童普國，歐陽解秀，閻　新，李紹波，廖鵬飛

(南昌大學生命科學學院/江西省分子生物學與基因工程重點試驗室，江西 南昌 330031)

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1個組培特性優(yōu)良的秈稻品種的發(fā)現及其農桿菌轉化體系的建立

童普國，歐陽解秀，閻新，李紹波，廖鵬飛*

(南昌大學生命科學學院/江西省分子生物學與基因工程重點試驗室，江西 南昌 330031)

摘 要：對生產上廣泛應用的4個優(yōu)質秈型雜交水稻保持系中9B、金23B、Ⅱ–32B和川香29B，2個恢復系9311和明恢63的組培特性進行系統(tǒng)研究，發(fā)現川香29B愈傷組織的誘導率、繼代培養(yǎng)增殖率、耐繼代能力及分化再生能力均高于其他秈稻品種，其愈傷誘導率和分化再生率分別為96％和82％，說明川香29B是1個具有優(yōu)良組培特性的秈稻品種；進一步對川香29B的農桿菌遺傳轉化體系進行優(yōu)化，并初步建立了川香29B穩(wěn)定的農桿菌介導的轉化體系，即農桿菌EHA105菌液濃度OD600 nm為0.1，浸染液AAM中乙酰丁香酮濃度為200 μmol/L，浸染時間30 min, 黑暗條件下共培養(yǎng)72 h，共培養(yǎng)溫度為19 ℃，抗性植株轉化率為19.6％。

關 鍵 詞：秈稻；植物組織培養(yǎng)；川香29B；遺傳轉化；農桿菌

投稿網址：http://xb.ijournal.cn

農桿菌介導的遺傳轉化體系由于操作簡單、T–DNA插入到基因組時拷貝數低、可以轉化大片段DNA等優(yōu)點，已成為基因遺傳轉化的常規(guī)手段，廣泛應用于水稻基因功能研究和分子育種中[1–3]。水稻的胚性愈傷組織是農桿菌遺傳轉化的良好受體，水稻組培特性的好壞將直接決定農桿菌介導外源基因遺傳轉化能否成功。秈稻和粳稻是栽培稻的2個亞種，大多數粳稻品種組培特性較好，愈傷組織誘導容易，增殖速度快，耐繼代培養(yǎng)能力強，分化再生率高。許多粳稻品種已經建立成熟的組培體系和遺傳轉化體系[4–5]。而栽培面積廣的大多數秈稻品種具有不良的組培特性，表現為愈傷組織誘導率和再生率低，后續(xù)繼代培養(yǎng)中容易褐化，使得秈稻遺傳轉化效率低，有的品種甚至難以進行轉化。目前，雖然少數秈稻品種已經建立穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系和轉化體系[1,6–7]，但由于不同秈稻品種之間組培特性差別較大[8–9]，不能適用于大多數秈稻品種。高效、適用性廣泛的秈稻組織培養(yǎng)體系和轉化體系尚未建立[10]，極大地阻礙了秈稻基因功能研究和基因的利用，因此，開展秈稻組織培養(yǎng)體系優(yōu)化和篩選組培特性較好的秈稻品種作為轉基因模式受體材料具有重要意義。

本研究在開展廣泛應用的優(yōu)質雜交秈稻親本的組織培養(yǎng)的過程中，發(fā)現1個組培特性優(yōu)良的秈稻品種——川香29B，其愈傷組織誘導率，耐繼代培養(yǎng)能力和分化率都較高，并對其農桿菌遺傳轉化體系進行優(yōu)化，初步建立了農桿菌介導川香29B穩(wěn)定的轉基因體系，旨在為今后開展秈稻基因功能研究和分子育種提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

秈型雜交水稻保持系中 9B、金 23B、Ⅱ–32B和川香29B，恢復系9311和明恢63。以上水稻品種的種子均由南昌大學江西省分子生物學與基因工程重點實驗室提供。

農桿菌EHA105由南昌大學江西省分子生物學與基因工程重點實驗室提供；植物表達載體 PRIT1(如圖1所示)由日本岡山大學Terada博士饋贈。

圖1　植物表達載體PRIT1Fig.1 The T–DNA structures of the binary vectors PRIT1

主要試劑：常規(guī)化學試劑(分析純)購買于國藥集團化學試劑有限公司；2,4–D，6–BA，KT等植物激素及Phytagel購買于Sigma公司；潮霉素B購買于Roche公司；Taq DNA聚合酶和D2000 Marker購買于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 秈稻愈傷組織的誘導、繼代與分化培養(yǎng)

1) 愈傷組織誘導。設MS、N6、NB(由N6大量元素，B5微量元素及維生素組成)和NMB(由N6大量元素，MS微量元素和B5維生素組成)4種基本培養(yǎng)基，每種基本培養(yǎng)基添加2,4–D、L–proline、Glutamine、水解酪蛋白、肌醇、蔗糖和Phytagel，使添加物的終濃度分別為 3.0 mg/L、0.5 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.1g/L、30 g/L、3.0 g/L，調節(jié)pH為5.9。中9B、金23B、Ⅱ–32B、川香29B、9311和明恢63每個品種每種培養(yǎng)基接種50粒種子。每種處理重復3次。操作如下：將脫殼、滅菌處理的種子接于愈傷誘導培養(yǎng)基上，放入人工氣候室中，26 ℃暗培養(yǎng)，1個月后，觀察愈傷組織的狀態(tài)，計算誘導率。愈傷誘導率為產生愈傷組織的種胚數與接種種胚數的百分比。

2) 愈傷組織繼代培養(yǎng)。將上述誘導出來的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基(NMB基本培養(yǎng)基+3.0 mg/L 2,4–D + 0.5 g/L L–proline +0.5 g/L Glutamine +0.8 g/L水解酪蛋白+0.1 g/L肌醇+30 g/L麥芽糖+3.0 g/L Phytagel)上進行培養(yǎng)，調節(jié)pH為 5.9。在人工氣候室中26 ℃暗條件下，連續(xù)繼代培養(yǎng)4次，每次20 d。試驗重復3次。觀察生長狀態(tài)并統(tǒng)計每次繼代后愈傷組織的增殖倍數。愈傷增殖倍數為繼代培養(yǎng)后的狀態(tài)良好的愈傷質量與接種的愈傷質量之差再與接種的愈傷質量之比。

3) 幼苗分化培養(yǎng)。將繼代2次、狀態(tài)良好的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+2.0 mg/L 6–BA +1.0 mg/L KT +0.5 mg/L NAA +20 g/L山梨醇+10 g/L蔗糖+0.6 g/L水解酪蛋白+3.0 g/L Phytagel) 上，調節(jié)培養(yǎng)基pH 6.0，試驗重復3次。在人工氣候室中26 ℃下光照培養(yǎng)。1個月后統(tǒng)計愈傷組織數，計算分化再生率。分化再生率為出苗的愈傷組織數量與接種的愈傷組織數的百分比。

1.2.2 農桿菌介導的川香29B遺傳轉化體系建立

1) 轉基因操作流程。將攜帶植物表達載體PRIT1的農桿菌EHA105接種到YEB液體培養(yǎng)基(1.0 g/L酵母提取物+10 g/L蛋白胨+5.0 g/L蔗糖+1.027 g/L MgSO4+125 mg/L壯觀霉素+50 mg/L利福平)中，調節(jié)培養(yǎng)基pH為7.0，28 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)72 h，離心，收集菌種，用含有一定濃度乙酰丁香酮(AS)的AAM培養(yǎng)基(AA基本培養(yǎng)基+2.0 mg/L 2,4–D+0.6 g/L水解酪蛋白+ 0.1 g/L肌醇+68.5 g/L蔗糖+ 36 g/L葡萄糖，pH5.2)重新懸浮農桿菌，使之成為一定濃度的浸染菌液，并用上述濃度的農桿菌菌液浸染經過2輪繼代培養(yǎng)的川香29B胚性愈傷組織，浸染時間30 min, 隨后愈傷組織放在滅菌濾紙上吸去多余菌液，接入到共培養(yǎng)基(1/2NMB+ 3.0 mg/L 2,4–D +0.1 g/L肌醇+0.8 g/L水解酪蛋白+20 g/L蔗糖+10 g/L葡萄糖 +3.0 g/L Phytagel +浸染液AAM相同濃度的的AS，pH 5.6)中，在19 ℃暗環(huán)境下培養(yǎng)3 d，用無菌水清洗愈傷組織5次，最后用250 mg/L的頭孢霉素和250 mg/L羧芐青霉素浸泡愈傷組織10 min，將愈傷組織放置于滅菌濾紙上晾干后，再接種到篩選培養(yǎng)基(繼代培養(yǎng)基+潮霉素B 50 mg/L+頭孢霉素 250 mg/L+羧芐青霉素 250 mg/L)中培養(yǎng)，在26 ℃暗環(huán)境下培養(yǎng)，1個月后統(tǒng)計新長出的抗性愈傷數，抗性愈傷組織分別用于GUS染色和接種到分化培養(yǎng)基中再生。再生植株轉入生根培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基(鐵鹽濃度不變)+20 g/L蔗糖+1.5 g/L Phytagel，pH 6.0)生根壯苗。

2) 浸染液中農桿菌濃度優(yōu)化。當試驗中浸染液AAM和共培養(yǎng)基中所含AS終濃度為100 μmol/L時，調節(jié)農桿菌濃度OD600 nm分別為0.05、0.1、0.2、0.4，用于條件優(yōu)化。

3) AS濃度優(yōu)化。當試驗中農桿菌的濃度OD600 nm為 0.1時，調節(jié)浸染液 AAM和共培養(yǎng)基中所含AS終濃度分別為50、100、150、200、250 μmol/L，用于條件優(yōu)化。

4) 優(yōu)化條件下的轉基因試驗。在優(yōu)化的最適農桿菌濃度和AS濃度條件下，嚴格按照轉基因操作流程對川香29B愈傷組織進行3次重復轉基因試驗，計算愈傷轉化效率和植株轉化效率。愈傷轉化效率為 Hmr(潮霉素)和 GUS+的愈傷數與浸染愈傷數的百分比；抗性植株轉化率為分化抗性愈傷數與浸染愈傷數百分比。

1.2.3 GUS 染色觀察

取篩選培養(yǎng)基上長出的新愈傷組織和 T0代轉基因水稻葉片，參照文獻[11]的方法進行GUS染色觀察。

1.2.4 轉基因水稻的PCR檢測

采用CTAB法從轉基因水稻(T0代)葉片提取基因組DNA，PCR反應擴增潮霉素磷酸轉移酶基因hpt片段來確定轉基因陽性植株, 以 PRIT1質粒作為陽性對照，野生型水稻基因組DNA和H2O作為陰性對照。PCR引物為：

1.3 數據處理與分析

所有數據均采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行處理，結果分別進行單因素方差分析和顯著性測驗。

表1　供試秈稻品種在4種常用基本培養(yǎng)基上的出愈率Table 1 The callus induction rate of different Indica rice cultivars on four routine culture media

2 結果與分析

2.1 供試水稻的植物組培特性

對參試品種在4種常用的水稻基本培養(yǎng)基(MS、N6、NB和NMB)上的愈傷組織誘導情況(表1)進行比較，發(fā)現6個秈稻品種的成熟胚在4種基本培養(yǎng)基愈傷組織誘導率不同，在NMB基本培養(yǎng)基上愈傷組織誘導率最高，平均誘導率為77％～96％，并且誘導出來的愈傷組織狀態(tài)比較好，說明NMB基本培養(yǎng)基比較適合這6種秈稻品種愈傷組織的誘導和生長，并發(fā)現在NMB培養(yǎng)基上，川香29B品種的愈傷組織誘導率(96％)最高，愈傷狀態(tài)也最好，9311、Ⅱ–32B、明恢63和中9B也具有較高的愈傷組織誘導率，而金23B愈傷組織誘導率(77％)相對較低。

對6個秈稻品種愈傷組織的繼代培養(yǎng)結果(表2)進行比較，并觀察愈傷組織的生長狀態(tài)，發(fā)現多數秈稻品種的愈傷組織在前2次繼代時增殖倍數較大，隨后降低，其中9311、金23B和中9B品種的愈傷組織在第3次繼代時生長緩慢，愈傷褐化現象加重，明恢63的愈傷組織在前3次繼代時生長較好，繼代次數多于4次則生長速度減緩，而川香29B的愈傷組織在4次繼代中都始終保持著較高的增殖倍數，且在繼代中不易褐化，呈淡黃色，致密，顆粒狀。將第2次繼代的秈稻品種愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其分化率見圖2。不同秈稻品種間愈傷組織分化再生能力也存在較大差異，其中川香 29B分化率最高，為82％，中9B、Ⅱ–32B、明恢63和9311分化率在50％～70％，而金23B分化率最低，為40％。綜合以上數據，無論是愈傷誘導、繼代培養(yǎng)還是分化，川香29B都要優(yōu)于其他供試秈稻品種，說明川香29B具有較優(yōu)良的組培特性(圖3)。

表2　供試秈稻品種在4次繼代培養(yǎng)中愈傷組織的增殖倍數Table 2 Proliferation rate of calli from different Indica rice cultivars during subculture four times

圖2　不同秈稻品種愈傷組織的分化率Fig.2 The regeneration capacity of callus from different Indica rice cultivars

圖3　川香29B成熟胚的組織培養(yǎng)結果Fig. 3 Plant tissue culture of Chuanxiang29B mature embryos

2.2 農桿菌介導的川香29B轉基因體系

2.2.1 農桿菌菌液濃度對愈傷組織浸染的影響

不同濃度農桿菌對愈傷組織轉化率和染菌率見表3。綜合考慮愈傷轉化效率和染菌率，農桿菌濃度OD600 nm為0.10為最適濃度。

表3　不同濃度農桿菌川香29B愈傷組織轉化率和染菌率Table 3 Transformation efficiency and contamination rate under different concentration of Agrobacterium tumefacien

2.2.2 乙酰丁香酮（AS）對農桿菌浸染的影響

在浸染液AAM和共培養(yǎng)基中分別添加濃度為50～250 μmol/L的AS下農桿菌對川香29B愈傷組織浸染的影響(表4)顯示，隨著AS濃度增加，愈傷轉化效率逐漸呈先升高后降低的趨勢，當AS濃度為200 μmol/L時，愈傷轉化效率(27.2％)達到最高。

表4　不同AS濃度下川香29B愈傷的轉化效率Table 4 The transformation efficiency of Chuanxiang29B under different AS concentration

2.2.3 最適條件下農桿菌介導川香29B轉基因試驗

在農桿菌EHA105菌液濃度OD600 nm為0.1，浸染液AAM中AS濃度為200 μmol/L，浸染時間30 min, 共培養(yǎng)時間為72 h，共培養(yǎng)溫度為19 ℃條件下，重復3次轉基因試驗的結果(表5)顯示，愈傷組織最高轉化效率可達28.7％，3次試驗的平均轉化率為26.1％，平均抗性植株轉化率為19.6％，且3次重復性試驗的結果較穩(wěn)定?？偣搏@得114株抗性再生植株，經GUS染色和PCR擴增，檢測到97株為陽性植株，陽性植株獲得率為85.1％。部分陽性植株的PCR鑒定結果見圖4。

表5　最適條件下農桿菌介導川香29B的轉化效率Table 5 Transformation efficiency of Agrobacterium tumefacienmediated system for Chuanxiang29B under optimum condition

泳道M D2000 Marker；泳道1～21為轉基因水稻植株hpt基因PCR擴增結果，片段大小為900 bp；CK為非轉基因的川香29B植株擴增結果。圖4　川香29B部分轉基因水稻植株的PCR檢測結果Fig. 4 The PCR detection of some transgenic rice plants of Chuanxiang29B

3 結論與討論

大多數秈稻品種組織培養(yǎng)比較困難，且不同秈稻品種之間的組織培養(yǎng)特性相差較大，目前只有少數幾個秈稻品種建立了穩(wěn)定的組培體系，因此，在優(yōu)質秈稻品種中篩選出組培特性較好的品種作為轉基因受體材料具有重要理論和實踐意義。張亞芳等[12]對6個生產上主栽秈型雜交水稻親本的組織培養(yǎng)特性進行研究，發(fā)現其中雜交秈稻豐優(yōu)香占的恢復系R6547的組培特性優(yōu)于大多數秈稻品種，其愈傷誘導率達95％以上，分化再生率高達87％，具有很強的耐繼代能力，并且農桿菌介導的外源基因轉化頻率接近或達到粳稻模式品種的水平。本研究結果表明，秈稻品種川香29B的愈傷組織誘導和分化率均優(yōu)于其他供試秈稻品種，愈傷誘導率可達96％，分化再生率達82％，且表現出較強的耐繼代能力，是1個組培特性優(yōu)良的秈稻品種。

在農桿菌介導的外源基因轉化試驗中，川香29B抗性植株轉化效率最高可達 21.8％，雖然與R6547(植株轉化效率37％)[12]相比，轉化效率稍低，但轉化體系穩(wěn)定，可以滿足轉基因試驗要求。由于很多因素會影響農桿菌的轉化效率，如農桿菌的濃度、AS濃度、愈傷組織的狀態(tài)及共培養(yǎng)時間和溫度等[4,13]，本研究只對2個重要因素(農桿菌的濃度和AS濃度)進行了優(yōu)化，今后還需對影響農桿菌轉化的其他因素進行系統(tǒng)探索，以建立川香29B更高效的農桿菌介導轉化體系。

川香29B是四川省農業(yè)科學院作物研究所選育的優(yōu)質秈型香稻保持系，其母本為川香29A，具有開花習性好，異交結實率高，抗病性強，米質優(yōu)良且有香味等特點。利用川香29A已成功配制10多個雜交稻品種或組合，如川香優(yōu)1號、川香優(yōu)2號、川香優(yōu) 2058號等，已通過審定且在多個省份推廣種植[14–15]。由于川香29B具有許多優(yōu)良農藝性狀，也是水稻重要農藝性狀相關基因和香味基因定位研究的重要材料[16–19]。川香29B優(yōu)良組培特性的發(fā)現和農桿菌轉化體系的建立可以為稻米香味相關基因以及控制優(yōu)良農藝性狀基因的分離、克隆奠定基礎，也為秈稻的功能基因研究和分子育種提供必要的技術支持。

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責任編輯：尹小紅

英文編輯：梁和

Discovery of an elite Indica rice cultivar with excellent tissue culture response and establishment of its genetic tranformation system mediated by Agrobacterium tumefacien

Tong Puguo, Ouyang Jiexiu, Yan Xin, Li Shaobo, Liao Pengfei*
(School of Life Sciences, Nanchang University/Jiangxi Provincial Key Laboratory of Molecular Biology and Genetic Engineering, Nanchang 330031, China)

Abstract:Characteristics of in vitro plant tissue culture of four widely applied elite Indica hybrid rice maintainer lines (Zhong9B, Jin23B,Ⅱ–32B,Chuanxiang29B)and two widely applied elite restorer lines(9311 and Minghui63) were investigated systematically in this study. The Indica rice cultivar-Chuanxiang29B was identified with excellent tissue culture response. It is shown that the callus induction rate of Chuanxiang29B from mature embryos was 96％ and the plantlet regeneration rate of it was 82％, indicating higher rates of callus induction, proliferation, subculture tolerance and plantlet regeneration of Chuanxiang29B than most of other indica rice cultivars. An optimized and stable genetic transformation system mediated by Agrobacterium tumefacien for Chuanxiang29B was then established, in which the transformation efficiency of resistant plants reached up to 19.6％ with the following conditions: the period of the calli inoculation with Agrobacterium tumefacien EHA105 (OD600 nm=0.1) in AAM with acetosyringone (200 μmol/L) for 30 min and cocultivation at 19 ℃ in dark for 72 h.

Keywords:Indica rice; plant tissue culture; Chuanxiang29B; genetic transformation; Agrobacterium tumefacien

中圖分類號：S511.2+10.1

文獻標志碼：A

文章編號：1007?1032(2016)03?0225?06

收稿日期：2015–12–28 修回日期：2016–03–15

基金項目：國家自然科學基金項目(31260313)；江西省自然科學基金項目(20132BAB204012)

作者簡介：童普國(1991—)，男，湖北武漢人，碩士研究生，主要從事植物遺傳學研究，1406545917@qq.com；?通信作者，廖鵬飛，副教授，主要從事植物基因功能研究，lfp_1980@163.com