張彩云　朱麗華　談家金　陳婷婷　潘珺　梁芬　葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

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抗松針褐斑病濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生1)

張彩云朱麗華談家金陳婷婷潘珺梁芬葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

摘要為將抗松針褐斑病濕地松(PinuselliottiiEngelm.)良種快速推廣，以未成熟合子胚為外植體，研究了合子胚發(fā)育階段對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)以及ABA與PEG8000對(duì)體細(xì)胞胚成熟的影響，并探討了體細(xì)胞胚質(zhì)量及干化條件對(duì)體細(xì)胞胚萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：發(fā)育至2～4階段的合子胚最利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，LP+16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG8000+2 g·L-1AC適合于體細(xì)胞胚的成熟，高質(zhì)量體細(xì)胞胚經(jīng)“濾紙容器法”干化2周后萌發(fā)，萌發(fā)的體細(xì)胞胚于1/4WPM+0.3 mg·L-1NAA+1 mg·L-1IBA上培養(yǎng)70 d左右根部發(fā)育，轉(zhuǎn)入1/2WPM中，30 d左右側(cè)根產(chǎn)生發(fā)育完整的再生植株。

關(guān)鍵詞抗性濕地松；未成熟合子胚；體細(xì)胞胚胎發(fā)生；植株再生

濕地松原產(chǎn)美國(guó)東南部，我國(guó)于20世紀(jì)30年代引種，由于其適應(yīng)性強(qiáng)、早期生長(zhǎng)快、松脂產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)南方主要造林樹(shù)種之一。然而，自1978年我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)松針褐斑病(Lecanostictaacicola)以來(lái)，該病害使?jié)竦厮稍谖覈?guó)的發(fā)展受到較大影響[1]。系統(tǒng)研究認(rèn)為，抗病單株選擇是防治該病害較有前途的方法[2]。自1982年開(kāi)始，葉建仁等[3-4]從重感病林分中篩選抗病優(yōu)樹(shù)建立了抗病種植園。但抗病種子產(chǎn)量有限，且無(wú)性繁殖困難，很難在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化，阻礙了抗病良種的推廣和應(yīng)用。

植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic embryogenesis)是指體細(xì)胞在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過(guò)與合子胚發(fā)生類(lèi)似的途徑發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程[5]，具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點(diǎn)[6]。對(duì)于生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)的松屬樹(shù)種而言，體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑可形成產(chǎn)量高、穩(wěn)定性強(qiáng)、性狀均勻的再生植株，是最有希望大規(guī)?？焖俜敝沉帜緝?yōu)良無(wú)性系的組培快繁技術(shù)[7-8]。目前關(guān)于濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究報(bào)道較多。Jain et al.[9-10]首次進(jìn)行了濕地松未成熟合子胚的離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性愈傷組織并獲得早期體細(xì)胞胚。1995年，Liao et al.[11-12]獲得了濕地松體細(xì)胞胚胎再生植株，但植株再生率極低。1997年唐巍等[13]亦獲得濕地松體細(xì)胞胚再生植株，植株轉(zhuǎn)化率為15.6%。本課題組自2003年開(kāi)始進(jìn)行濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究，成功誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，建立了穩(wěn)定的胚性細(xì)胞系，但僅獲得少量再生植株。吳麗君等[14]對(duì)濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，目前僅獲得成熟子葉胚。已有研究結(jié)果表明，濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生目前尚存在胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、體細(xì)胞胚胎成熟困難和萌發(fā)率低等問(wèn)題。

本文以抗松針褐斑病濕地松(以下簡(jiǎn)稱(chēng)抗性濕地松)未成熟合子胚為外植體，研究了合子胚發(fā)育階段對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)、以及ABA與PEG8000對(duì)體細(xì)胞胚成熟的影響，并探討了體細(xì)胞胚質(zhì)量和干化條件對(duì)萌發(fā)的影響，建立了抗性濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生體系，旨在為抗性濕地松良種的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1外植體材料的獲取與處理

2014年6—7月，采取定點(diǎn)定株分批采集(每周1次)的方法，于福建華安西坡國(guó)有林場(chǎng)12年生濕地松抗病種子園進(jìn)行未成熟球果采集，共涉及7#、13#、14#、16#、27#5個(gè)家系。采集的球果放冰箱中4 ℃保存。1周后，參照李清清等[15]的方法進(jìn)行種子剝?nèi)〖跋咎幚?，獲得無(wú)菌雌配子體。

1.2抗性濕地松合子胚發(fā)育階段觀察

為研究抗性濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與合子胚發(fā)育階段的相關(guān)性，對(duì)6個(gè)采集期所采集球果的合子胚發(fā)育階段進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)家系、每個(gè)采集期隨機(jī)抽取3個(gè)球果，每個(gè)球果剝?nèi)?個(gè)未成熟種子，在體視鏡(Leica MZ16)下觀察合子胚的發(fā)育階段并拍照。參照Pullman[16]火炬松合子胚發(fā)育階段劃分標(biāo)準(zhǔn)判斷不同家系、不同采集期合子胚的發(fā)育階段。

1.3抗性濕地松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將不同批次采集的未成熟合子胚接種于LP+2 mg·L-12,4-D+16 mg·L-1ABA+2.5 mg·L-1KT+30 g·L-1麥芽糖+6.5 g·L-1瓊脂(北京鼎國(guó)盛昌生物技術(shù)有限公司)培養(yǎng)基上。每處理接種20個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)狀況。胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=(胚性愈傷組織數(shù)量/接種外植體數(shù)量)×100%。

1.4抗性濕地松胚性愈傷組織的增殖及其細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基(誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素和糖減半)上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。每15 d夾取直徑約6～8 mm胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)(Embryogenic Suspenser Mass-ESM)于新鮮增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。取增殖階段的胚性材料，經(jīng)醋酸楊紅—伊文斯藍(lán)染色，于蔡司體視鏡(SteREO Discovery.V20)下進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察。

1.5抗性濕地松體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法

以7#-15為試驗(yàn)材料，經(jīng)7個(gè)月增殖培養(yǎng)，選取狀態(tài)良好的ESM轉(zhuǎn)入以LP為基本培養(yǎng)基，添加ABA質(zhì)量濃度4、8、16、32 g·L-1，PEG8000質(zhì)量濃度150、170、180、190、210 g·L-1，植物凝膠3 g·L-1的成熟培養(yǎng)基上，60 d后觀察體細(xì)胞胚的成熟狀況。

每塊愈傷組織(直徑10 mm)形成體細(xì)胞胚數(shù)量=體細(xì)胞胚數(shù)量/愈傷組織數(shù)量。

1.6抗性濕地松體細(xì)胞胚的萌發(fā)

比較了完全干化與半干化(脫脂棉法和濾紙容器法)處理對(duì)體細(xì)胞胚胎萌發(fā)的影響。完全干化指將發(fā)育狀態(tài)良好的成熟體細(xì)胞胚放入空培養(yǎng)皿中。半干化處理中，脫脂棉法指將成熟體細(xì)胞胚置于5 mm厚的脫脂棉上，再將脫脂棉放入培養(yǎng)皿中，每皿加無(wú)菌水；濾紙容器法則將成熟體細(xì)胞胚放置于墊有1層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，再將該培養(yǎng)皿置于更大的培養(yǎng)皿(直徑13 cm)內(nèi)，大培養(yǎng)皿中加無(wú)菌水。

經(jīng)濾紙容器法干化2周后，選取長(zhǎng)度(2～3、3～4、4～5 mm)、直徑(0～1.0、1.0～1.5、1.5～2.0 mm)和子葉個(gè)數(shù)(2、3、4、5、6個(gè)以上)不同的成熟胚分別接種于1/2GD[11-13]培養(yǎng)基中，比較成熟胚質(zhì)量對(duì)萌發(fā)的影響。

以上萌發(fā)試驗(yàn)每處理20個(gè)外植體，重復(fù)3次，2周后統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚萌發(fā)狀況。萌發(fā)率=(萌發(fā)體細(xì)胞胚數(shù)量/接種體細(xì)胞胚數(shù)量)×100%。其中，萌發(fā)體胚個(gè)數(shù)包括胚軸與子葉伸長(zhǎng)的體細(xì)胞胚數(shù)量，以及胚軸、子葉與根共同伸長(zhǎng)的體細(xì)胞胚數(shù)量。

1.7抗性濕地松體細(xì)胞胚植株再生

體細(xì)胞胚萌發(fā)2周后將其轉(zhuǎn)入1/4WPM+0.15 mg·L-1NAA+1 mg·L-1IBA+10 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇培養(yǎng)基中使其生根，光照培養(yǎng)70 d后統(tǒng)計(jì)再生植株數(shù)量。

1.8培養(yǎng)條件

除非特別說(shuō)明，以上所有培養(yǎng)基中均添加3.4 mg·L-1硝酸銀，5 mg·L-1抗壞血酸，1 g·L-1肌醇，450 mg·L-1谷氨酰胺(Glu)，500 mg·L-1水解酪蛋白(CH)，250 mg·L-1的2-(N-嗎啡啉)，乙磺酸(MES)，pH=5.8。

愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、成熟和干化處理均為暗培養(yǎng)；體細(xì)胞胚萌發(fā)與植株再生培養(yǎng)每日光照16 h，培養(yǎng)溫度(23±1)℃。

數(shù)據(jù)處理采用Excel。

2結(jié)果與分析

2.1抗性濕地松合子胚的發(fā)育

根據(jù)Pullman[16]的火炬松合子胚發(fā)育階段劃分標(biāo)準(zhǔn)，將抗病濕地松合子胚的發(fā)育劃分為8階段(圖1)。第1階段合子胚絲狀透明，可見(jiàn)明顯胚頭(圖1A)；第2階段合子胚透明，多個(gè)胚在增殖和發(fā)育，為裂生多胚階段(圖1B)；第3階段一個(gè)合子胚的胚頭明顯伸長(zhǎng)，其余胚頭開(kāi)始退化，胚柄也明顯縮短、變粗，胚頭逐漸變?yōu)榘咨?，不透?圖1C)；第4階段胚頭乳白色，不透明；開(kāi)始發(fā)育為圓筒狀(圖1D)；第5階段合子胚胚頭頂端可見(jiàn)突起的頂端分生組織，形似子彈頭，也成子彈頭階段(圖1E)；第6階段合子胚胚頭頂端子葉組織發(fā)育，可見(jiàn)突起的子葉(圖1F)；第7階段合子胚胚頭子葉組織發(fā)育(圖1G)；第8階段子葉繼續(xù)伸長(zhǎng)，彎曲開(kāi)始張開(kāi)(圖1H)。對(duì)5個(gè)家系6個(gè)采集期的合子胚進(jìn)行隨機(jī)抽樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明同一時(shí)期不同家系合子胚發(fā)育階段有一定的差異，同一球果不同部位的合子胚發(fā)育階段也有一定的差異。這可能與當(dāng)年的氣候、球果授粉時(shí)間，以及接受光照條件不同有關(guān)。不同采集期未成熟合子胚的形態(tài)特征同樣有所差異。

A為第1階段；B為第2階段；C為第3階段；D為第4階段；E為第5階段；F為第6階段；G為第7階段；H為第8階段。

2.2抗性濕地松合子胚發(fā)育階段與胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的關(guān)系

將雌配子體放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基2周后，雌配子體膨脹，部分外植體珠孔端產(chǎn)生白色半透明的胚性愈傷組織(圖2A)。合子胚發(fā)育階段對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)有著至關(guān)重要的作用。從表1可知，除了家系27#在6月25日合子胚發(fā)育1～3階段誘導(dǎo)率最高外，其余3個(gè)家系在7月2日即合子胚發(fā)育的第2～4階段(即多胚階段)誘導(dǎo)率較高，其中7#、13#、16#、27#胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均達(dá)到5%以上，且胚性愈傷組織狀態(tài)良好。隨著合子胚發(fā)育逐漸成熟，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率也逐漸下降；發(fā)育后期的合子胚未能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。因此，對(duì)于大多數(shù)家系而言，發(fā)育至2～4階段的合子胚為胚性愈傷組織誘導(dǎo)的適合外植體。

表1合子胚發(fā)育階段與不同家系抗性濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)性

發(fā)育階段采集日期誘導(dǎo)率/%7#13#14#16#27#1～36月25日2.264.2602.1410.092～47月2日5.565.4805.336.172～57月9日5.041.5901.672.353～57月16日2.830001.044～87月23日01.010005～97月30日00000

2.3胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)

誘導(dǎo)出的ESM直徑約5～81 mm時(shí)，轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)(圖2B)。經(jīng)4次繼代后，在所轉(zhuǎn)接繼代的69個(gè)細(xì)胞系中，僅7#-1、7#-2、7#-11、7#-15、13#-1、27#-2和27#-5,7個(gè)細(xì)胞系進(jìn)入穩(wěn)定增殖狀態(tài)，其余的或增殖緩慢，或褐化死亡。取少量增殖狀態(tài)良好的胚性愈傷組織用醋酸洋紅和伊文思藍(lán)雙染色法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，ESM由長(zhǎng)的胚柄細(xì)胞和圓的胚性細(xì)胞組成，通常胚性細(xì)胞被醋酸洋紅溶液染成紅色，胚柄細(xì)胞被伊文思藍(lán)溶液染成藍(lán)色(圖2C)。

2.4抗性濕地松體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)

將增殖狀態(tài)良好的ESM，分別轉(zhuǎn)入含有不同質(zhì)量濃度的ABA、PEG8000及活性炭的成熟培養(yǎng)基上，30 d左右在胚性愈傷組織上可觀察到明顯的胚頭產(chǎn)生(圖2D)，60 d后可見(jiàn)子葉張開(kāi)的體細(xì)胞胚(圖2E)。ABA和PEG質(zhì)量濃度對(duì)體細(xì)胞胚形成有較大影響。由表2可知，ABA為16 mg·L-1時(shí)每塊愈傷組織上獲得的成熟子葉胚最多，ABA過(guò)高或較低形成的體細(xì)胞胚數(shù)量較少，質(zhì)量也降低。PEG8000質(zhì)量濃度為150 g·L-1時(shí)每塊愈傷組織上只有少量成熟體細(xì)胞胚形成；隨著PEG的升高，成熟胚數(shù)量增加，PEG8000質(zhì)量濃度為170～190 g·L-1每塊可獲得15個(gè)左右的成熟體細(xì)胞胚，高于190 g·L-1后隨著PEG質(zhì)量濃度增加，子葉胚數(shù)量逐漸減少。因此，16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG8000最利于體細(xì)胞胚的分化。在該質(zhì)量濃度組合下，長(zhǎng)度在3～4 mm的體細(xì)胞胚居多，利于后期體胚的萌發(fā)與植株再生。

2.5干化處理對(duì)抗性濕地松體細(xì)胞胚萌發(fā)的影響

干化處理對(duì)體細(xì)胞胚萌發(fā)有很大影響(表3)，未經(jīng)干化處理的體細(xì)胞胚發(fā)育畸形率達(dá)64%，萌發(fā)率僅10%；完全干化的體胚由于失水嚴(yán)重大部分變硬，轉(zhuǎn)至萌發(fā)培養(yǎng)基上不發(fā)育，萌發(fā)率為8%；半干化處理中“濾紙容器法”更利于體胚達(dá)到生理成熟和后期的萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)71%；“脫脂棉法”由于濕度不好控制，體胚一半發(fā)育畸形，同時(shí)由于干化過(guò)程中體胚發(fā)育伸長(zhǎng)在夾取時(shí)，脫脂棉會(huì)纏繞在體胚上，影響操作和體胚完整。

表2　ABA和PEG8000對(duì)體細(xì)胞胚成熟的影響

表3　不同干化處理后體細(xì)胞胚表現(xiàn)及對(duì)萌發(fā)的影響

2.6體細(xì)胞胚的質(zhì)量對(duì)萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，體細(xì)胞胚的質(zhì)量對(duì)其后期萌發(fā)有很大影響。直徑1.0～1.5 mm、長(zhǎng)3.0～4.0 mm的體細(xì)胞胚萌發(fā)率最高，畸形苗與死亡率最低，體細(xì)胞胚長(zhǎng)度越短、直徑越小越不易萌發(fā)，但過(guò)長(zhǎng)(過(guò)大)畸形苗的概率升高(表4)；體細(xì)胞胚的子葉數(shù)量也對(duì)體胚萌發(fā)有一定的影響，具3～5個(gè)子葉的成熟胚萌發(fā)率最高，也不易產(chǎn)生畸形苗；子葉多于6個(gè)時(shí)多產(chǎn)生腫大，胚軸不能伸長(zhǎng)的畸形苗；子葉少于3個(gè)的體胚多不發(fā)育且死亡率較高。體細(xì)胞胚長(zhǎng)度在3.0～4.0 mm，平均直徑在1.5～2.0 mm，子葉個(gè)數(shù)在3～5個(gè)時(shí)，體胚萌發(fā)能力最強(qiáng)，萌發(fā)率最高。

表4　體細(xì)胞胚胎質(zhì)量對(duì)體細(xì)胞胚萌發(fā)的影響

不同體胚寬度成熟子葉胚萌發(fā)率/%>1.0～1.5mm>1.5～2.0mm不同體胚寬度成熟子葉胚畸形率/%>1.0～1.5mm>1.5～2.0mm不同體胚寬度成熟子葉胚死亡率/%>1.0～1.5mm>1.5～2.0mm7240834816

不同子葉數(shù)量成熟子葉胚萌發(fā)率/%2個(gè)3個(gè)4個(gè)5個(gè)6個(gè)以上不同子葉數(shù)量成熟子葉胚畸形率/%2個(gè)3個(gè)4個(gè)5個(gè)6個(gè)以上不同子葉數(shù)量成熟子葉胚死亡率/%2個(gè)3個(gè)4個(gè)5個(gè)6個(gè)以上1872766610301064603812102218

注：成熟子葉胚外植體數(shù)量為60個(gè)。

2.7植株再生

經(jīng)過(guò)2周萌發(fā)培養(yǎng)后，僅有少部分體細(xì)胞胚在萌發(fā)過(guò)程根部發(fā)育；大部分體細(xì)胞胚胚軸伸長(zhǎng)，子葉逐漸張開(kāi)，但根部未能發(fā)育(圖2F)。將根部未發(fā)育的體胚轉(zhuǎn)入1/4WPM+0.15 mg·L-1NAA+1 mg·L-1IBA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，70 d后，70%的體細(xì)胞胚胚根端長(zhǎng)出白色根尖(圖2G),將產(chǎn)生根尖的體胚苗轉(zhuǎn)入1/2WPM中，30 d左右，側(cè)根產(chǎn)生，形成完整植株。

3結(jié)論與討論

胚性愈傷組織的獲得是體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵，以針葉樹(shù)未成熟的合子胚為材料可以顯著提高胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。Tautorus et al.[17]報(bào)道黑云杉未成熟合子胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率比貯藏13 a的成熟合子胚高57%；呂守芳等[18]以日本落葉松(Larixkaempferi)未成熟胚、成熟胚、胚根和胚軸等為外植體進(jìn)行體胚研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有未成熟合子胚能夠誘導(dǎo)出胚性愈傷組織;吳麗君等[19]認(rèn)為火炬松(Pinustaeda)2～4階段的合子胚是胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體。赤松[20]、落葉松[21]和興安落葉松[22]等樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生中也有類(lèi)似結(jié)果。本試驗(yàn)亦證明濕地松2～4階段合子胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，隨著合子胚逐漸發(fā)育成熟，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率急劇降低。

A.誘導(dǎo)2周后珠孔端產(chǎn)生的胚性愈傷組織;B.胚性愈傷組織的增殖;C.經(jīng)醋酸洋與伊文思藍(lán)染色后的ESM;D.LP+16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG8000培養(yǎng)基上30 d后形成體細(xì)胞胚;E.成熟培養(yǎng)60 d后的體細(xì)胞胚;F.體細(xì)胞胚的萌發(fā);G-H.完整的體細(xì)胞胚植株。

圖2抗性濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程

影響針葉樹(shù)胚性愈傷組織分化產(chǎn)生體細(xì)胞胚的因素很多，如培養(yǎng)基滲透壓、激素種類(lèi)和質(zhì)量濃度、基因型等，其中脫落酸(ABA)是最為關(guān)鍵的因素。ABA的主要作用是促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟，防止畸形胚及裂生多胚的產(chǎn)生，而且有利于提高體細(xì)胞胚的質(zhì)量，對(duì)抑制體細(xì)胞胚提前萌發(fā)也有重要作用[23]。大量研究表明ABA在分化過(guò)程中和聚乙二醇(PEG)聯(lián)合使用，可以顯著促進(jìn)針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的成熟[24]。PEG作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，使待分化細(xì)胞處于相對(duì)適中的滲透環(huán)境中，從而有利于體細(xì)胞胚的分化。ABA與PEG質(zhì)量濃度不同對(duì)體胚成熟的影響不同。Pullman等[23]研究表明，5 mg·L-1ABA與13% PEG組合可獲得最多體細(xì)胞胚，且其質(zhì)量最高。當(dāng)ABA濃度為30 μmol/L時(shí)濕地松成熟體細(xì)胞胚數(shù)量最多且質(zhì)量也最好[12]。唐巍[13]和吳麗君[14]等在濕地松體胚發(fā)生研究中得出的最佳分化質(zhì)量濃度分別為4 mg·L-1ABA+0.75% PEG和70 mg·L-1ABA+150 g·L-1PEG 8000。本試驗(yàn)中體細(xì)胞胚分化成熟的最適宜質(zhì)量濃度組合為16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG 8000。不同試驗(yàn)所得出的結(jié)果不盡相同，可能與樹(shù)種、產(chǎn)地、基因型、樹(shù)齡、試劑使用方式等諸多因素有關(guān)。

在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中，體細(xì)胞胚的大量正常萌發(fā)，是實(shí)現(xiàn)體胚苗工廠化生產(chǎn)的關(guān)鍵。適當(dāng)?shù)母苫幚砜梢源偈贵w細(xì)胞胚由形態(tài)成熟向生理成熟轉(zhuǎn)變，提高體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和質(zhì)量[25]。Harry等[26]對(duì)紅云杉體細(xì)胞胚分別干化處理3和6 d后，體細(xì)胞胚的萌發(fā)率分別為94%和85%，而對(duì)照只有48%。張建偉[27]在研究粗枝云杉體胚萌發(fā)前的干化調(diào)控機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，未干化處理和干化處理2周后體胚萌發(fā)率分別為4.67%和56.83%。本試驗(yàn)中，未經(jīng)干化處理的體細(xì)胞胚萌發(fā)率極低或不能正常萌發(fā)，適當(dāng)?shù)母苫幚順O顯著地促進(jìn)了體細(xì)胞胚的萌發(fā)，體細(xì)胞的萌發(fā)率由10%提到到71%。因此，體細(xì)胞胚萌發(fā)前進(jìn)行適當(dāng)干化處理對(duì)其后期萌發(fā)至關(guān)重要。

體細(xì)胞胚的質(zhì)量直接影響體細(xì)胞胚的萌發(fā)。高質(zhì)量的黑松體胚能提高體胚的萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)成熟子葉胚長(zhǎng)度在3.0～4.0 mm，直徑在1.5～2.0 mm，子葉數(shù)在3～5個(gè)的體胚萌發(fā)能力最好，萌發(fā)率最高。本研究獲得的成熟體胚子葉數(shù)大多數(shù)在3～5個(gè)，但濕地松實(shí)生苗的子葉個(gè)數(shù)一般在6～9個(gè)，體胚苗后期生長(zhǎng)是否存在差異，需要后期繼續(xù)研究。

體細(xì)胞胚萌發(fā)與植株再生條件的調(diào)節(jié)有利于提高體細(xì)胞胚的產(chǎn)量和植株再生率。齊力旺等[28]在萌發(fā)培養(yǎng)基中附加低質(zhì)量濃度的IBA和NAA明顯促進(jìn)華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)體細(xì)胞胚根的發(fā)生。本試驗(yàn)中，植株再生培養(yǎng)基添加1 mg·L-1IBA和0.3 mg·L-1NAA有利于促進(jìn)根的發(fā)生和子葉伸長(zhǎng)。

綜上，本研究以抗性濕地松未成熟合子胚為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)獲得了優(yōu)質(zhì)胚性愈傷組織，成功建立了濕地松體細(xì)胞胚成熟、萌發(fā)與植株再生體系，獲得了完整的再生植株，為抗性濕地松良種的推廣打下基礎(chǔ)。

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Somatic Embryogenesis and Plantlet Regeneration of Disease-resistant Slash Pine (PinuselliottiiEngelm.) to Brown Spot Needle Blight

Zhang Caiyun, Zhu Lihua, Tan Jiajin, Chen Tingting, Pan Jun, Liang Fen, Ye Jianren

(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(6)：17-22.

In order to accelerate the propagation of slash pine (PinuselliottiiEngelm.) resistant to brown spot needle blight caused byLecanostictaacicola, we studied the effects of development of zygotic embryo on embryocenic tissue initiation as well as the effects of ABA and PEG8000 on the maturation of somatic embryos by using the immature zygotic embryos as explants. We also discussed the impact of quality of somatic embryo and drying approaches on germination of somatic embryo. The immature zygotic embryos developed at Stage 2-4 were optimal for induction of embryonic callus. The LP medium supplemented with 16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG8000+2 g·L-1activated charcoal benefited for maturation of somatic embryos. Somatic embroy germination was accomplished by a partial desiccation treatment (paper vessel method) for two weeks by using high quality somatic embryos. The root development after 70 days on 1/4WPM medium supplemented with 0.3 mg·L-1NAA+1 mg·L-1. The germinated somatic embryos developed into whole plants after 30 d in 1/2WPM.

KeywordsDisease-resistant slash pine; Immature zygotic embryos; Somatic embryogenesis; Plant regeneration

第一作者簡(jiǎn)介：張彩云，女，1990年5月，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 碩士研究生。E-mail:1039417962@qq.com。 通信作者：談家金，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:tanjiajin@tom.com。

收稿日期：2015年10月28日。

分類(lèi)號(hào)S76

1)國(guó)家“十二五”科技支撐項(xiàng)目(2012-2016)(2012BAD19B0703)；江蘇省生物學(xué)和林學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目(PAPD)。

責(zé)任編輯：潘華。