周紅艷，徐建東

(1.浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 藥劑科，浙江 臺(tái)州 318020；2.上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院 藥劑科，上海 200080)

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定清熱明目茶中大黃素、大黃酚與大黃素甲醚含量

周紅艷1，徐建東2Δ

(1.浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 藥劑科，浙江 臺(tái)州 318020；2.上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院 藥劑科，上海 200080)

目的 建立清熱明目茶中大黃素、大黃酚與大黃素甲醚含量的一測(cè)多評(píng)方法。方法 采用高效液相法采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定10批清熱明目茶中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚間的相對(duì)校正因子，考察其重現(xiàn)性，比較計(jì)算值與測(cè)得值的差異。結(jié)果 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定10 批清熱明目茶中大黃素、大黃酚與大黃素甲醚的含量，與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值基本一致。結(jié)論 該方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于清熱明目茶的質(zhì)量控制。

一測(cè)多評(píng)；清熱明目茶；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚

清熱明目茶由決明子(炒)、菊花和甜葉菊3味藥材制得，具有平肝明目，清熱祛風(fēng)等功效, 臨床常用于治療高血壓、頭痛、頭眩、目赤目糊等癥狀。其中決明子在我國(guó)古代就已入藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》就將決明子列為上品，稱之“能治諸眼疾，久眼益精光，輕身?！苯?jīng)研究，決明子具有較好降血脂、降血壓、抗氧化、抗衰老等療效[1]。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]，決明子主要含有大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等成分。近年來，有不少研究對(duì)決明子成分做了相關(guān)研究，但均需要配制多種對(duì)照物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)操作過程繁瑣，而且檢驗(yàn)成本較高。而王智民等[5]最早提出建立利用一測(cè)多評(píng)法控制中成藥多成分考察模式，隨機(jī)在中成藥領(lǐng)域大放異彩，得到極大推廣。本實(shí)驗(yàn)以大黃素為參照物，建立其與大黃酚和大黃素甲醚間的校正因子，并計(jì)算各成分的量，通過考察不同色譜儀器和色譜柱對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，并通過比較2種方法的差異來驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)的準(zhǔn)確性和可靠性。此種方法實(shí)現(xiàn)以一種對(duì)照物質(zhì)(大黃素)對(duì)清熱明目茶含有的多做有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制，這為更真實(shí)評(píng)價(jià)清熱明目茶質(zhì)量提供全新模式，以便更好地控制清熱明目茶的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：清熱明目茶，規(guī)格： 3克/袋，共10個(gè)批次；大黃素對(duì)照品(批號(hào)：110756-200110，含量：100.0%)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào)：110758-201013，含量：99.8%)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)：110796-201017，含量：99.6%)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀，檢測(cè)器：1260VWD；色譜工作站：Agilent ChemStation for LC systems；色譜柱：sunfire ODS(4.6 mm×250 mm，5μm)；AB-135S型電子天平(METTLER-TOLEDO)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：sunfire ODS(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸, 梯度洗脫(程序：0 min時(shí)乙腈含量70%，0→20 min, 乙腈比例從70%→85%)；檢測(cè)器：1260VWD二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)定為254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2 溶液的配制

① 混合對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品(P2O5真空干燥24 h)各適量，加甲醇制成每1 mL含大黃素5 μg、10 μg和大黃素甲醚5 μg的混合對(duì)照品溶液。

② 供試品溶液的制備：取混合均勻清熱明目茶，研細(xì)，精密稱取適量，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL,加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

③ 陰性樣品溶液的制備：按處方制備缺少上述3種成分的陰性樣品，按②供試品溶液的制備步驟制得陰性樣品溶液。

圖1 對(duì)照品(A)、樣品(B)和陰性樣品(C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard(A),sample(B)and negative sample(C)

1.2.3 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察

① 線性關(guān)系的考察：精密量取混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20、50 μL注入色譜儀，按照“1.2.1”項(xiàng)下給定色譜條件試驗(yàn)，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

② 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批供試品溶液，室溫放置0、5、8、15、20、24 h，依照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

③ 精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，依照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

④ 加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的清熱明目茶6份，分別加入一定量的大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品，依“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

1.2.4 相對(duì)校正因子計(jì)算：本研究以大黃素為內(nèi)參物，按文獻(xiàn)給定公式[5]計(jì)算：

f=fs/fi=AsCi/AiCs

(注：As——內(nèi)參物對(duì)照品峰面積，Cs——內(nèi)參物濃度，Ai——待測(cè)成分峰面積，Ci——待測(cè)成分濃度)。

精密量取混合對(duì)照溶液2、4、8、15、20和25 μL，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

1.2.5 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察：分別考察型號(hào)分別為戴安UltiMate 3000 、SHIMADZU LC-10tvp和Waters 2695-2489等3臺(tái)不同型號(hào)高效液相色譜儀，不同型號(hào)色譜柱Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm，4.5 μm)對(duì)相對(duì)校正因子的影響。

1.2.6 色譜峰專屬性考察：色譜峰準(zhǔn)確定位是保證一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用的前提，本實(shí)驗(yàn)中利用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定位，采用大黃素與大黃酚和大黃素甲醚的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)合色譜圖整體特征來定位目標(biāo)成分，并在不同高效液相色譜儀和色譜柱來考察方法耐用性。

1.2.7 樣品測(cè)定：取10批清熱明目茶，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算清熱明目茶中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。

2 結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系考察結(jié)果：大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的回歸方程分別為：

Y=3.25X+1.09，R2=1；Y=1.56X+0.45，R2=0.9999；Y=7.23X+3.88，R2=0.9999。

結(jié)果表明大黃素、大黃酚和大黃素甲醚進(jìn)樣量分別在0.531～2.582 ng、1.223～5.215 ng 、0.511～2.502 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果：大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.7%、0.5%和0.9%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果：大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.1%、0.4%和0.8%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果：回收率結(jié)果見表1-3。

表1 大黃素回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表2 大黃酚回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表3 大黃素甲醚回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.2 相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果 大黃酚和大黃素甲醚的校正因子分別為0.694和3.596，RSD分別為0.4%和0.4%。

2.3 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察結(jié)果 通過對(duì)3臺(tái)不同型號(hào)的色譜儀和色譜柱進(jìn)行交叉考察驗(yàn)證，相對(duì)校正因子比較穩(wěn)定，大黃酚和大黃素甲醚RSD分別為0.6%和0.1%，可以看出一測(cè)多評(píng)法可以運(yùn)用在檢測(cè)清熱明目茶中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚成分中，方法耐用性強(qiáng)，簡(jiǎn)便可靠。見表4。

表4 高效液相色譜儀及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.4 色譜法專屬性考察結(jié)果 大黃酚和大黃素甲醚相對(duì)大黃素保留時(shí)間的RSD分別為0.1%和0.2%，偏差很小，可以看出按照本實(shí)驗(yàn)方法試驗(yàn)，不同色譜儀和色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間影響甚微，3種成分相對(duì)位置(色譜峰中相對(duì)保留時(shí)間)比較穩(wěn)定，在已知一種成分保留時(shí)間的前提下可以將相對(duì)保留時(shí)間作為任2種成分的定性依據(jù)，結(jié)合其他相關(guān)鑒別方法對(duì)清熱明目茶進(jìn)行定性分析。見表5。

表5 不同色譜儀及色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果 10批樣品測(cè)定結(jié)果見表6。為比較外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法之間存在的差異，本研究采用2種方法進(jìn)行考察：①比較外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法所測(cè)含量的夾角余弦值[5]，大黃酚和大黃素甲醚夾角余弦值分別為0.9999和0.9995；②通過計(jì)算清熱明目茶10批中2種成分分別采用2種方法所得結(jié)果，結(jié)果RSD值均小于1.0%，可以認(rèn)為2種方法測(cè)得結(jié)果基本一致。通過2種方法對(duì)含量結(jié)果的比較，可以看出所測(cè)含量沒有顯著差異，一測(cè)多評(píng)法可以作為清熱明目茶考察這3種成分的質(zhì)控方法。見表6。

表6 樣品的測(cè)定結(jié)果

續(xù)表

3 討論

利用在外分光光法全波長(zhǎng)掃描混合對(duì)照溶液發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)涉及到的三種蒽醌類化合物在225 nm、255 nm及285 nm處均有都有較好的吸收。在225 nm處存在末端吸收故而舍去，而在285 nm處相比254 nm存在響應(yīng)值低、色譜分離不理想等缺點(diǎn)，所以選擇254 nm波長(zhǎng)為本實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)共考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液及乙腈-0.1%磷酸溶液等諸多流動(dòng)相，結(jié)果只有采用乙腈-0.1%磷酸溶液是3個(gè)對(duì)照物質(zhì)才同步出現(xiàn)信號(hào)并實(shí)現(xiàn)完全分離，但是大黃素甲醚保留時(shí)間過長(zhǎng)，所以最終采用梯度洗脫程序。通過了解3種物質(zhì)理化性質(zhì)，樣品提取介質(zhì)選取甲醇，通過比較浸泡法、超聲法和加熱回流3種方法，最后發(fā)現(xiàn)只有加熱回流1 h以上才能完全提取3種物質(zhì)，達(dá)到實(shí)驗(yàn)制備要樣品要求。

一測(cè)多評(píng)法(QAMS)比較傳統(tǒng)外標(biāo)法存在諸多優(yōu)點(diǎn)，它可在待測(cè)成分對(duì)照品不易得到或不穩(wěn)定等情況下，使用一種對(duì)照物質(zhì)利用相對(duì)校正因子同時(shí)能測(cè)定多成分的含量。目前，一測(cè)多評(píng)法已在中藥材及飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)中廣泛應(yīng)用[6-9]。此種方法不僅大大地節(jié)省了檢驗(yàn)成本，同時(shí)也極大地簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，有效提高工作效率和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，方法有效可行，可以為制定本藥品標(biāo)準(zhǔn)是提高參考。

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(編校：王冬梅)

Content determination of emodin,chrysophanol and physcion in Qingre Mingmu Tea by quantitative analysis of multi-components by single-marker

ZHOU Hong-yan1, XU Jian-dong2Δ

(1.Department of Pharmacy, Taizhou First People’s Hospital of Zhejiang Province, Taizhou 318020, China; 2.Department of Pharmacy, Jiangwan Hospital of Shanghai Hongkou Distric, Shanghai 200080, China)

ObjectiveTo develop a method of quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)for determination of emodin,chrysophanol,physcion in Qingre Mingmu Tea.MethodsBased on the HPLC, the relative correction factor of emodin was determined using magnolol as an internal reference substance, the method was evaluated for reproducibility, and the difference between calculated and measured values was compared.ResultsThe quantitative results of ten batches of Qingre Mingmu Tea by QAMS was basically consistent with that by external standard method.ConclusionThe QAMS method is reliable and accurate, which might be used for the quality control of Qingre Mingmu Tea.

quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS); Qingre Mingmu Tea; emodin; chrysophanol; physcion

周紅艷，女，本科，副主任藥師，研究方向：中藥學(xué)，E-mail: 3369250235@qq.com；徐建東，通信作者，女，本科，副主任藥師，研究方向：中藥學(xué)，E-mail：2959198896@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.59