刑志林，張?jiān)迫悖?張麗杰

(1.重慶理工大學(xué)　a.化學(xué)化工學(xué)院;b.藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶　400054； 2.重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院, 重慶　400045)

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氯代烴存在下覆蓋層微生物甲烷氧化動(dòng)力學(xué)

刑志林1a，2，張?jiān)迫?b， 張麗杰1b

(1.重慶理工大學(xué)a.化學(xué)化工學(xué)院;b.藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶400054； 2.重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院, 重慶400045)

摘要：填埋氣中揮發(fā)性氯代烴等非甲烷有機(jī)物對(duì)覆蓋土中甲烷氧化有抑制效應(yīng)。通過(guò)擬合不同抑制動(dòng)力學(xué)方程考察了多種氯代烴對(duì)覆蓋土微生物甲烷氧化的抑制形式，結(jié)果表明：氯代烴與甲烷之間主要為競(jìng)爭(zhēng)性抑制(R2范圍為0.937～0.999)。計(jì)算了不同氯代烴存在時(shí)的米氏常數(shù)KmI和氯代烴的解離常數(shù)KI，結(jié)果顯示：1,1,2-三氯乙烷(KI=-30.111mg/L)和1-氯丙烷(KI=-24.323mg/L)對(duì)甲烷氧化有促進(jìn)作用；氯代烯烴的競(jìng)爭(zhēng)性抑制(KI為0.013～14.111mg/L)強(qiáng)于氯代烷烴(KI=0.215-278.515mg/L)；四氯乙烯的競(jìng)爭(zhēng)性抑制效應(yīng)最強(qiáng)，KI為0.013mg/L。該研究為強(qiáng)化覆蓋層甲烷氧化和氯代烴共代謝生物降解提供了理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：覆蓋層；甲烷氧化菌；甲烷氧化；氯代烴；抑制動(dòng)力學(xué)

在生活垃圾填埋場(chǎng)穩(wěn)定化過(guò)程中，有機(jī)物的厭氧分解產(chǎn)生的填埋氣(LFG)包括50%～60%的甲烷和5%～50%的二氧化碳[1-2]。據(jù)估計(jì)，填埋場(chǎng)每年約產(chǎn)生900～7 000萬(wàn)噸的甲烷，全球每年約有6億噸的甲烷排放到大氣中。此外填埋氣中還包含大約1%的超過(guò)100種揮發(fā)性非甲烷有機(jī)物(NMOCs)，包括具有生物毒性的鹵代脂肪烴和產(chǎn)生臭味的硫氧化物等[3-5]。LFG的排放對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，因此有效去除LFG對(duì)于填埋場(chǎng)實(shí)現(xiàn)真正的衛(wèi)生填埋有重要意義。

分析覆蓋土中甲烷與非甲烷有機(jī)物間的抑制關(guān)系，對(duì)于調(diào)控甲烷減排與氯代烴的共代謝降解有重要意義。然而，在前期研究中較少關(guān)注覆蓋土中甲烷與多種氯代烴的抑制關(guān)系，或只關(guān)注有限幾種氯代烴[12-13]，限制了甲烷氧化和氯代烴共代謝降解研究?；诖?，本研究以覆蓋土富集甲烷氧化菌為生物介質(zhì)，以競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制3種抑制方程為基礎(chǔ)，考察多種氯代烷烴、氯代烯烴的抑制形式，并基于不同氯代烴抑制方程，計(jì)算氯代烴解離常數(shù)，比較多種典型氯代烴的抑制能力。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

NMS液體培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[14]，所涉及氯代烴有二氯甲烷(DCM)、三氯甲烷(CF)、四氯化碳(CTC)、1,2-二氯乙烷(1,2-DCA)、1,1,2-三氯乙烷(1,1,2-TCA)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2-TeCA)、1-氯丙烷、1,3-二氯丙烷、1,2,3-三氯丙烷、順-1,2-二氯乙烯(s-1,2-DCE)、反-1,2-二氯乙烯(t-1,2-DCE)、三氯乙烯(TCE)和四氯乙烯(PCE)，以上氯代烴均為分析純，由重慶川東化工(集團(tuán))有限公司化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

所用微生物及培養(yǎng)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

將富含甲烷氧化菌的覆蓋土微生物培養(yǎng)至穩(wěn)定期中，根據(jù)菌液濃度與菌液吸光度(OD600)的關(guān)系曲線y=3.8390x得到富集菌液的濃度。配置不同濃度的氯代烴水溶液。以一種氯代烴一種濃度為例，將培養(yǎng)好的菌液分裝于5個(gè)100mL血清瓶中，添加0.5mL配置好的氯代烴水溶液，用丁基橡膠膠塞和鋁蓋密封。甲烷置換瓶中甲烷體積分別為2，3，5，7，10mL。監(jiān)測(cè)初始甲烷濃度，每隔一段時(shí)間監(jiān)測(cè)甲烷消耗量，計(jì)算甲烷氧化速率。設(shè)立批次實(shí)驗(yàn)，改變氯代烴種類(lèi)和濃度，重復(fù)以上步驟。

1.3分析檢測(cè)條件和方法

甲烷、氧氣和二氧化碳采用氣相色譜(川儀SC-6000A)測(cè)定，色譜條件:不銹鋼色譜柱TDX8-12-25 2m，進(jìn)樣口溫度、柱溫和檢測(cè)器(TCD) 溫度分別為120 ℃,90 ℃,120 ℃，氮?dú)鉃檩d氣，載氣流速為25mL/min，進(jìn)樣量為0.5mL。

1.4抑制動(dòng)力學(xué)

甲烷氧化菌在甲烷單加氧酶作用下將甲烷氧化，反應(yīng)過(guò)程符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)：

(1)

式中：rs為底物消耗速率(mol/(gcell·h))；rmax為底物最大消耗速率(mol/(gcell·h))；Cs為底物濃度(mol/L)；Km為米氏常數(shù)(mol/L)。

當(dāng)有抑制劑存在時(shí)，抑制劑的酶抑制分為以下幾種情況：

1) 競(jìng)爭(zhēng)性抑制。在反應(yīng)過(guò)程中抑制劑I在酶的活性部位上結(jié)合，阻礙了酶與底物的結(jié)合，使酶催化底物的反應(yīng)速率下降，底物最大消耗速率不受抑制劑影響。競(jìng)爭(zhēng)性抑制方程如下：

(2)

式中:rSI為有抑制時(shí)底物消耗速率(mol/(gcell·h))；KmI為有競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)的米氏常數(shù)(mol/L)。KmI與抑制劑的關(guān)系：

(3)

式中：KI為抑制劑的解離常數(shù)(mol/L)；CI為抑制劑濃度(mol/L)。將式(3)帶入式(2)，轉(zhuǎn)化為：

(4)

式(4)即為競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程。

2) 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。抑制劑與酶分子的結(jié)合點(diǎn)不在酶催化反應(yīng)的活性部位，底物與酶的結(jié)合并不影響抑制劑與酶的結(jié)合，而抑制劑與酶的結(jié)合卻阻止底物與酶的結(jié)合，米氏常數(shù)保持不變，因此方程如下：

(5)

式中rI,max為存在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制時(shí)的底物最大消耗速率，與抑制劑的關(guān)系：

(6)

式中rI,max為非競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)的最大消耗速率。將式(6)帶入式(5)轉(zhuǎn)化為：

(7)

3) 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑不能直接與游離酶相結(jié)合，而只能與復(fù)合物(酶和底物)相結(jié)合生成三元復(fù)合物(酶底物抑制劑)。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制方程為：

(8)

rI,max和KmI與抑制劑關(guān)系為：

(9)

(10)

將式(9)和(10)帶入式(8)，轉(zhuǎn)化為：

(11)

2結(jié)果與討論

2.1抑制動(dòng)力學(xué)擬合

以抑制劑二氯甲烷、1,2-二氯乙烷和四氯乙烯為例，3種抑制形式的線性擬合如圖1所示。

表1　不同抑制形式擬合的可決系數(shù)

表1(續(xù))

2.2不同氯代烴的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)

由式(3)可知：KI> 0，KI減小，則KmI增大，表明底物與酶的結(jié)合能力降低。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)原理，通過(guò)擬合直線的截距和斜率可以得到KmI，再根據(jù)式(3)以KmI對(duì)CI作圖即可得到不同氯代烴的解離常數(shù)KI，擬合結(jié)果如表2所示。由表2可以看出：1,1,2-三氯乙烷和1-氯丙烷的解離系數(shù)分別為-30.111 mg/L和-24.323 mg/L，KmI的變化范圍分別為0.042～0.066和0.076～0.093，明顯小于無(wú)氯代烴的Km(空白組1為0.103)，說(shuō)明該兩種氯代烴在濃度為0.1～10mg/L和0.14～3.4mg/L的范圍內(nèi)不僅沒(méi)有抑制甲烷氧化菌活性，在一定程度上強(qiáng)化了甲烷氧化。Zhao等[18]發(fā)現(xiàn)氯仿濃度小于80mg/L時(shí)可促進(jìn)兼性甲烷氧化菌MethylocystisstrainJTA1的活性。

除1,1,2-三氯乙烷和1-氯丙烷外，實(shí)驗(yàn)條件下其他氯代烴對(duì)覆蓋土微生物均表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。競(jìng)爭(zhēng)性抑制時(shí)的米氏常數(shù)KmI變化范圍為0.115～1.06和0.209～1.276，高于對(duì)應(yīng)的空白組0.103和0.200。隨著氯代烴濃度的增大，KmI增大，抑制效應(yīng)增大。氯代烴的解離常數(shù)KI變化范圍為由四氯乙烯的0.013 mg/L到1,2-二氯乙烷的278.515 mg/L，說(shuō)明四氯乙烯在較低的濃度時(shí)(0.003 75～0.188 mg/L)對(duì)該覆蓋土微生物就有很強(qiáng)的抑制效應(yīng)，而1,2-二氯乙烷(0.216～21.75 mg/L)只有微弱的影響。就氯代烴的結(jié)構(gòu)而言，氯代烯烴的解離常數(shù)變化范圍為0.013～14.111 mg/L，氯代烷烴的解離系數(shù)變化范圍為0.215～278.515 mg/L，說(shuō)明氯代烯烴有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)；而氯原子數(shù)與解離系數(shù)并無(wú)明顯關(guān)系，說(shuō)明氯代烴的飽和程度影響抑制程度。Albanna等[18]以三氯乙烷、三氯乙烯和二氯乙烯的混合物為抑制劑研究不同溫度對(duì)覆蓋土的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示：混合抑制劑的解離常數(shù)的變化范圍為0.088～0.462 mg/L，且隨溫度的增加(5 ℃～35 ℃)抑制效應(yīng)也隨之增加。

表2　競(jìng)爭(zhēng)性抑制擬合結(jié)果

表2(續(xù))

3結(jié)束語(yǔ)

覆蓋土微生物在填埋氣去除，包括甲烷氧化和揮發(fā)性氯代烴等非甲烷有機(jī)物生物降解中起重要作用。本研究表明：對(duì)于甲烷單加氧酶而言，甲烷和多種氯代烴之間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，這對(duì)于強(qiáng)化不同氯代烴的共代謝生物降解有重要意義。作為復(fù)雜的次生環(huán)境，覆蓋土中微生物種類(lèi)和功能還未得到全部認(rèn)清，已有研究表明[15]：覆蓋土中存在有其他可直接降解氯代烴的微生物和苯酚羥化酶等共代謝降解酶，也說(shuō)明氯代烴對(duì)于覆蓋土微生物不只有一種存在形式。充分認(rèn)識(shí)氯代烴在微生物中與酶的結(jié)合形式及多種抑制形式的主導(dǎo)機(jī)制，對(duì)于從分子水平調(diào)控覆蓋層中氯代烴的生物降解有指導(dǎo)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]SEMRAU J D.Current knowledge of microbial community structures in landfills and its cover soils[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011(6)：89961-89969.

[2]邢志林,趙天濤,陳新安,等.覆蓋層氧氣消耗通量模型及甲烷氧化能力預(yù)測(cè)[J].化工學(xué)報(bào),2015(3):1117-1125.

[3]SCHEUTZ C,MOSBAK H,KJELDSEN P.Attenuation of methane and volatile organic compounds in landfill soil covers[J].Journal of Environmental Quality,2004,33(1):61-71.

[4]FRANCO T,GIORDANO M,ORLANDO V,et al.Degradation of c2-c15 volatile organic compounds in a landfill cover soil[J].Sci Total Environ,2008,407(15):13-25.

[5]SAQUING J M,CHANTONH J P,YAZDANI R,et al.Assessing methods to estimate emissions of non-methane organic compounds from landfills[J].Waste Manag,2014,34 (11):2260-2270.

[6]BOGNER J E,CHANTON J P,BLAKE D,et al.Effectiveness of a florida landfill biocover for reduction of ch4 and nmhc emissions[J].Environ Sci Technol,2010,44(4):1197-1203.

[7]LISA A C,Jr SPEITEL G E.Kinetics of aerobic cometabolism of chlorinated solvents[J].Biodegradation,2001,12 (2):105-126.

[8]LIJEFORS T,POVL K L,MADSEN U.Textbook of drug design and discovery[M].[S.l.]:CRC Press,2002.

[9]LAGREGA M D,BUCKINGHAM P L,EVANS J C.Hazardous waste management[M].[S.l.]:Waveland Press,2010.

[10]SILVERMAN R B.The organic chemistry of enzyme-catalyzed reactions[M].[S.l.]:Academic Press,2002.

[11]STRAND S E,STENSEL H D.Kinetics of chlorinated hydrocarbon degradation by suspended cultures of methane-oxidizing bacteria[J].Research Journal of the Water Pollution Control Federation,1990,62 (2):124-129.

[12]AZIZ C,GEORGIOU G,SPEITEL G.Cometabolism of chlorinated solvents and binary chlorinated solvent mixtures using m.Trichosporium ob3b pp358[J].Biotechnology and Bioengineering,1999,65(1):100-107.

[13]ALVAREZ-COHEN L,MCCARTY P L.Product toxicity and cometabolic competitive inhibition modeling of chloroform and trichloroethylene transformation by methanotrophic resting cells[J].Applied & Environmental Microbiology,1991,57(4):1031-1037.

[14]ZHAO T,ZHANG L,ZHANG Y,et al.Characterization of methylocystis strain jta1 isolated from aged refuse and its tolerance to chloroform[J].Journal of Environmental Sciences,2013,25 (4):770-775.

[15]高艷輝,趙天濤,邢志林,等.銅離子對(duì)混合菌群降解三氯乙烯的影響與機(jī)制分析[J].生物工程學(xué)報(bào),2016,32(7):1-14.

[16]LISA A C,MCCARTY P L.Product toxicity and cometabolic competitive inhibition modeling of chloroform and trichloroethylene transformation by methanotrophic resting cells[J].Appl Environ Microbiol,1991,57(4):1031-1037.

[17]MCFARLAND M J,VOGEL C M,SPAIN J C.Methanotrophic cometabolism of trichloroethylene (TCE) in a two stage bioreactor system[J].Water Res,1992,26 (2):259-265.

[18]ALBANNA M,WARITH M,FERNANDES L.Kinetics of biological methane oxidation in the presence of non-methane organic compounds in landfill bio-covers[J].Waste Manag,2010,30 (2):219-227.

(責(zé)任編輯何杰玲)

Kinetics of Methane Oxidation by Microorganism in LandfillCoverSoilinthePresenceofChlorinatedHydrocarbons

XING Zhi-lin1a, 2, ZHANG Yun-ru1b, ZHANG Li-jie1b

(1.a.College of Chemistry and Chemical Engineering;b.CollgeofPharmacyandBiologicalEngineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing400054,China;2.UrbanConstructionandEnvironmentalEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing400045,China)

Abstract:Non-methaneorganiccompoundsinlandfillgassuchasvolatilechlorinatedhydrocarbonshadinhibitingeffecttomethaneoxidation.Inhibitionformofcoversoilmicrobemethaneoxidationforvariouschlorinatedhydrocarbonwasinvestigatedbymatchingseveralkineticsequations.Theresultsshowthatthemaininhibitionformbetweenchlorinatedhydrocarbonsandmethaneiscompetitiveinhibition(R2:rangingfrom0.937～0.999).BycalculatingKmIandchlorinatedhydrocarbondissociationconstantsKIundertheconditionofdifferentchlorinatedhydrocarbons,theresultshowsthat1, 1, 2-trichloroethane(KI= 30.111mg/L)and1-chloropropane(KI=24.323mg/L)couldpromotethemethaneoxidation.Competitiveinhibitionofchlorinatedrubber(KI:rangingfrom0.013～14.111mg/L)isbetterthanchlorinatedparaffin(rangingfrom0.215～278.515mg/LofKI).Amongthem,competitiveinhibitioneffectoftetrachloroethyleneisthestrongest(KI= 0.013mg/L).Thestudyprovidesatheoreticalguidanceforstrengtheningofmethaneoxidationandchlorinatedhydrocarbonmetabolicbiodegradationofcoveringlayer.Keywords:coveringlayer;methanotroph;methaneoxidation;chlorohydrocarbon;inhibitionkinetics

收稿日期：2016-01-24

基金項(xiàng)目：重慶市基礎(chǔ)與前沿研究資助項(xiàng)目(cstc2013jcyjA20009)

作者簡(jiǎn)介：刑志林(1988—)，男，博士研究生，主要從事環(huán)境微生物和固廢處理研究； 通信作者 張?jiān)迫?1977—)，女，副教授，主要從事環(huán)境微生物、生化工程等方面的研究。

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.06.014

中圖分類(lèi)號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-8425(2016)06-0083-08

引用格式：刑志林，張?jiān)迫悖?張麗杰.氯代烴存在下覆蓋層微生物甲烷氧化動(dòng)力學(xué)[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2016(6):83-90.

Citationformat：XINGZhi-lin,ZHANGYun-ru,ZHANGLi-jie.KineticsofMethaneOxidationbyMicroorganisminLandfillCoverSoilinthePresenceofChlorinatedHydrocarbons[J].JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience)，2016(6):83-90.