

1.2.1 低密度脂蛋白的糖化 參考相關(guān)文獻中關(guān)于低密度脂蛋白的糖化方法[5-6]，在無菌條件下將葡萄糖與LDL在37℃條件下孵育4周，葡萄糖終濃度為50mmol/L，LDL終濃度為2mg/ml；同時加入EDTA和丁基羥基甲苯，終濃度分別為1mg/ml和10μm/L；得到的糖化LDL，透析后避光儲存。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與分組 HUVECs細胞用RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)并傳代鋪板。對照組(Ctr)僅加培養(yǎng)基，糖化LDL(gly-LDL)分三組，G1組加入0.06mg/L gly-LDL，G2組加入0.12mg/L gly-LDL，G3組加入0.24mg/L gly-LDL，每組三個復孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h。

1.2.3 內(nèi)皮細胞劃痕實驗 在六孔板底部用黑色記號筆平行畫三條線作為標記，每孔鋪約5×106個細胞，常規(guī)培養(yǎng)貼壁后用200μl槍頭在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS洗滌2次，加入含1%血清的培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下拍照，放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。之后分別于培養(yǎng)第24h、第48h、第72h拍照。

1.2.4 SOD活性和MDA含量測定 收集培養(yǎng)24h、48h和72h的細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說明書處理后，分別于波長550nm和532nm處測定吸光度(D值)，根據(jù)說明書中公式算得SOD的活力及MDA的含量。

1.2.5 Realtime quantitative PCR 選取Mn-SOD基因及eNOS基因做實時熒光半定量PCR，基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列為： GAPDH上游： 5′-GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′，GAPDH下游： 5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′； Mn-SOD上游： 5′-AGT TCA ATG GTG GTG GTC ATA-3′，Mn-SOD下游： 5′-CAA TCC CCA GCA GTG GAA TAA-3′；eNOS上游： 5′-CAG CCT CAC TCC TGT TTT CC-3′，eNOS下游： 5′-GGA TTG TCG CCT TCA CTC G-3′。選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參。RT-qPCR反應條件： 預變性95℃ 30s，PCR反應95℃ 10s，60℃ 34s，72℃ 10s，40個循環(huán)，延伸95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 15s。得到閾值周期(CT值)，用2-ΔΔCt法計算表達差異倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 細胞劃痕實驗結(jié)果

HUVECs加入不同濃度的gly-LDL后，分別于培養(yǎng)第24h、48h、72h拍照，對照組細胞幾乎遷移完全，而G1組、G2組和G3組的細胞遷移與對照組相比，在第48h和72h受到明顯的抑制，在第一個24h，G3組即最高濃度gly-LDL組的細胞遷移受到的抑制作用最明顯，見圖1。

圖1 HUVECs細胞劃痕圖Fig.1 Scarification test of HUVECs

2.2 SOD活性和MDA含量

收集培養(yǎng)24h、48h和72h的細胞培養(yǎng)上清液后，用ELISA的方法測定SOD和MDA的含量。其中，對照組的SOD活性在培養(yǎng)48h后出現(xiàn)一個高峰，培養(yǎng)72h后活性又降低。G1組和G3組的細胞上清液SOD活性隨時間呈上升趨勢，其中G1組相對較明顯。G2組細胞上清液的SOD活性隨時間呈現(xiàn)下降趨勢，但48h與72h差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SOD活性于48h與72h時G1、G3組與G2組組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。

對照組MDA含量與SOD活性變化情況相似，在48h出現(xiàn)高峰后72h下降。G1和G3組細胞上清液MDA含量隨時間呈上升曲線，G1組相對更明顯。G2組細胞上清液的MDA含量隨時間呈現(xiàn)上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但72h僅相對48h有微小的上升，差異沒有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MDA含量于24h、48h各組間差異沒有統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖2 細胞上清液中SOD活性變化情況Fig.2 SOD activity changes in cell supernatant

圖3 細胞上清液中MDA含量變化情況Fig.3 MDA content changes in cell supernatant

2.3 RT-qPCR結(jié)果

人臍靜脈內(nèi)皮細胞經(jīng)過gly-LDL處理分別培養(yǎng)24h、48h、72h后按常規(guī)方法提取總RNA，進行RT-qPCR測定Mn-SOD和eNOS的基因表達水平。結(jié)果提示，24h時各組Mn-SOD的表達與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，G1與G2組的eNOS明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，G3組與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。48h時各組Mn-SOD及eNOS的表達均較對照組下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義。72h時G1和G2組的Mn-SOD較對照組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義，G3與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義；各組的eNOS與對照組比均現(xiàn)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 各組Mn-SOD mRNA表達情況Fig.4 Relative expression of Mn-SOD mRNA

圖5 各組e-NOS mRNA表達情況Fig.5 Relative expression of e-NOS mRNA

3 討 論

糖尿病是一種嚴重危害人類健康的慢性疾病，血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機制目前并不十分清楚。已有研究證明gly-LDL與糖尿病血管病變有相關(guān)性[7]。具體機制尚未明確，本研究則從氧化應激的角度探討gly-LDL對血管內(nèi)皮細胞生長及代謝的影響。超氧化物歧化酶(SOD)是人體自生的一種氧自由基清除劑[8]。在血管內(nèi)皮保護和抗氧化應激方面起著重要作用[9]。目前，總SOD的直接相關(guān)基因未見明確報道，本研究選取測定Mn-SOD的mRNA表達情況。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一[10]，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此，在衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個常用指標，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度。eNOS(endothelial nitric oxide synthetase)即一氧化氮合成酶，它的表達與血管舒張因子一氧化氮(NO)的合成分泌密切相關(guān)，一定程度上提示了血管內(nèi)皮細胞的功能[11-12]。本研究通過細胞劃痕實驗觀察不同濃度gly-LDL對人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移功能的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的gly-LDL均能抑制細胞的遷移。測定細胞上清液中SOD活性及MDA含量，發(fā)現(xiàn)0.12mg/L的gly-LDL對內(nèi)皮細胞的SOD活性及MDA含量相對其他濃度gly-LDL的影響大，且作用48h后更明顯，主要是抑制SOD的活性，促進MDA的分泌。0.06mg/L的gly-LDL及0.24mg/L的gly-LDL對血管內(nèi)皮細胞SOD活性及Mn-SOD含量的影響相似，隨時間的變化均輕度升高SOD的活性及MDA的含量。從對照組來看，在未受到干擾的情況下，SOD活性和MDA的含量均于48h內(nèi)逐漸上升，后逐漸下降，細胞在受到gly-LDL的作用影響后這一節(jié)律被打亂。24h時各組間差異不大；第48h時SOD活性被抑制，MDA含量增加；第72h時G2組SOD活性及MDA含量均相對較低，但G1組的SOD活性及MDA含量均相對明顯的升高，提示可能較低濃度的gly-LDL能促進細胞發(fā)生過氧化反應，同時啟動自我保護機制促進SOD的激活；而相對更高濃度的gly-LDL在刺激血管內(nèi)皮細胞過氧化反應的同時抑制了SOD的活性。RT-qPCR的結(jié)果提示，24h時Mn-SOD基因的表達尚未有明顯的改變，于第48h和72h各gly-LDL組Mn-SOD均較對照組不同程度的下調(diào)。各組eNOS的表達于24h及48h時均是相對下調(diào)的，與gly-LDL的濃度無明顯相關(guān)性，但72h時相對對照組是明顯上調(diào)的，且隨gly-LDL濃度升高而升高，提示48h以內(nèi)gly-LDL可能是抑制內(nèi)皮細胞NO的生成的，對于血管的作用是不利的，而72h后，隨著細胞的自身調(diào)節(jié)機制啟動，激活NO相關(guān)促生成基因的表達，但最終NO的生成或釋放的多少仍需要進一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的gly-LDL可能在一定程度上是自我調(diào)節(jié)與自我保護的啟動因素之一，對人體本身是有益的，而較高濃度的gly-LDL可一定程度地影響人氣靜脈血管內(nèi)皮細胞的遷移，其機制可能是通過影響SOD的活性及生成來影響血管內(nèi)皮的功能，即提示高血脂的糖尿病患者可能是間接通過形成糖化低密度脂蛋白引起氧化應激而致使血管內(nèi)皮受損。然而隨著時間的推移，損傷作用可能逐漸減弱，保護作用逐漸增強。這一機制可能與CO2對呼吸的調(diào)節(jié)作用類似，即較低濃度的CO2可刺激呼吸，較高濃度的CO2可抑制呼吸，而處于較長時間的高濃度CO2狀態(tài)時，呼吸主要靠CO2來刺激，若立即糾正反而更易引起呼吸停止[13]，但這一推論的證實仍需要更進一步的研究。通過本研究得到結(jié)論，gly-LDL與糖尿病患者血管并發(fā)癥可能存在一定的相關(guān)性，但不能肯定其是惡化因素之一。

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Effect of glycated LDL on SOD activity and gene expression of human umbilical vein endothelial cells

ZHANGBing-yu1,ZENGRui-xiang1，SHUXiao-liang2,LEITao3

(1. Dept of Endocrine Tongji Hospital, Tongji University,Shanghai 200065, China; 2. Dept. of Nutriology, Jinshan Hospital of Fudan University, Shanghai 201500, China; 3. Dept. of Endocrinology, Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China)

Objective To investigate the effect of glycated low density lipoprotein(gly-LDL) on the growth and antioxidant related factors in endothelial cells, and investigate the correlation of gly-LDL with diabetes vascular endothelial injury and the possible mechanism. Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were treated with different concentrations(0.06mg/L, 0.12mg/L, 0.24mg/L) of gly-LDL for 24h, 48h and 72h. Superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) levels in the cell culture supernatant were detected. The migrate function of endothelial cells was assessed by scratch test. Mn-SOD and eNOS mRNA expressions were determined by real-time quantitative PCR(RT-qPCR). Results Gly-LDL at different concentrations inhibited the migrate function of endothelial cells. When HUVCCs treated with 0.06mg/L and 0.24mg/L gly-LDL, the activity of SOD and MDA were increased with the time; while treated with 0.12mg/L gly-LDL, the SOD activity was decreases with the time and MDA was decrease after initial increase. Mn-SOD mRNA expression level were down-regulated after 48h and 72h in all gly-LDL treated groups. The expression of eNOS levels in 24h and 48h were down-regulated, but up-regulated in 72h. Conclusion Glycated LDL can inhibit growth of endothelial cells and change the expression of antioxidant related factors, which may be associated with the pathogenesis of vascular complications in diabetic patients.

glycosylation; low density lipoprotein; HUVECs; superoxide dismutase; malondialdehyde

10.16118/j.1008-0392.2016.06.006

2016-06-28

國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2014AA022304)

張冰雨(1989—),女,碩士研究生.E-mail： zhangbingyu520@163.com

雷 濤.E-mail： leitao5899@126.com

R 587

A

1008-0392(2016)06-0029-06