郭勇　王玉成　王智博

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

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一種基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)優(yōu)化1)

郭勇王玉成王智博

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

摘要利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化體系影響因素來確定最佳轉(zhuǎn)化條件。以生長15日齡的擬南芥幼苗為試驗材料，以轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301空載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105為目的菌株進行瞬時轉(zhuǎn)化。研究了吐溫20、菌液OD值、乙酰丁香酮(AS)及轉(zhuǎn)化時間等對擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明：以體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫、菌液OD600值為1.0和120 μmol/L的AS侵染擬南芥2.5 h后，再共培養(yǎng)72 h，能夠得到高瞬時轉(zhuǎn)化效果。

關(guān)鍵詞擬南芥；GUS基因；瞬時表達；實時定量；農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

擬南芥是重要的模式植物，很多植物基因的功能都是通過基因轉(zhuǎn)入擬南芥中進行研究，而轉(zhuǎn)基因又分穩(wěn)定表達與瞬時表達兩種方式[1]，穩(wěn)定表達需要的培養(yǎng)、鑒定時間較長，而與之相比，瞬時表達具有簡單、快捷、周期短、準(zhǔn)確等優(yōu)點[2]，并且表達效率較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高。當(dāng)需要在短時間內(nèi)進行基因功能的分析或者蛋白間的互作以及蛋白與基因間互作等的研究時，瞬時表達的方法可作為一種高效的手段[3]?；谒矔r轉(zhuǎn)化技術(shù)使基因在宿主體內(nèi)瞬時表達，是一種快速的研究基因表達、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及基因間互作的一種重要手段,與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因相比,瞬時表達不需要整合到染色體上，而且瞬時表達還不受基因的位置效應(yīng)和基因沉默的影響，也不會產(chǎn)生可遺傳的子代,生物安全性高[4]。因此,瞬時表達在啟動子功能分析[5-6]、蛋白的表達[7-8]以及蛋白間的互作[9]，外源基因的表達[10-11]以及轉(zhuǎn)基因互補[12-14]、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位[15]、轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的互作[16]等分子生物學(xué)的研究中得以廣泛應(yīng)用，而這些研究都是建立在一個穩(wěn)定、高效的瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)之上的。由于基因槍等方法需要基因槍等貴重儀器，而且在某些植物瞬時表達時就轉(zhuǎn)基因表達的穩(wěn)定性而言,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法比基因槍法具有更大的優(yōu)勢。前人對瞬時表達的研究多致力于煙草等植物，吳英杰等[17]找到了適宜于煙草瞬時轉(zhuǎn)化的優(yōu)良方法，而人們對擬南芥的瞬時轉(zhuǎn)化的研究則相對較少。Mcintosh K B et al.[18]通過真空滲透的方法發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌侵染5 d比侵染3 d的幼苗中基因的表達水平高，Silvina Mangano et al.[19]通過農(nóng)桿菌滲透擬南芥葉片，使含有AS和缺素的培養(yǎng)基長時間浸泡葉片而提高農(nóng)桿菌侵入能力，從而提高了轉(zhuǎn)化效率。在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究中以擬南芥為材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，通過觀察和分析含β-葡糖醛酸酶基因(GUS基因)的pCAMBIA 1301在擬南芥中的表達情況來探索和優(yōu)化擬南芥高效瞬時表達的條件。

1材料與方法

擬南芥野生型苗為哥倫比亞型,由林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))保存。將植物表達載體pCAMBIA1301利用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株。擬南芥的轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，溫室的相對濕度為60%～75%，光照強度為100 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h光照，8 h黑暗，溫度為22 ℃。

1.1菌液的制備及轉(zhuǎn)化條件

挑取農(nóng)桿菌單菌落在10 mL的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)過夜，次日上午將該菌液用新鮮LB稀釋至OD值0.1左右，然后再進行培養(yǎng)，待菌液至OD600為0.6～0.7時，3 000 r/min離心10 min收集菌體，用于擬南芥的瞬時侵染。

分別設(shè)置如下不同處理:

(1)以侵染培養(yǎng)基(1/2MS+120 μmol/L AS+2%蔗糖+270 mmol/L甘露醇+1.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.02%吐溫,pH=5.4)為基本培養(yǎng)基，設(shè)置農(nóng)桿菌侵染的OD600分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2。

(2)以侵染培養(yǎng)基(1/2MS+120 μmol/L AS+2%蔗糖+270 mmol/L甘露醇+1.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.8 OD農(nóng)桿菌,pH=5.4)為基本培養(yǎng)基，最終吐溫20體積占侵染液體積的比例分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.05%。

(3)以侵染培養(yǎng)基(1/2MS+120 μmol/L AS+2%蔗糖+270 mmol/L甘露醇+1.5 mg/LKT+0.5 mg/L NAA+0.02%吐溫+0.8 OD農(nóng)桿菌,pH=5.4)為基本培養(yǎng)基，As的終濃度分別設(shè)置為0、60、120、180 μmol/L。

1.2瞬時轉(zhuǎn)化

先將擬南芥置于蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的1/4MS高滲溶液中25 ℃下浸泡15 min,然后將經(jīng)高滲處理的擬南芥浸泡在不同菌液OD值的侵染液中，25 ℃ 120 r/min培養(yǎng)2.5 h，然后取出，用500 mmol/L的甘露醇洗3 min，再用無菌濾紙吸干葉片表面的液體,置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+120 μmol/L AS+1.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+3%蔗糖，pH=5.4)上，放在(23±2)℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h，然后進行GUS染色分析和實時定量PCR測定，每個試驗3次重復(fù)。

1.3GUS染色

X-GLUC染色液配制(100 mL):200 mmol/L的pH=7.0的磷酸緩沖液50 mL；100 mmol/L的Na2EDTA溶液10 mL；5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]10 mL；5 mmol/L的K4[Fe(CN)6]10 mL；0.1% Triton-100；X-GLUC 60 mg,然后加水定容至100 mL。

待轉(zhuǎn)化72 h后，將侵染處理后的擬南芥苗放入50 mL離心管中，各加入10 mL的GUS染色液浸沒植株，37 ℃恒溫黑暗中染色過夜，再用V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1的脫色液脫色約1 h，其間適時更換脫色液，然后取出觀察染色結(jié)果。

1.4實時定量RT-PCR

總RNA的提取:經(jīng)與1.2同樣的處理，共培養(yǎng)72 h后，取出各組處理苗，無菌水洗凈后用液氮凍起來作為下一步提取總RNA的材料。擬南芥總RNA的提取采用CTAB法。

總RNA反轉(zhuǎn)錄：上一步提取的RNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，再用紫外分光光度計檢測RNA濃度與純度并進行反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：Anchored Oligo(dT)18(0.5 g/L)1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、transcript RT/RI Enzyme Mix 1 μL;Gdna Remover 1 μL;總RNA 1 μg、加無RNase的水到體積20 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作定量PCR模板。

實時定量PCR：分別以上述植物材料提取的cDNA為模板，進行實時定量PCR擴增，檢測瞬時轉(zhuǎn)化入擬南芥的GUS基因的表達情況，并用α-tubulin基因表達量的平均值作為內(nèi)參(所有樣品都進行3次生物學(xué)重復(fù))。基因引物序和內(nèi)參引物序列如下。

基因引物GUS-F：GTCGCGCAAGACTGTAACCA；GUS-R：TGGTTAATCAGGAACTGTTG。內(nèi)參引物為α-tubulin-F：GATGTACCGTGGTGATGTC和α-tubulin-R：GAGCCTCTGAAAATTCTCC。實時定量PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 12 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，80 ℃讀板1 s，共45個循環(huán)。

2結(jié)果與分析

2.1不同農(nóng)桿菌OD值對瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響

農(nóng)桿菌OD值及侵染時間是影響遺傳轉(zhuǎn)化率的重要因子[20]。因此，用不同的農(nóng)桿菌侵染濃度，通過GUS染色和定量PCR來研究轉(zhuǎn)化的GUS基因在宿主中的表達情況。GUS染色和定量PCR結(jié)果表明，不同農(nóng)桿菌OD值對轉(zhuǎn)化效率影響明顯。當(dāng)農(nóng)桿菌侵染OD600值為1.2時，擬南芥GUS染色最淺(圖1)，GUS基因的表達量也最低，說明該菌液OD值條件下擬南芥的瞬時轉(zhuǎn)化效率最低。而農(nóng)桿菌侵染OD600值為0.4時，GUS的染色和定量PCR結(jié)果都顯示其瞬時轉(zhuǎn)化效率較低(圖1)；當(dāng)侵染OD600值為0.8和1.0時，GUS染色和定量PCR都顯示瞬時轉(zhuǎn)化效率明顯提高，定量PCR結(jié)果顯示，當(dāng)侵染OD值為1.0時，瞬時轉(zhuǎn)化效率最高(表1)。

圖1　不同OD值農(nóng)桿菌對瞬時轉(zhuǎn)化擬南芥的GUS染色

農(nóng)桿菌OD值GUS基因相對表達量0.45.3990.814.2891.016.9101.21.000

2.2不同乙酰丁香酮(AS)濃度對擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響

我們對不同濃度AS對擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響進行了研究。如圖2所示，當(dāng)AS濃度為0時，擬南芥的GUS染色顏色最淺，僅有少量葉片染上色，定量PCR結(jié)果表明，其GUS基因的相對表達量也最低(表2)，說明其瞬時轉(zhuǎn)化效率最低。隨著AS的濃度上升，GUS染色和定量PCR結(jié)果都表明其瞬時轉(zhuǎn)化效率在升高，在120 μmol/L時，瞬時轉(zhuǎn)化效率最高，當(dāng)AS為180 μmol/L時，轉(zhuǎn)化效率下降(圖2，表2)。說明，瞬時轉(zhuǎn)化的最佳AS濃度為120 μmol/L,與煙草的最適AS濃度接近[17]。

1～4.AS濃度分別為0、60、120、180 μmol/L的GUS基因的染色情況。

AS濃度/μmol·L-1GUS基因相對表達量 01.000605.82712013.98718011.002

2.3不同體積分?jǐn)?shù)吐溫對瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響

本研究對不同體積分?jǐn)?shù)的吐溫對擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響進行了研究。結(jié)果如圖3、表3所示，當(dāng)吐溫體積分?jǐn)?shù)在0.01%時，擬南芥GUS的染色最淺，且僅有少量葉片染上色，當(dāng)吐溫體積分?jǐn)?shù)升高時，GUS的染色加深，基因表達量也持續(xù)升高，當(dāng)吐溫體積分?jǐn)?shù)在0.05%時，GUS染色的藍色最深，大部分葉片為深藍色，并且基因的相對表達量也最高，與染色結(jié)果相一致。因此，吐溫體積分?jǐn)?shù)為0.05%時為最佳的轉(zhuǎn)化濃度。

1～4分別為吐溫體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.02%、0.03%、0.05%時對轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色情況。

表3不同體積分?jǐn)?shù)的吐溫對轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS基因的表達情況

吐溫體積分?jǐn)?shù)/%GUS基因相對表達量0.011.0000.023.8210.0323.6160.0557.348

2.4各種最優(yōu)條件下瞬時轉(zhuǎn)化的效率研究

上述各組試驗結(jié)果得出的最適吐溫體積分?jǐn)?shù)0.05%、乙酰丁香酮120 μmol·L-1和菌液OD600值1.0，在各組的處理中GUS染色最深，基因的表達量也最高。為了進一步的驗證，我們又以體積分?jǐn)?shù)0.05%的吐溫、OD600值為1.0的菌液OD值和120 μmol/L AS的處理作了同樣的瞬時表達試驗，結(jié)果如圖4和表4所示，該組合處理的擬南芥GUS染色最深，基因的表達量也最高，瞬時轉(zhuǎn)化效率最高。

1為農(nóng)桿菌OD值0.8，AS濃度120 μmol/L,吐溫體積分?jǐn)?shù)0.05%；2為農(nóng)桿菌OD值0.8，AS濃度120 μmol/L,吐溫體積分?jǐn)?shù)0.02%；3為農(nóng)桿菌OD值1.0，AS濃度120 μmol/L,吐溫體積分?jǐn)?shù)0.02%；4為農(nóng)桿菌OD值1.0，AS濃度120 μmol/L,吐溫體積分?jǐn)?shù)0.05%。

圖4.不同組合處理對轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色影響

3結(jié)論與討論

本研究通過GUS染色和檢測GUS基因表達來研究瞬時轉(zhuǎn)化的效率,并比較單一因素對擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響，進而對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化方法作進一步的優(yōu)化。在瞬時轉(zhuǎn)化過程中用于侵染的菌液OD600值、AS濃度和吐溫的體積分?jǐn)?shù)都對瞬時轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生明顯影響，說明這些因素的優(yōu)化對瞬時轉(zhuǎn)化效率的提高至關(guān)重要。根癌農(nóng)桿菌作為瞬時侵染的媒介，菌液的濃度直接決定了轉(zhuǎn)化效率的高低，當(dāng)菌液OD值過低時，攜帶目的基因的農(nóng)桿菌進入植物細(xì)胞的數(shù)量會很低，目的基因的表達量也會較低，因此菌液OD600值太低的侵染液轉(zhuǎn)化效率也相應(yīng)的低，而當(dāng)菌OD值過高時，則會對植物體造成傷害，反而使轉(zhuǎn)化效率降低。在一定的濃度范圍內(nèi)，乙酰丁香酮(AS)可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌體內(nèi)基因活化，從而促進外源基因的整合，而提高瞬時轉(zhuǎn)化效率，但當(dāng)其濃度過高時，也會影響植物細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)，對細(xì)胞造成脅迫而使轉(zhuǎn)化效率降低。吐溫作為一種滲透劑，有助于根癌農(nóng)桿菌侵入植物組織中，從而一定程度上提高基因的轉(zhuǎn)化效率。高體積分?jǐn)?shù)的吐溫有助于提高轉(zhuǎn)化效率，但也對外植體產(chǎn)生明顯的傷害，使外植體在浸泡過程中萎蔫。在試驗的過程中，由于擬南芥這種植物比較脆弱，當(dāng)采用高體積分?jǐn)?shù)(體積分?jǐn)?shù)為0.06%及以上)的吐溫時，會導(dǎo)致擬南芥在侵染或者在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過程中萎焉或死亡，而當(dāng)吐溫體積分?jǐn)?shù)為0.05%時，擬南芥的瞬時轉(zhuǎn)化效率已經(jīng)非常高，能夠滿足試驗對瞬時轉(zhuǎn)化效率的要求，故吐溫體積分?jǐn)?shù)不宜過高。

擬南芥作為一種模式植物，在分子生物學(xué)研究中具有重要地位，但目前擬南芥主要是通過浸花法進行的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，而對其瞬時轉(zhuǎn)化的研究較少。瞬時轉(zhuǎn)化具有時間短，表達效率高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于蛋白的亞細(xì)胞定位[15]，蛋白與蛋白間互作[9]，蛋白與DNA間的互作、目的蛋白的表達與制備[7-8]等。因此，本研究為以擬南芥為宿主的這些研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimizing Transient Genetic Transformation Method onArabidopsisPlants Mediated byAgrobacteriumtumefaciens

Guo Yong, Wang Yucheng, Wang Zhibo

(State Key Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(6)：41-44，83.

We studied the optimal transformation conditions for transient genetic transformation ofArabidopsismediated byAgrobacteriumtumefaciens. We transformed Agrobacterium EHA105 carrying an empty pCAMBIA1301 into the 15-day Arabidopsis plants for genetic transformation research. We studied the effects on transient expression including the concentration of theAgrobacterium, Tween-20, and acetosyringone (AS), and transformed time. Under the conditions of 1.0 OD ofAgrobacterium, 0.05% of Tween-20, 120 μmol/L of AS, transformed for 2.5 hours, and co-cultured for 3 days, the transient transformation efficiency is highest.

KeywordsArabidopsisthaliana;GUSgene; Transient expression; Real-time quantitative;Agrobacteriummediated transformation

第一作者簡介：郭勇，男，1990年2月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail：feiyongzhe123656@163.com。 通信作者：王玉成,林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail：wangyucheng1029@126.com。

收稿日期：2015年12月7日。

分類號Q786

1)哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金(優(yōu)秀學(xué)科帶頭人)項目(2012RFXXN023)。

責(zé)任編輯：潘華。