王　磊，王　龍，薛華柏，李秀根，李　疆

（1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009）

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梨遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建與比較分析

王磊1,2，王龍2，薛華柏2，李秀根2，李疆1

（1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009）

摘要：【目的】利用已公開發(fā)表的梨和蘋果的 SSR（Simple Sequence Repeat）引物以及從梨轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR引物構(gòu)建本研究作圖群體的遺傳連鎖圖譜，為后期梨重要性狀QTL定位和分子標(biāo)記輔助選擇等奠定基礎(chǔ)。【方法】以西洋梨品種‘紅茄’（Red Clapp Favorite）為母本，東方梨品種‘晚秀’（Mansoo）為父本，構(gòu)建F1代作圖群體。將所選用的SSR引物在親本和4個子代個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步篩選出擴(kuò)增結(jié)果符合JoinMap 4.0軟件中“CP”作圖模式要求的引物，隨后在F1群體中檢測，選用JoinMap 4.0軟件對分離數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，分別構(gòu)建親本的連鎖圖譜。以雙親圖譜在各連鎖群上的同源標(biāo)記作為錨定位點(diǎn)，對雙親圖譜進(jìn)行整合?！窘Y(jié)果】利用PCR技術(shù)對不同來源的共909對SSR引物（526對梨和283對蘋果公開發(fā)表的SSR引物，從梨轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的100對SSR引物）進(jìn)行初步篩選后，發(fā)現(xiàn)來自蘋果的SSR引物有效擴(kuò)增片段的比例和多態(tài)性均較低，而來自梨和梨轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR引物相對較高。篩選出207對符合作圖要求的SSR引物在群體中擴(kuò)增，構(gòu)建親本的連鎖圖譜。母本圖譜中的141個標(biāo)記分布在17個連鎖群上，總長度757.34 cM，標(biāo)記間平均5.37 cM；父本圖譜中的153個標(biāo)記分布在19個連鎖群上，總長度1 149.43 cM，標(biāo)記間平均7.51 cM?！窘Y(jié)論】對不同來源的SSR引物構(gòu)建的雙親連鎖圖譜進(jìn)行整合，最終得到一張由186個SSR標(biāo)記，覆蓋基因組長度1 125.33 cM的整合圖譜。

關(guān)鍵詞：梨；SSR；連鎖圖譜；整合圖譜

聯(lián)系方式：王磊，Tel：18538710151；E-mail：ewlei@163.com。通信作者李秀根，Tel：13653825516；E-mail：lixiugen@caas.cn。通信作者李疆，Tel：13899823969；E-mail：lijiangxj@163.com

0 引言

【研究意義】梨屬于薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomoideae）梨屬（Pyrus）植物。目前梨的栽培面積和產(chǎn)量在國內(nèi)果樹生產(chǎn)中均居第三位，在世界梨的栽培面積和產(chǎn)量中位居首位［1］。由于梨的童期較長，基因組雜合度較高，多數(shù)重要農(nóng)藝性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，而常規(guī)育種方法效率低，需要大量的雜交群體，占用大面積的土地且耗費(fèi)較多的人力和財(cái)力。分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)（molecular marker assisted selection，MAS）可在苗期對雜種群體進(jìn)行提前篩選，選取具有優(yōu)良性狀的植株進(jìn)行培育，這樣能大量節(jié)省土地面積、人力和財(cái)力，從而提高育種效率，而高質(zhì)量遺傳圖譜的構(gòu)建又是分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)。因此，構(gòu)建梨遺傳圖譜具用重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】分子標(biāo)記在梨的研究中起步相對較晚，但經(jīng)過近些年來的努力，取得了很大進(jìn)步。目前已有一些梨連鎖圖譜被構(gòu)建，主要使用RAPD、AFLP、SSR和SNP等幾種分子標(biāo)記［1］。IKETANI等［2］利用RAPD標(biāo)記，以‘Kinchaku’和‘幸水’雜交的82株F1群體為研究對象，分別構(gòu)建了親本的連鎖圖譜，‘Kinchaku’圖譜的120個標(biāo)記位點(diǎn)分布在18個連鎖群，總長度為768 cM，‘幸水’圖譜的78個標(biāo)記位點(diǎn)分布在22個連鎖群，總長度508 cM，這也是分子標(biāo)記首次應(yīng)用于梨的連鎖圖譜構(gòu)建。YAMAMOTO等［3］從基因組文庫開發(fā)SSR引物，參考薔薇科不同屬的SSR引物和AFLP標(biāo)記結(jié)合，以歐洲的‘巴梨’為母本與日本的‘豐水’為父本雜交獲得的63株F1為作圖群體，在母本圖譜中的226個標(biāo)記位點(diǎn)（49個SSR標(biāo)記）分布在18個連鎖群，總長度949 cM；父本圖譜的154個標(biāo)記位點(diǎn)（42個SSR標(biāo)記）分布在17個連鎖群，總的遺傳距離926 cM。YAMAMOTO等［4］對‘巴梨’和‘La France’圖譜進(jìn)行了加密整合，分別定位了447個和414個標(biāo)記（SSR標(biāo)記分別為118和134個），都分布在17個連鎖群上，使其總長度達(dá)到了1 000 cM和1 156 cM，平均遺傳距離2.3 cM和2.8 cM，使得連鎖群的長度和平均遺傳距離都得到了很大的提升。TERAKAMI等［5］用SSR和AFLP標(biāo)記，以‘巴梨’與‘豐水’的63個F1代雜交群體來構(gòu)建‘豐水’的連鎖圖譜，335個標(biāo)記（105個SSR）分布在17個連鎖群，總長度1 174 cM，平均3.5 cM。YAMAMOTO等［6］參考大量梨和蘋果的公共SSR引物，用‘Akiakari’和‘Taihaku’雜交得到的93株F1為作圖群體來構(gòu)建連鎖圖譜，父本和母本兩張圖譜的SSR標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)分別為208個和275個，都分布在17個連鎖群，總的遺傳距離分別為799 cM和1 039 cM。TERAKAMI等［7］以‘巴梨’和‘豐水’雜交的63株F1代為作圖群體，基于大規(guī)模的EST數(shù)據(jù)和基因組測序數(shù)據(jù)開發(fā)的SNP標(biāo)記和SSR標(biāo)記構(gòu)建了‘豐水’的連鎖圖譜，951個標(biāo)記位點(diǎn)（609個SNP，110個梨SSR，127個蘋果SSR）分布在22個連鎖群，遺傳總長度1 341.9 cM，平均遺傳距離 1.41 cM。中國在梨圖譜構(gòu)建研究起步相對較晚，但近年來也取得了不少的成績。張麗等［8］以‘早美酥’和‘紅香酥’雜交的129株F1代為作圖群體，用AFLP分子標(biāo)記構(gòu)建了中國第一張梨的遺傳連鎖圖譜，該圖譜包括 20個連鎖群，定位了 67個AFLP標(biāo)記，遺傳距離為785 cM，標(biāo)記間平均間距為11.7 cM。孫文英等［9］用AFLP和SSR分子標(biāo)記對‘鴨梨’和‘京白梨’雜交的145株F1群體構(gòu)建了一張由368個AFLP標(biāo)記和34個SSR標(biāo)記分布在18個連鎖群的連鎖圖譜，圖譜總長度1 395.9 cM，平均圖距為3.8 cM。韓明麗等［10］利用‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交得到的91株F1為作圖群體，構(gòu)建了一個含有182個標(biāo)記（61個蘋果EST-SSR標(biāo)記、68個蘋果SSR標(biāo)記、49個梨SSR標(biāo)記）分屬于19個連鎖群的圖譜，圖譜總長度982 cM，各標(biāo)記間平均5.4 cM。WU等［11］以‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交的102個F1代為作圖群體，利用‘碭山酥梨’的全基因組數(shù)據(jù)開發(fā)的SNP結(jié)合SSR標(biāo)記，構(gòu)建了一張包括3 241個標(biāo)記（3 143 SNP，98 SSRs）分布于17個連鎖群上，圖譜總長2 243.4 cM，平均圖距0.70 cM，這也是目前圖譜長度最長，密度最高的梨的連鎖圖譜。CHEN等［12］以‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交的56個F1代為作圖群體，基于‘碭山酥梨’全基因組序列新開發(fā)的SSR引物及參考其他梨和蘋果公共SSR引物來構(gòu)建高密度連鎖圖譜，圖譜共有734個SSR標(biāo)記分布在17個連鎖群上，覆蓋基因組長度 1 661.4 cM，標(biāo)記間平均間距 2.26 cM，這是迄今含有 SSR數(shù)量最多的梨分子遺傳連鎖圖譜?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】SSR標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、分布于整個基因組、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建中發(fā)揮著重要的作用，也是近年來使用較多的分子標(biāo)記之一。目前已構(gòu)建的梨連鎖圖譜中大量使用SSR標(biāo)記的相對較少，群體數(shù)量普遍偏小，這對梨的高質(zhì)量圖譜及公共圖譜建立造成了一定影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將不同來源的SSR引物引入到本研究群體中，篩選出符合本群體作圖要求的SSR引物，構(gòu)建親本標(biāo)記類型全部由SSR引物組成的連鎖圖譜，為后期梨重要性狀QTL定位和分子標(biāo)記輔助選擇等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2014年10月至2015年10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所農(nóng)業(yè)部果樹育種技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 作圖群體構(gòu)建

以早熟紅皮的西洋梨品種‘紅茄’為母本，晚熟褐皮的東方梨品種‘晚秀’為父本雜交得到的165株F1代為作圖群體（圖1），該作圖群體于2009年進(jìn)行雜交和種子的收集，經(jīng)沙藏處理，2010年播種，于2011年種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所新鄉(xiāng)基地，共計(jì)167株，長勢較好。

圖1　作圖群體親本果實(shí)Fig. 1 Parents fruit of mapping population

1.2 DNA提取

2015年4月上旬采集親本與165株F1雜交群體的幼嫩葉片，利用改良的CTAB法提取植株總DNA［13］，于1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測，采用紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度，稀釋至50 ng·μL-1，儲存于-20℃冰箱備用。

1.3 SSR引物選擇與檢測

本研究共選用909對SSR引物，其中來自蘋果公開發(fā)表的283對［14-17］，梨公開發(fā)表的526對［3，12，18-23］，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的100對，均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

20 μL PCR反應(yīng)體系：10×Buffer（Mg2+plus）2 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 1.6 μL，10 mmol·L-1引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶為0.5 U，模板DNA 50 ng。PCR擴(kuò)增在Biometra TProfessional Thermocycler上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 S，Tm±2℃ 30 S，72℃ 45 S，30個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用 8％非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳分離，硝酸銀染色檢測并拍照統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析及圖譜構(gòu)建

基于HEMMAT等［24］和WEEDEN等［25］提出的“雙假測交”理論，將 F1群體的各個標(biāo)記分離類型按照J(rèn)oinMap4.0軟件中的“CP”作圖模式（lm×ll、nn×np、hk×hk、ef×eg、ab×cd等5種分離類型）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，無或擴(kuò)增不清晰的標(biāo)記記為“-”。將所有符合作圖要求的標(biāo)記數(shù)據(jù)導(dǎo)入到JoinMap4.0軟件中，建立雙親圖譜數(shù)據(jù)集，然后分別對雙親圖譜數(shù)據(jù)集進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，暫時先去除偏分離標(biāo)記（P＜0.05），選取 LOD=4.0 —10.0，最大重組率r=0.4，以Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，偏分離的標(biāo)記逐一插入到圖譜中，不改變其他標(biāo)記的位置關(guān)系，否則去除，用MapChart 2.3軟件繪制最終的連鎖圖譜。

1.5 雙親圖譜的比較與整合

根據(jù)親本各連鎖群上的同源標(biāo)記，利用MapChart2.3軟件繪制雙親的比較圖譜，對雙親圖譜進(jìn)行比較分析。以雙親圖譜在各連鎖群上的同源標(biāo)記作為錨定位點(diǎn)，分別選擇雙親圖譜中同源標(biāo)記所在的連鎖群，通過JoinMap 4.0軟件中“Combine Groups for Map Integration”功能，對雙親圖譜含有相同標(biāo)記的連鎖群進(jìn)行整合，最終構(gòu)建一張整合圖譜。

2 結(jié)果

2.1 SSR引物篩選

以雙親和隨機(jī)4個F1單株對所選用的909對SSR引物（表 1）進(jìn)行篩選，其中來自梨公開發(fā)表的 526 對 SSR引物中，469對（占此種來源 SSR引物的89.16％，下同）有擴(kuò)增產(chǎn)物，378對（71.86％）引物在親本間具有多態(tài)性；來自蘋果公開發(fā)表的283對SSR引物中，166對（58.66％）有擴(kuò)增產(chǎn)物，116對（40.99％）引物在親本間具有多態(tài)性；來自轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的100對SSR引物中，88對（88％）有擴(kuò)增產(chǎn)物，59對（59％）引物在親本間具有多態(tài)性。最終篩選出207對符合本研究群體作圖要求的SSR引物，其中梨公共SSR引物133對（25.29％），蘋果公共SSR引物43對（15.19％），轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR引物31對（31.00％）。從以上結(jié)果可以看出，來自梨的SSR引物有效擴(kuò)增片段的比例均較高，從對親本的多態(tài)性方面來看，來自梨公開發(fā)表的SSR引物相比從轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR引物多態(tài)性高；從來自蘋果的SSR引物擴(kuò)增結(jié)果可以看出，來源于蘋果的SSR引物在梨的研究中有一定的通用性。

表1　引物擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Amplification results of primer

2.2 遺傳圖譜的構(gòu)建

從909對SSR引物中篩選得到207對符合作圖要求的SSR引物，在165株F1群體中進(jìn)行驗(yàn)證（圖2），用JoinMap4.0軟件對群體數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建雙親的連鎖圖譜：‘紅茄’圖譜的141個標(biāo)記位點(diǎn)分布在17個連鎖群，總長度757.34 cM，標(biāo)記間平均5.37 cM，連鎖群長度在18.80—63.29 cM，每個連鎖群上有4—16個標(biāo)記；‘晚秀’圖譜的153個標(biāo)記位點(diǎn)分布在19個連鎖群，總長度1 149.43 cM，標(biāo)記間平均7.51 cM，連鎖群長度在5.67—119.41 cM，每個連鎖群上有3—17個標(biāo)記。對雙親連鎖圖譜參照CHEN等［12］所構(gòu)建的梨連鎖圖譜的連鎖群順序進(jìn)行調(diào)整，將母本和父本的各連鎖群分別命名為R1—R17和M1—M17（圖3）。

圖2　不同類型SSR標(biāo)記在F1部分群體擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Amplification results of different types of SSR marker in part F1group

研究中還發(fā)現(xiàn)有部分標(biāo)記發(fā)生了偏分離（P＜0.05），在母本圖譜的141個標(biāo)記中有4個標(biāo)記（2.8％）發(fā)生了偏分離，父本圖譜的153個標(biāo)記中有10個發(fā)生了偏分離（6.5％）。從這些偏分離的標(biāo)記分布位置來看，大多數(shù)分布較為集中，少量分散在不同的連鎖群。

圖3　雙親遺傳連鎖圖譜及同源位點(diǎn)比較Fig. 3 Parental genetic maps and distribution of homologous loci

2.3 雙親圖譜的比較分析

根據(jù)雙親圖譜上98個同源標(biāo)記位點(diǎn)，建立各連鎖群間的同源關(guān)系（表2），父本的19個連鎖群和母本的17個連鎖群對應(yīng)，父本的M4-1和M4-2和母本的R4對應(yīng)，父本的M17-1和M17-2和母本的R17對應(yīng)。在雙親圖譜中，所有的連鎖群都有對應(yīng)的同源標(biāo)記，位于第14連鎖群的同源標(biāo)記位點(diǎn)最多（13個），位于第11連鎖群的同源標(biāo)記位點(diǎn)最少（2個），平均每個連鎖群上有5.8個同源標(biāo)記。通過對兩親本連鎖圖譜的比較發(fā)現(xiàn)（表2、圖3），父本圖譜的標(biāo)記數(shù)量比母本稍多，但其圖譜長度約是母本圖譜長度的1.5倍。從各連鎖群的長度來看，父本圖譜的大多數(shù)連鎖群長度均比母本連鎖群長，在第10、11、15連鎖群父本的連鎖群長度約是母本連鎖群長度的2—3倍。通過同源標(biāo)記的排列順序來看，第7、8、10、13和14連鎖群中有少量的同源標(biāo)記有交叉現(xiàn)象，其他大部分的同源標(biāo)記在連鎖群上的排列順序一致。

表2　圖譜同源連鎖群比較Table 2 An alignment of homologous linkage group of parental genetic maps

圖4　整合圖譜Fig. 4 Integrated of genetic map

2.4 圖譜整合

利用同源標(biāo)記作為錨定位點(diǎn)，對親本的圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，最終整合的圖譜有17個連鎖群（圖4），與梨染色體數(shù)目一致（2n=34），共 186個標(biāo)記，其中基于轉(zhuǎn)錄組新開發(fā)的30個SSR標(biāo)記（表3）。來自母本圖譜特有的標(biāo)記41個，來自父本圖譜特有的標(biāo)記51個，來自雙親圖譜共有的標(biāo)記92個，整合圖譜特有的標(biāo)記2個。圖譜覆蓋基因組長度1 125.33 cM，相鄰標(biāo)記間最大間距34.78 cM，最小的在0.1 cM以內(nèi)，標(biāo)記間平均距離6.05 cM，連鎖群長度在28.20—105.45 cM。

表3　新開發(fā)的SSR標(biāo)記Table 3 Newly developed SSR loci

3 討論

3.1 雜交親本的選擇

梨在全世界分布約 30多個種，大多數(shù)自交不親和，種間親緣關(guān)系較為復(fù)雜，梨的起源演化認(rèn)為梨主要分為東方梨和西洋梨兩大系統(tǒng)。近年來，曹玉芬等［26］和路娟等［27］通過 SSR分子標(biāo)記技術(shù)對分別屬于白梨、砂梨、秋子梨、新疆梨、西洋梨等41份梨品種和150份梨品種進(jìn)行遺傳多樣性研究分析，表明西洋梨和東方梨的遺傳距離較遠(yuǎn)。這與江先莆等［28］通過形態(tài)特征研究的結(jié)果一致。

從構(gòu)建連鎖圖譜的角度來看，雜交親本的選擇至關(guān)重要，將直接影響到所構(gòu)建圖譜的難易程度和適用范圍［29］。在考慮雜交后代可育的前提條件下，為了得到更多的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，一般選擇親緣關(guān)系遠(yuǎn)、表型差異較大的材料做雜交親本。西洋梨與東方梨之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，DNA水平差異較大，多態(tài)性豐富，更適合用于構(gòu)建作圖群體的親本［30］。目前已構(gòu)建的梨作圖群體大都集中在西洋梨之間或者東方梨之間，而西洋梨和東方梨之間雜交的作圖群體研究目前較少，主要有日本研究者所使用的‘巴梨’ב豐水’雜交群體［3-5，7］，中國所使用的‘八月紅’ב碭山酥梨’雜交群體［10-12］?！嗽录t’是西洋梨‘早巴梨’和‘早酥’的后代，‘早酥’是東方梨‘蘋果梨’和‘身不知’的后代，路娟等［27］通過對梨品種遺傳多樣性的研究認(rèn)為‘早酥’屬于東方梨，‘八月紅’和‘身不知’都屬于西洋梨。

本研究所選用的親本組合是西洋梨‘紅茄’×東方梨‘晚秀’，‘紅茄’來源于美國，是茄梨的芽變品種，果型較?。ㄆ骄鶈喂?50 g），紫紅色果皮，較早熟（七月上旬），肉質(zhì)細(xì)膩，有香氣，風(fēng)味濃郁，后熟變軟，具有典型西洋梨特性；父本‘晚秀’是韓國梨品種，果型較大（平均單果重500 g），褐皮，較晚成熟（十月中旬），具有典型的東方梨特性。這兩個品種無論從地理分布還是果實(shí)的形態(tài)特征有著較大的差異，是一對較適合作圖的親本材料。同時以西洋梨與東方梨作為雜交親本，對后期研究西洋梨和東方梨的起源和演化等方面也有著重要的意義。

3.2 不同來源SSR引物擴(kuò)增差異

從前人研究的結(jié)果來看，來源于蘋果的SSR引物在梨研究中也有著較好的應(yīng)用。YAMAMOTO等［3］首次將來源于薔薇科蘋果、桃和櫻桃的SSR標(biāo)記引入梨的研究，發(fā)現(xiàn)蘋果SSR引物在梨上的可轉(zhuǎn)移性明顯高于桃和櫻桃。此后很多研究者都在梨的研究中引用蘋果SSR引物［4，6，10，12］。本研究中，來源于蘋果的SSR引物在親本間有擴(kuò)增產(chǎn)物與表現(xiàn)多態(tài)性的比例分別為58.66％和40.99％，這與陳慧等［31］獲得的71.6％和40％的結(jié)果基本一致；劉金義等［32］通過對大量蘋果SSR引物的篩選，發(fā)現(xiàn)約60％的引物在梨上都有擴(kuò)增片段。蘋果和梨都屬于薔薇科，親緣關(guān)系較近，關(guān)玲等［33］將從蘋果基因組開發(fā)的 SSR引物應(yīng)用在梨的研究中，其結(jié)果也證明了SSR標(biāo)記在近緣物種中具有良好的轉(zhuǎn)移性。

近年來隨著測序技術(shù)的發(fā)展及測序成本的降低，大量通過EST序列和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR引物被應(yīng)用到植物的遺傳研究中。王西成等［34］利用NCBI收錄的梨EST數(shù)據(jù)開發(fā)的48對SSR引物對4個梨品種進(jìn)行擴(kuò)增，64.6％具有擴(kuò)增產(chǎn)物，56.3％具有多態(tài)性；崔海榮等［35］利用GenBank和GDR（genome database for rosaceae）中梨EST數(shù)據(jù)開發(fā)的25對SSR引物對雜交群體親本進(jìn)行遺傳分析，其中56％有擴(kuò)增片段，36％具有多態(tài)性；筆者課題組通過梨轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR引物，在親本間有擴(kuò)增產(chǎn)物與多態(tài)性的比例分別為88％和59％?？梢?，不同研究者所獲得的結(jié)果差異較大，SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物比例差異可能來源于引物本身，無擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR引物可能是被內(nèi)含子分割，導(dǎo)致其在基因組模板上沒有結(jié)合位點(diǎn)；而多態(tài)性引物比例差異可能主要與各研究者所采用的試驗(yàn)材料遺傳背景差異有關(guān)，不同來源的試驗(yàn)材料遺傳背景不同，一般遺傳背景越遠(yuǎn)，差異越大，多態(tài)性越高［36］。當(dāng)然，以上差異還可能與研究者對數(shù)據(jù)處理分析的差異等有關(guān)。

在本研究的結(jié)果中，來自梨和蘋果公開發(fā)表的SSR引物中符合作圖要求的引物占多態(tài)性引物數(shù)量的1/3，來源于轉(zhuǎn)錄組的 SSR引物中符合作圖要求的占其多態(tài)性引物數(shù)量的1/2，這比大多數(shù)研究者最終定位到圖譜中的SSR標(biāo)記占多態(tài)性引物數(shù)量70—80％［12，31］的比例偏低，這可能與雙親間純合位點(diǎn)和零位點(diǎn)（null allele）的SSR引物占多態(tài)性引物比例較高有關(guān)。在引物的篩選時，為避免人為原因造成的無擴(kuò)增片段而引起統(tǒng)計(jì)誤差，本研究去除了在雙親中都含有零位點(diǎn)的標(biāo)記［37］；同時，部分引物在雙親間多態(tài)性較好，但都是純合位點(diǎn)，其后代群體基因型完全相同，無法用于構(gòu)圖。此外，部分SSR引物的非特異性擴(kuò)增片段較多，干擾帶的存在增加了對相應(yīng)標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)判讀的準(zhǔn)確性，為避免帶型統(tǒng)計(jì)錯誤，對這部分SSR引物也予以舍棄，這也是符合作圖標(biāo)記數(shù)量偏少的原因之一。

3.3 標(biāo)記的偏分離情況

偏分離在遺傳連鎖作圖中是普遍存在的，蘋果［38］、桃［39］、葡萄［40］、櫻桃［41］等多種植物都存在一定比例的偏分離，一般偏分離通過影響標(biāo)記間的重組距離而影響到連鎖群上標(biāo)記的排列順序［42-43］，也有研究者認(rèn)為它可以促進(jìn)生物進(jìn)化［44］。

在本研究構(gòu)建的雙親連鎖圖譜中，當(dāng)P＜0.05時，偏分離的標(biāo)記在母本和父本圖譜所占的比例分別為2.8％和6.5％，與目前已報(bào)道的研究中偏分離比率10％ —30％［4，7，9］相比較低。從本研究的情況來看，造成偏分離比率較低可能與作圖群體數(shù)量較大有關(guān)。理論上適當(dāng)增大作圖的群體數(shù)量，可以降低偏分離位點(diǎn)出現(xiàn)的概率，從而減少試驗(yàn)的誤差。由于梨的作圖群體構(gòu)建難度較大，目前已構(gòu)建的圖譜中大多作圖群體都小于150株，而適當(dāng)?shù)奶岣咦鲌D群體數(shù)量可以提高作圖的精度，研究表明150—200株的作圖群體更為適合［1］。偏分離的形成原因比較復(fù)雜，也可能與所選標(biāo)記在染色體的位置或者作圖親本有關(guān)。

3.4 整合圖譜的比較

BD1—BD 17為CHEN等2014年構(gòu)建的17個連鎖群，RM1—RM17為本研究構(gòu)建的雙親圖譜的整合，其上的標(biāo)記均為公開發(fā)表的SSR標(biāo)記BD1 to BD17 are 17 linkage groups of Chen's genetic linkage map published in 2014. RM1—RM17 are 17 linkage groups of constructing integrated genetic linkage map in this research. All SSR markers on linkage groups have been published圖5　雙親整合圖譜與梨已發(fā)表圖譜比較［12］Fig. 5 Comparison of integrated genetic map of pear and the map published by Chen et al.［12］

通過與CHEN等［12］構(gòu)建的梨高密度SSR圖譜進(jìn)行比較（圖5），兩張連鎖圖譜有126個相同標(biāo)記，其中121個SSR標(biāo)記定位到相同的連鎖群，部分標(biāo)記在連鎖群上排列順序有所差異，存在交叉現(xiàn)象。這可能與標(biāo)記偏分離現(xiàn)象有一定關(guān)系，LORIEUX等［42-43］通過對偏分離數(shù)據(jù)的模型分析證明了偏分離標(biāo)記不僅影響標(biāo)記間的重組距離，也影響到連鎖群上標(biāo)記的排列排列順序。在本研究作圖過程中，也發(fā)現(xiàn)有個別的偏分離標(biāo)記（NAUpy59t和 ZFRIt051）能夠改變其他標(biāo)記的排列順序。不同作圖群體親本遺傳背景的不同也是導(dǎo)致標(biāo)記順序差異的重要原因之一，路娟等［27］通過25對SSR引物在150份梨品種進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)來自東亞的種和品種與西方梨的相似系數(shù)較低，各自獨(dú)立成組，而東亞的大部分品種之間相似系數(shù)較高，相互交錯在一起。本研究所使用的母本材料是西洋梨‘紅茄梨’，父本是東方梨‘晚秀’，雙親間遺傳背景差異較大。而在CHEN等［12］構(gòu)建的圖譜所使用的母本是‘八月紅’（‘早巴梨’和‘早酥梨’的后代）兼具西洋梨和東方梨的血統(tǒng)，父本是‘碭山酥梨’，雙親間的差異相對比本研究的偏小。此外，不同研究者所使用的作圖軟件和參數(shù)的設(shè)置等差異也可能導(dǎo)致標(biāo)記在連鎖群上的排列順序發(fā)生變化。

大量來自梨或蘋果的 SSR引物在研究中互相使用，為兩者遺傳圖譜比較以及比較基因組學(xué)等研究奠定了基礎(chǔ)。LU等［45］和PIERANTONI等［46］通過比較梨和蘋果的遺傳連鎖圖譜，均發(fā)現(xiàn)共有標(biāo)記在兩者的連鎖群中所處的位置基本相同，呈現(xiàn)出較好的共線性。本研究最終整合的圖譜中有38對SSR引物來自蘋果，分布在除RM1和RM13外的其余15條連鎖群上，每個連鎖群1—7個標(biāo)記位點(diǎn)，通過與蘋果等圖譜［15，47-49］比較，大部分標(biāo)記位點(diǎn)均與上述的蘋果連鎖圖譜一致，兩個及以上同源標(biāo)記所在連鎖群的遺傳距離差異較小，這也表明了梨和蘋果作為2個不同的物種，基因組間的相似度較高。

通過圖譜的比較還發(fā)現(xiàn)，部分標(biāo)記所在的連鎖群與前人研究結(jié)果不一致。NAUpy58f、NAUpy57d、NAUpy51w、NAUpy81a和NAUpy35w等5個SSR位點(diǎn)在CHEN等［12］構(gòu)建的梨遺傳圖譜中分別位于BD2、BD3、BD14、BD16和BD17連鎖群，而在本研究中這5個標(biāo)記分別位于RM7、RM16、RM17、RM13和RM6連鎖群。在KUNIHISA等［49］構(gòu)建蘋果遺傳圖譜的研究中，Hi03a03位點(diǎn)都被定位到雙親‘Orin’和‘Akane’遺傳圖譜的LG6連鎖群，但本研究中其被定位在RM14連鎖群。這可能是由于基因型統(tǒng)計(jì)誤差造成的，也可能是生物在進(jìn)化過程中染色體部分區(qū)域發(fā)生了交換或者易位等原因而導(dǎo)致［46］。

4 結(jié)論

利用不同來源的SSR引物分別構(gòu)建了梨雙親的連鎖圖譜，標(biāo)記數(shù)量分別為141和153個，圖譜總長度分別為757.34 cM和1 149.43 cM，標(biāo)記間的平均距離分別是5.37 cM和7.51 cM；將雙親的圖譜進(jìn)行整合，最終得到的整合圖譜共有186個SSR標(biāo)記分布在17個連鎖群上，覆蓋基因組長度1 125.33 cM，標(biāo)記間平均距離6.05 cM。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Construction of SSR Genetic Linkage Map and Comparison on Pears

WANG Lei1，2， WANG Long2， XUE Hua-bai2， LI Xiu-gen2， LI Jiang1
（1College of Horticulture & Forestry Sciences， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052；2Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009）

Abstract：【Objective】The genetic linkage map was constructed based on the Simple Sequence Repeat primers of pears and apples that have been published and developed from the transcriptome of pears by our team， which will be the foundation for the important trait mapping of QTL and marker-assisted selection in the future.【Method】A F1mapping population was built on a cross between a western pear （Red Clapp Favorite） as the female parent， and an oriental pear （Mansoo） as the male parent. The SSR primers which matched the "CP" mode in the JoinMap 4.0 software in parents and four individuals by PCR application were selected and then tested in the F1group. The separation of data was analyzed by JoinMap 4.0 software， and the parent genetic map was constructed respectively. The genetic map of the parents was integrated based on anchor points which were homology marks in the parents' map on each linkages.【Result】909 pairs of SSR primers from different sources （526 pairs from pears and 283 pairs from apples that have been published， and 100 pairs were developed from the pear transcriptome by our team） was preliminarily screened through a PCR technique. The results showed that amplified fragments and polymorphism of SSR primers from apples were lower，but that the SSR primers from pears and developed through the transcriptome of pears were higher. The parents' genetic linkage mapwas constructed based on the 207 pairs of SSR primers which conformed to the drawing. A female genetic map was constructed by 141 markers which was distributed on 17 linkage groups and spanned 757.34 cM in genome with an average distance of 5.37 cM between markers； A male genetic map was constructed by 153 markers which was distributed on 19 linkage groups and spanned 1 149.43 cM in genome with an average distance of 7.51 cM between markers.【Conclusion】The integrated genetic linkage maps of parents were constructed by different sources of SSR molecular markers， which contained 186 SSR markers and finally covered the genome 1 125.33 cM.

Key words：pear； SSR； genetic linkage map； integrated the genetic map

收稿日期：2015-12-28；接受日期：2016-03-25

基金項(xiàng)目：國家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2013BAD02B01）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP）