郝雨,楊順義,張新虎,沈慧敏,岳秀利,羅玲艷

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心,甘肅 蘭州　730070)

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頂孢霉孢子懸浮液對(duì)小麥和黃瓜種子萌發(fā)及六種作物幼苗生長(zhǎng)的影響

郝雨,楊順義,張新虎,沈慧敏,岳秀利,羅玲艷

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心,甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 研究頂孢霉Ahy1對(duì)作物的安全性及生理指標(biāo)的影響.【方法】 采用室內(nèi)生測(cè)和生理生化分析法，測(cè)定了頂孢霉(Ahy1)孢子懸浮液對(duì)小麥和黃瓜種子萌發(fā)、體內(nèi)酶活性以及對(duì)6種作物幼苗生長(zhǎng)的影響.【結(jié)果】 在25 ℃，相對(duì)濕度75%條件下，不同濃度的懸浮液對(duì)小麥和黃瓜種子萌發(fā)及根長(zhǎng)生長(zhǎng)表現(xiàn)出高抑和低促作用；對(duì)小麥種子中4種酶的活性均有不同程度的促進(jìn)作用；對(duì)黃瓜種子中SOD、POD表現(xiàn)為促進(jìn)作用，相對(duì)抑制率分別為-82.51%和-35.96%，對(duì)CAT有明顯的抑制作用，對(duì)Pro含量影響不明顯.對(duì)菜豆、小麥、玉米、辣椒、茄子、黃瓜6種供試作物株高平均抑制率分別為-18.62%、-8.12%、-11.11%、-8.56%、-6.61%和-1.71%；對(duì)菜豆、小麥幼苗鮮質(zhì)量的相對(duì)抑制率分別為-21.10%、-14.29%，對(duì)辣椒、菜豆、茄子和小麥干質(zhì)量抑制率分別為-16.41%、-15.59%、-15.10%和-9.50%，表現(xiàn)促生作用，但對(duì)黃瓜和玉米的干質(zhì)量表現(xiàn)抑制作用.【結(jié)論】 Ahy1菌株不同濃度孢子懸浮液處理供試作物21 d后，均未見任何發(fā)病癥狀，植株生長(zhǎng)正常，對(duì)供試作物生長(zhǎng)沒有明顯可見影響.

關(guān)鍵詞：頂孢霉孢子懸浮液；幼苗株高；鮮質(zhì)量；干質(zhì)量；種子萌發(fā)率；根長(zhǎng)生長(zhǎng)；生理指標(biāo)

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中濫施化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境與食品安全問題的日趨勢(shì)嚴(yán)重，非化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害的研究開始得到人們的重視.微生物殺蟲劑具有易被降解，對(duì)人畜和益蟲無害，昆蟲對(duì)其不易產(chǎn)生抗性，且具有高特異性等優(yōu)點(diǎn)[1]，如蟲生真菌制劑，已有試驗(yàn)測(cè)試了某些蟲生真菌對(duì)脊椎動(dòng)物的影響，只發(fā)現(xiàn)了較小的過敏反應(yīng)[2-3].真菌殺蟲劑具有對(duì)環(huán)境友好、殺蟲方式獨(dú)特、害蟲不易產(chǎn)生抗性、使用范圍廣、容易大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，是最安全、效果最佳的生物農(nóng)藥[4-6].研究我國(guó)豐富的殺蟲真菌微生物資源，開發(fā)適宜于甘肅省干旱條件下生產(chǎn)和應(yīng)用的真菌微生物殺蟲劑，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義.

頂孢霉(A.hansfordii)是一種蟲生真菌[7-8]，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥系從蚜蟲上分離獲得一株頂孢霉菌株Ahy1，并對(duì)獲得的Ahy1菌株在生防素毒力、組織病理學(xué)培養(yǎng)和加工工藝方面做了一些研究[9-10]，如：宋麗雯[9]研究證實(shí)頂孢霉菌株Ahy1對(duì)桃蚜、苜蓿斑蚜、豆無網(wǎng)長(zhǎng)管蚜、粘蟲和菜青蟲均有較強(qiáng)的侵染力，尤其對(duì)桃蚜的毒力最強(qiáng)，最終累計(jì)死亡率為84.07%.其胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的分泌規(guī)律及活力與毒力之間存在顯著的相關(guān)性；李莉等[10]初步研究了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、碳氮比、不同培養(yǎng)時(shí)間與Ahy1生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系；張莉等[11]研究了Ahy1菌株的加工工藝，為該菌的工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；王琰等[12]研究了Ahy1對(duì)小菜蛾的毒力及體內(nèi)保護(hù)酶活力的影響.

目前，有關(guān)該菌株是否會(huì)侵染農(nóng)作物，對(duì)作物的安全性及生理指標(biāo)的影響未見有報(bào)道.本研究通過測(cè)定頂孢霉菌株Ahy1對(duì)幾種作物的致病性及生理指標(biāo)的影響，明確該菌株對(duì)黃瓜、玉米、菜豆、小麥、茄子及辣椒等農(nóng)作物的安全性，以期為開發(fā)對(duì)害蟲侵染力高、對(duì)作物安全的頂孢霉Ahy1菌株微生物殺蟲劑奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試作物黃瓜(‘綠寶’)、玉米(‘鄭單958’)、菜豆(‘無筋架豆王’)、小麥(‘中植3號(hào)’)、茄子(‘蘭雜2號(hào)’)、辣椒(‘九寸紅’)，上述作物種子均由甘肅省綠星種子公司提供.

1.1.2供試菌株頂孢霉(A.hansfordii)菌株Ahy1由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)純化保存于4 ℃冰箱中，每2月轉(zhuǎn)接1次.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1頂孢霉菌株孢子懸浮液的制備用PDA平板培養(yǎng)頂孢霉菌株，挑取適量菌落放入SDAY培養(yǎng)液[11]，置于恒溫振蕩儀中，轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度25 ℃振蕩培養(yǎng)72 h[13].然后，用紗布過濾制孢子懸浮液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1×107個(gè)孢子/mL.

1.2.2頂孢霉菌株對(duì)黃瓜和小麥種子萌發(fā)、根長(zhǎng)及生化指標(biāo)的影響采用濾紙萌發(fā)法培養(yǎng)[14-15].黃瓜和小麥種子用75%的酒精消毒5 min，經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，50 ℃溫水浸泡48 h，然后用濾紙吸干，挑選健康而飽滿的種子置于鋪有2層定性濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，將頂孢霉孢子懸浮液稀釋為5×106、1×106、5×105、2×105、1×105、2×104、1×104個(gè)孢子/mL 6個(gè)濃度，每個(gè)處理分別取10 mL加入相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，然后分別放入10粒黃瓜和小麥種子，以蒸餾水為對(duì)照，重復(fù)3次.將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25 ℃，濕度60%～70%.待對(duì)照種子全部萌發(fā)時(shí)，分別檢查各處理種子萌發(fā)數(shù)和種子根長(zhǎng)，分別計(jì)算種子萌發(fā)率，測(cè)量根長(zhǎng)度.

待對(duì)照組黃瓜和小麥種子全部萌發(fā)時(shí)，收集上述經(jīng)檢查過的萌發(fā)種子(包括其芽和根)，用蒸餾水沖洗兩次，測(cè)定生化指標(biāo).可溶性蛋白(Pro)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[16]；過氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[16]；過氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[16]；過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用分光光度法[16].

1.2.3頂孢霉菌株對(duì)供試作物幼苗生長(zhǎng)的影響選取健康、籽粒飽滿的黃瓜、玉米、菜豆、小麥、茄子、辣椒種子，溫湯浸種催芽后，播種于塑料花盆(直徑14 cm,高度11 cm)內(nèi)，小麥每盆播種20粒種子，其他5種作物每盆播種10粒種子；待苗高10 cm后，剔除長(zhǎng)勢(shì)較弱的幼苗，小麥每盆留10株，其他5種作物每盆留5株.采用噴霧法[17]，將孢子濃度為1×107個(gè)/mL的頂孢霉懸浮液稀釋為5×106、1×106、5×105、2×105、1×105個(gè)孢子/mL后分別噴施黃瓜、玉米、菜豆、小麥、茄子和辣椒幼苗，以清水為對(duì)照，重復(fù)3次.噴施后將花盆置于光照培養(yǎng)箱中25 ℃、相對(duì)濕度75%，光照/黑暗(L/D)處理12 h/12 h.分別在處理7、14、21 d時(shí)，每個(gè)處理分別選取5株幼苗測(cè)株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，計(jì)算相對(duì)抑制率(%)，并觀察植物的發(fā)病情況(是否有病斑、病斑大小、病斑顏色)及植物葉片生長(zhǎng)情況.

1.2.4數(shù)據(jù)分析所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用DPS(7.05)軟件，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn).

2結(jié)果與分析

2.1頂孢霉菌株對(duì)黃瓜和小麥種子各生理、生化指標(biāo)的影響

2.1.1頂孢霉菌株對(duì)黃瓜和小麥種子萌發(fā)及根生長(zhǎng)的影響由表1可知，Ahy1孢子懸浮液在高濃度下對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和根長(zhǎng)生長(zhǎng)有輕微的抑制作用，隨濃度降低抑制作用減弱.Ahy1孢子懸浮液在5×106、1×106、2×105個(gè)孢子/mL濃度下，對(duì)黃瓜種子萌發(fā)相對(duì)抑制率分別為25.56%、11.11%、7.41%，對(duì)黃瓜根長(zhǎng)的相對(duì)抑制率分別為32.29%、20.18%和18.39%.Ahy1孢子懸浮液在2×104、1×104個(gè)孢子/mL濃度下，對(duì)黃瓜種子萌發(fā)相對(duì)抑制率分別為-8.64%、-11.11%，對(duì)黃瓜根長(zhǎng)的相對(duì)抑制率分別為-0.90%、-8.07%，表現(xiàn)為促生作用.

Ahy1孢子懸浮液6個(gè)濃度下對(duì)小麥種子萌發(fā)的影響不明顯，在5×106、1×105個(gè)孢子/mL濃度下相對(duì)萌發(fā)抑制率為7.00%和6.00%，其他4個(gè)濃度與對(duì)照差異不顯著.對(duì)小麥根長(zhǎng)生長(zhǎng)表現(xiàn)出高濃度的抑制作用和低濃度的促生作用，在5×106、1×106、2×105個(gè)孢子/mL濃度下，對(duì)根長(zhǎng)的相對(duì)抑制率分別為38.30%、31.92%和6.74%，表現(xiàn)抑制作用；在2×104、1×104個(gè)孢子/mL濃度下，小麥根長(zhǎng)的相對(duì)抑制率分別為-2.48%和-8.87%，表現(xiàn)為促生作用.

表1　Ahy1孢子懸浮液對(duì)黃瓜和小麥萌發(fā)及根長(zhǎng)的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著.

2.1.2頂孢霉菌株對(duì)黃瓜和小麥種子各生化指標(biāo)的影響由表2可知，Ahy1孢子懸浮液6個(gè)濃度對(duì)黃瓜種子中Pro含量影響不明顯(平均相對(duì)抑制率為3.14%)，但對(duì)SOD、POD影響顯著，其平均相對(duì)抑制率分別為-82.51%和-35.96%，表現(xiàn)為促進(jìn)作用，對(duì)CAT有明顯的抑制作用，平均相對(duì)抑制率為20.51%；對(duì)小麥種子中可溶性蛋白(Pro)、過氧化物酶(POD)、過氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)含量有顯著的影響，其平均相對(duì)抑制率分別為-2.05%、-18.07%、-23.31%和-34.33%，表現(xiàn)為明顯的促進(jìn)作用.

表2　Ahy1孢子懸浮液對(duì)黃瓜和小麥種子生化指標(biāo)的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著.

2.2頂孢霉菌株對(duì)供試作物生長(zhǎng)的影響

由圖1可看出，Ahy1菌株不同濃度孢子懸浮液處理黃瓜、玉米、菜豆、小麥、茄子及辣椒的幼苗21 d后，均未見任何發(fā)病癥狀，植株生長(zhǎng)正常，與對(duì)照無顯著差異.頂孢霉菌株未侵染供試作物，對(duì)供試作物生長(zhǎng)沒有明顯可見影響.

2.2.1頂孢霉菌株對(duì)供試作物株高的影響由表3可知，頂孢霉5×106、1×106、5×105、2×105、1×105個(gè)孢子/mL 5個(gè)濃度處理6種供試作物7 d后，對(duì)株高均有不同程度的促進(jìn)作用，菜豆、玉米促進(jìn)作用最明顯，其平均抑制率分別為-18.62%、-11.11%，與對(duì)照差異顯著；其次是辣椒、茄子和黃瓜，平均抑制率分別為-8.56%、-6.61%和-1.71%.頂孢霉菌株對(duì)供試作物無影響，并表現(xiàn)促生作用.

2.2.2頂孢霉菌株對(duì)供試作物鮮質(zhì)量的影響由表4可知，Ahy1不同濃度對(duì)6種供試作物的鮮質(zhì)量均有不同程度的影響，處理7 d后，對(duì)菜豆、小麥幼苗鮮質(zhì)量有明顯的促進(jìn)作用，其相對(duì)抑制率分別為-21.10%、-14.29%，與對(duì)照差異顯著；其次對(duì)辣椒、茄子和黃瓜幼苗鮮質(zhì)量有輕微的促進(jìn)作用，其抑制率分別為-5.71%、-2.00%和-1.10%；對(duì)玉米幼苗的鮮質(zhì)量略有抑制作用，相對(duì)抑制率為2.65%，與對(duì)照差異不顯著.

A：黃瓜Ahy1處理；B：黃瓜清水對(duì)照處理；C：玉米Ahy1處理；D：玉米清水對(duì)照處理；E：菜豆Ahy1處理；F：菜豆清水對(duì)照處理；G：小麥Ahy1處理；H：小麥清水對(duì)照處理；I：茄子Ahy1處理；J：茄子清水對(duì)照處理；K：辣椒Ahy1處理；L：辣椒清水對(duì)照處理.圖1　Ahy1孢子懸浮液對(duì)6種作物幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.1　Effect of Ahy1 spores suspension on seedlings’ growth of six crops

頂孢霉處理/(個(gè)孢子·mL-1)黃瓜株高/cm相對(duì)抑制率/%玉米株高/cm相對(duì)抑制率/%菜豆株高/cm相對(duì)抑制率/%CK13.54±0.65a-8.55±2.09a-22.60±3.76b-5×10613.35±1.47a1.429.04±1.57a-5.7326.78±3.65ab-18.501×10614.36±0.85a-6.039.92±1.87a-16.0224.53±1.81ab-8.545×10513.54±1.97a-0.029.96±0.65a-16.4927.88±3.53a-23.362×10514.50±1.77a-7.069.68±1.42a-13.2227.43±3.55a-21.371×10513.12±1.50a3.128.20±0.94a-4.0927.42±2.34a-21.33平均抑制率%-1.71-11.11-18.62頂孢霉處理/(個(gè)孢子·mL-1)小麥株高/cm相對(duì)抑制率/%茄子株高/cm相對(duì)抑制率/%辣菽株高/cm相對(duì)抑制率/%CK22.20±3.62a-5.2±0.68ab-3.97±0.47a-5×10625.21±4.91a-13.555.51±0.60ab-4.754.15±0.72a-4.531×10624.45±4.54a-10.145.95±0.49a-13.114.52±0.60a-13.855×10523.69±7.08a-6.714.93±0.80b6.274.30±0.45a-8.312×10523.43±5.63a-5.545.34±0.59ab-1.524.46±0.78a-12.341×10523.23±3.72a-4.644.87±0.73b7.414.12±0.56a-3.78平均抑制率%-8.12-6.61-8.56

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

表4　Ahy1孢子懸浮液對(duì)6種作物幼苗鮮質(zhì)量的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

2.2.3頂孢霉菌株對(duì)供試作物干質(zhì)量的影響由表5可知，Ahy1 5個(gè)濃度處理6種供試作物7 d后，對(duì)黃瓜和玉米的干質(zhì)量有抑制作用，其抑制率分別為15.10%和6.21%；對(duì)辣椒、菜豆、茄子和小麥的干質(zhì)量有促進(jìn)作用，其抑制率分別為-16.41%、-15.59%、-15.10%和-9.50%；與對(duì)照差異不顯著.

表5　Ahy1孢子懸浮液對(duì)6種作物幼苗干質(zhì)量的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

3討論

本研究結(jié)果表明，在25 ℃，相對(duì)濕度75%條件下，Ahy1菌株不同濃度的懸浮液對(duì)6種供試作物處理7 d后，對(duì)大部分幼苗的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量有不同程度的促生作用，對(duì)玉米幼苗的鮮質(zhì)量和黃瓜及玉米幼苗的干質(zhì)量有抑制作用.Ahy1菌株不同濃度孢子懸浮液處理供試作物21 d后，均未見任何發(fā)病癥狀，植株生長(zhǎng)正常，對(duì)供試作物生長(zhǎng)沒有明顯可見影響.

Ahy1孢子懸浮液6個(gè)濃度對(duì)黃瓜和小麥種子萌發(fā)和根長(zhǎng)生長(zhǎng)有輕微的抑制作用，隨濃度降低抑制作用減弱，表現(xiàn)為促進(jìn)作用，即整體上表現(xiàn)出高濃度抑制作用和低濃度促生作用.由于Ahy1菌株對(duì)蚜蟲有較高的毒力(對(duì)甘藍(lán)蚜的LC50為1.650× 106個(gè)孢子/mL)[9]，其代謝液中含有多種活性物質(zhì)，這些物質(zhì)中可能含有對(duì)植物生長(zhǎng)有影響的成分.但從試驗(yàn)結(jié)果來看，這些前期的影響較為輕微，對(duì)作物生長(zhǎng)后期的影響有待于進(jìn)一步驗(yàn)證.

Ahy1孢子懸浮液6個(gè)濃度對(duì)小麥種子中可溶性蛋白(Pro)、過氧化物酶(POD)、過氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)含量有顯著的影響，其平均相對(duì)抑制率分別為-2.05%、-18.07%、-23.31%和-34.33%，表現(xiàn)為促進(jìn)作用，這些酶是植株保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分，小麥在此條件下抗逆性增強(qiáng)；對(duì)黃瓜種子中SOD、POD表現(xiàn)為促進(jìn)作用，相對(duì)抑制率分別為-82.51%和-35.96%，但對(duì)Pro、CAT有抑制作用，這可能是引起黃瓜幼苗干質(zhì)量變化的原因.

頂孢霉菌株Ahy1孢子懸浮液對(duì)作物生長(zhǎng)后期的影響作用及對(duì)黃瓜種子中CAT活性的抑制作用有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Effect ofAcremoniumhansfordiispores suspension on germination and growth of several crops seedling

HAO Yu,YANG Shun-yi,ZHANG Xin-hu,SHEN Hui-min,YUE Xiu-li,LUO Ling-yan

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Education Ministry,Sino-U.S.Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 The effects ofAcremoniumhansfordii(Ahy1) spores suspension were studied on seed germination and seedling growth of several crops.【Method】 Indoor biological tests and physiological and biochemical analysis were conducted on cucumbers,corns,beans,wheat,eggplant and peppers.【Result】 Ahy1 spores suspension at six concentrations showed promotion at high concentrations and inhibition at low concentrations on germination and root length of wheat and cucumber.Ahy1 differently promoted protein (Pro) content,activity of peroxidase (POD),superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in wheat seeds.Ahy1 spores suspension increased activity of SOD and POD in cucumber seeds,the inhibition rates were -82.51% and -35.96%.Ahy1 had significant inhibition to CAT activity,and no significant effect to Pro content.The average inhibition rates of Ahy1 to plant height of the six crops were -18.62%,-16.22%,-11.11%,-8.56%,-6.61% and -1.71%;and that were -21.10% and -14.29% to fresh weight of bean and wheat，that were -16.41%,-15.59%,-15.10% and -9.50% to the dry weight of peppers,beans,eggplant and wheat.These results indicated promoting effect of Ahy1,but inhibition to dry weight of cucumbers and corn.【Conclusion】 The tested crops were treated by Ahy1 spores suspension at six concentrations for 21 days,no significant disorders were found on plant growth.

Key words：A.hansfordiispores suspension;seedling height;fresh weight;dry weight;seed germination rate;root growth;physiological indicators

通信作者：張新虎，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)及生物農(nóng)藥的開發(fā)與應(yīng)用.E-mail：ndzxh@gsau.edu.cn

基金項(xiàng)目：甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(1204NKCA073).

收稿日期：2015-01-21；修回日期：2015-04-01

中圖分類號(hào)：S 763.306

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2016)03-0095-07

第一作者：郝雨(1988-) ，男，碩士研究生，研究方向微生物制劑的開發(fā)與應(yīng)用.E-mail：haoyu3210@sina.com