梁　簫，張　顯，閆應(yīng)朋，劉志強，邱高峰

（上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海201306）

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用3種方法提取中華絨螯蟹卵巢總蛋白效果的比較

梁簫，張顯，閆應(yīng)朋，劉志強，邱高峰

（上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海201306）

摘要：為了探尋適于中華絨螯蟹Eriocheirsinensis卵巢蛋白質(zhì)組學(xué)研究的總蛋白最佳提取方法，采用RC DC Protein Assay檢測蛋白濃度、SDS-PAGE分析蛋白組成等，比較分析了用裂解液法Ⅰ、裂解液法Ⅱ和TCA/丙酮沉淀法提取中華絨螯蟹卵巢蛋白的效果。結(jié)果表明：應(yīng)用3種方法提取的卵巢總蛋白濃度分別為15.59、13.05、0.65 mg/mL，用裂解液法提取的效果最佳，而TCA/丙酮沉淀法不適合用于中華絨螯蟹卵巢總蛋白的提?。籗DS-PAGE電泳圖譜進(jìn)一步顯示，用裂解液法Ⅱ提取的蛋白樣品組成較為豐富，且重復(fù)性好，比較適合后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。該研究結(jié)果可為中華絨螯蟹卵巢發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹；卵巢；蛋白質(zhì)；提取方法；SDS-PAGE

中華絨螯蟹Eriocheir sinensis俗稱河蟹，分布于朝鮮半島西海岸和中國渤海、黃海、東海沿岸諸?。?］。因其生長快速、體態(tài)豐腴、肉質(zhì)細(xì)嫩、個大味美，且具有很高的食用與經(jīng)濟價值，已成為中國重要的淡水蟹類養(yǎng)殖品種。

近年來，隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大及其產(chǎn)量的提高，在養(yǎng)殖生產(chǎn)實際中出現(xiàn)了性早熟等問題［2］，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)者的經(jīng)濟收益。因此，充分了解雌蟹卵巢發(fā)育的規(guī)律及其分子機制具有重要的意義。然而以往的研究，多是從組織學(xué)以及細(xì)胞學(xué)角度研究中華絨螯蟹卵母細(xì)胞的發(fā)育與成熟［3］，對于其卵巢發(fā)育成熟過程分子機制的研究非常有限［4］。筆者所在團隊在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)了許多與性腺發(fā)育相關(guān)的基因［4］，為從基因水平研究中華絨螯蟹性腺發(fā)育奠定了良好的基礎(chǔ)。作為基因功能的執(zhí)行者與體現(xiàn)者，蛋白質(zhì)能直接、客觀地反映生命機體的變化。通過研究中華絨螯蟹卵巢蛋白質(zhì)組，可以了解卵巢發(fā)育過程中有哪些蛋白發(fā)生變化以及是否參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程，這將為研究中華絨螯蟹卵巢發(fā)育成熟分子機制提供有力的依據(jù)。目前，關(guān)于中華絨螯蟹卵巢蛋白質(zhì)組的研究尚未見報道，有關(guān)其他水產(chǎn)動物卵巢蛋白質(zhì)組的研究也不多見［5］。對于蛋白質(zhì)組學(xué)研究來說，成功制備蛋白樣品是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提條件。中華絨螯蟹的卵巢生化組分復(fù)雜，尤其是在卵黃大量積累的階段，脂肪等胚胎發(fā)育的所需物質(zhì)也會大量積累［6］，這些物質(zhì)會對其總蛋白提取及純化造成嚴(yán)重干擾。因此，找到一種適合中華絨螯蟹卵巢蛋白樣品的制備方法很有必要。

本研究中，以成熟的中華絨螯蟹卵巢為材料，選擇3種樣品制備方法，通過比較蛋白提取量、SDS-PAGE條帶分布情況來分析并確定了適合中華絨螯蟹卵巢總蛋白樣品的制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用中華絨螯蟹雌蟹于2014年12月購于上海市崇明縣養(yǎng)殖基地。選擇體質(zhì)量為100～150 g、四肢健全且性成熟的個體50只，在冰上迅速解剖，取其卵巢組織放入1.5 mL的離心管中，經(jīng)液氮冷凍后立即放入超低溫冰箱 （-80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 中華絨螯蟹卵巢蛋白樣品的提取

（1）裂解液法Ⅰ。取0.1 g中華絨螯蟹卵巢組織，加入1 mL裂解液 （50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1％TritonX-100，1 mmol/L EDTA，100μg/mL PMSF，pH 7.4），冰上使用高速勻漿機勻漿至卵巢組織完全破碎 （30 s/次，共3次），勻漿后的樣品在4℃下以10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，每200μL分裝于1.5 mL離心管中。

（2）裂解液法Ⅱ。取0.1 g中華絨螯蟹卵巢組織，加入1 mL裂解液 （同裂解液法Ⅰ配方），冰上使用高速勻漿機勻漿至卵巢組織完全破碎 （30 s/次，共3次），勻漿后的樣品在4℃下攪拌2 h后，以10 000 r/min高速離心10 min，吸取上清液，每200μL分裝于1.5 m L離心管。

（3）TCA/丙酮沉淀法。參考文獻(xiàn)［7］中的方法，取0.1 g中華絨螯蟹卵巢組織，加入1 mL預(yù)冷的20％TCA/丙酮 （含20 mmol/LDTT），冰上使用高速勻漿機勻漿至均勻 （30 s秒/次，共3次），靜置30 min后，4℃下用冷凍離心機以15 000 r/min離心20 min，去除上清液，沉淀分別用80％丙酮和100％丙酮各振蕩洗滌2次 （4℃下以15 000 r/min離心10 min），沉淀、室溫干燥后，加入10倍量裂解液 （同裂解液法Ⅰ配方），冰上高速勻漿混勻，在4℃下攪拌過夜后，以12 000 r/min離心30 min。吸取上清液，每200μL分裝于1.5 mL離心管中。

用3種蛋白樣品提取方法分別重復(fù)操作3次，制備3份樣品。取每次操作中200μL樣品，按1∶1比例加入等量上樣緩沖液 （0.125 mol/L pH為6.8的Tris-HCl，25％的甘油，3％SDS，0.002％ BPB，50 mmol/L DTT）混合，混合后的樣品經(jīng)100℃煮沸，變性5 min，供SDS-PAGE使用。其余樣品置于冰箱 （-80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白樣品濃度的測定 使用Bio-Rad公司的RC DC Protein Assay試劑盒進(jìn)行測定，此試劑盒在還原劑和表面活性劑存在的情況下仍然可以準(zhǔn)確地測定蛋白的濃度［8］。測定過程中，以牛血清白蛋白 （BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在750 nm處測量蛋白樣品的吸光值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用該曲線計算出試驗用蛋白樣品的蛋白濃度。

1.2.3 SDS-PAGE電泳檢測 根據(jù)各試驗需要，選擇不同的上樣量，使用12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳參數(shù)為20 mA/膠。電泳結(jié)束后，用CBB-G250染色，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，用ATTO CSAnalyzer Verbal 3.0軟件得到蛋白條帶的相對分子質(zhì)量及灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗至少重復(fù)3次。在統(tǒng)計分析前所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗。如不滿足正態(tài)性分布，則通過Kruskal-Wallis Test進(jìn)行評估檢驗。采用 JMP 10.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 用3種方法提取的蛋白樣品的蛋白濃度

從圖1可見：用裂解液法Ⅰ、裂解液法Ⅱ、TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白樣品的平均蛋白濃度分別為15.59、13.05、0.65 mg/mL；用裂解液法Ⅰ與裂解液法Ⅱ提取的蛋白樣品的蛋白濃度無明顯差異 （P＞0.05），均顯著高于用TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白樣品的蛋白濃度 （P＜0.05）。

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異 （P＜0.05），標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異 （P＞0.05）Note：Themeans with different letters are significant differences at the 0.05 probability level，and the means with the same letters are not significant differences圖1　用3種方法提取的卵巢蛋白樣品的蛋白濃度Fig.1 Protein concentration of sam p les p repared bythe threemethods

2.2 SDS-PAGE電泳的最佳上樣量

使用裂解液法Ⅱ提取的蛋白樣品，加入不同上樣量后，經(jīng)SDS-PAGE電泳所得結(jié)果如圖2所示。從圖2可見：同一樣品在上樣量為5μg時，SDSPAGE圖譜中可見3條明顯的蛋白條帶和少量其他蛋白條帶；當(dāng)上樣量增加到15μg時，圖譜中3條蛋白條帶的量明顯增加，并有少量其他蛋白條帶出現(xiàn)；當(dāng)上樣量從15μg增加到30μg時，圖譜中各蛋白條帶無明顯差異，但當(dāng)上樣量為30μg時，在濃縮膠與分離膠交界處有樣品殘留的現(xiàn)象出現(xiàn)（圖中箭頭所示）。根據(jù)試驗結(jié)果，可得出最佳上樣量為15μg。

2.3 用3種方法提取的蛋白樣品的SDS-PAGE

用3種方法所提取的蛋白樣品的SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示。從SDS-PAGE膠上可看出，用3種方法提取的蛋白樣品的蛋白條帶組成存在明顯的差異，其中用裂解液法Ⅰ和裂解液法Ⅱ提取的蛋白樣品呈現(xiàn)的條帶組成基本相似，但后者的條帶濃度明顯大于前者，而用TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白樣品的條帶非常少，肉眼僅可見兩條條帶。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；5～30分別為上樣量5、10、15、20、25、30μg的樣品；箭頭示殘留樣品Note：M，standard Marker；5-30，loading quantities of protein sample；the head arrow shows the residual sample圖2　同一樣品不同上樣量的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE map of the different loading quantity of sam p les

基于SDS-PAGE蛋白條帶，選擇最為明顯的A、B、C、D、E 5條蛋白條帶，使用ATTO CS Analyzer Verbal 3.0軟件檢測蛋白條帶的灰度值，其平均值如表1所示。分析A、B條帶發(fā)現(xiàn)，用裂解液法Ⅰ和裂解液法Ⅱ提取的蛋白樣品中均可檢測出這2條條帶，其中用裂解液法Ⅱ提取的蛋白樣品中A、B條帶的灰度值大于用裂解液法Ⅰ提取的蛋白樣品中A、B條帶的灰度值，而用TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白樣品中未檢測出這兩條條帶，A、B條帶的灰度值均為0。分析C、D、E條帶發(fā)現(xiàn)，用3種方法提取的蛋白樣品中均可檢測出這3條條帶。總體上看，用裂解液法Ⅱ提取的蛋白樣品中各條帶的灰度值大于用其他兩種方法提取的蛋白樣品中各條帶的灰度值，用TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白樣品中各條帶的灰度值最小。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1、4、7為用裂解法Ⅰ提取的3組蛋白樣品；2、5、8為用裂解液法Ⅱ提取的3組蛋白樣品；3、6、9為用TCA/丙酮沉淀法提取的3組蛋白樣品；箭頭A、B、C、D、E表示條帶；上樣量為15μgNote：M，standard Marker；1，4，7，the3 samples prepared using lysis solutionmethodⅠ；2，5，8，the3 samples prepared using lysis solution methodⅡ；3，6，9，the 3 samples prepared using TCA-acetone precipitation；the head arrows indicate the protein bands A，B，C，D and E；the loading quantities of protein samples are 15μg per lane圖3　用3種方法提取的蛋白樣品的SDS-PAGE圖譜比較Fig.3 SDS-PAGE m ap of the protein sam p les prepared by threemethods

表1　用3種方法提取的卵巢蛋白樣品的SDS-PAGE圖譜中蛋白條帶的灰度值Tab.1 Intensity value of p rotein bands in SDS-PAGE map of the ovary protein sam p les prepared by threemethods

3 討論

從蛋白濃度測定結(jié)果以及SDS-PAGE圖譜的結(jié)果綜合來看，用裂解液法Ⅰ提取的中華絨螯蟹卵巢蛋白含量最多，蛋白組成也較為豐富，但3次重復(fù)操作所提蛋白含量差異很大，在圖中形成較大的誤差范圍，說明此方法在實際操作時的隨機性很大，導(dǎo)致重復(fù)性不佳。其原因可能是由于裂解液法Ⅰ的裂解時間較短，在此時間內(nèi)卵巢蛋白沒有充分溶解，同時成熟卵巢中所含的大量脂肪也會影響蛋白的溶解程度。用裂解液法Ⅱ所提取的蛋白樣品的蛋白濃度雖低于用裂解液法Ⅰ，但SDS-PAGE圖譜中所呈現(xiàn)的蛋白組成與其相似，且蛋白條帶濃度要大于裂解液法Ⅰ，重復(fù)性也較好。形成這一結(jié)果的原因可能是由于裂解液法Ⅰ對樣品的裂解時間較短，在短時間內(nèi)多溶解了小分子的蛋白、肽或游離的氨基酸，而對大分子量蛋白的溶解性不好。蛋白含量測定試驗中通過試劑盒可以檢測出這些小分子蛋白，但在凝膠電泳試驗中，由于對可觀測到的蛋白分子量有一定的限制，故出現(xiàn)了裂解液法Ⅰ與裂解液法Ⅱ相比，所得蛋白含量高而電泳條帶濃度低的現(xiàn)象。另外，裂解液法Ⅱ在低溫攪拌2 h的過程中，有部分蛋白可能發(fā)生了降解現(xiàn)象，從而影響了蛋白定量的結(jié)果。通常在蛋白樣品提取制備以及保存的過程中，蛋白酶的存在可能導(dǎo)致樣品中蛋白發(fā)生不同程度的降解。自然界中，根據(jù)蛋白酶活性中心的不同，可將其分為4大類，分別為絲氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、巰基蛋白酶和金屬蛋白酶［9］。在本研究中，中華絨螯蟹生活在天然水體中，而天然水體多為中性偏弱堿性，此環(huán)境下絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶具有活性，可能降解相關(guān)蛋白。因此，筆者在蛋白樣品提取的裂解液中，加入了代表性的絲氨酸酶抑制劑PMSF和金屬蛋白酶抑制劑EDTA。根據(jù)試驗結(jié)果，用裂解液法Ⅱ提取的蛋白量略少于裂解液法Ⅰ，其原因可能是由于在裂解液中，添加的兩種蛋白酶抑制劑PMSF和EDTA濃度略低，無法完全抑制樣品中某些蛋白的降解；或是由于其余兩大類的蛋白酶巰基蛋白酶和酸性蛋白酶發(fā)揮了作用，促使某些蛋白發(fā)生降解現(xiàn)象。為避免此情況再次出現(xiàn)，筆者考慮在之后的研究中，裂解液中添加4類蛋白酶抑制劑混合物，并在允許范圍內(nèi)加大各蛋白酶抑制劑的濃度。

TCA/丙酮沉淀法是傳統(tǒng)的蛋白提取方法之一，其特點是在樣品的提取過程中可以有效地去除樣品中的鹽離子、脂類、核酸等干擾物。然而在本試驗中，用TCA/丙酮沉淀法所提取的中華絨螯蟹卵巢蛋白含量最少，且蛋白組成單一，甚至連成熟卵巢中蛋白含量最高的卵黃蛋白都未能提取出來。分析其原因，可能是由于蛋白沉淀后再溶解較為困難；或是方法中的多次洗滌降低了蛋白的豐度［7］。故TCA/丙酮沉淀法不適合中華絨螯蟹卵巢蛋白樣品制備以及后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

綜上所述，本試驗中3種蛋白樣品制備方法中，裂解液法Ⅱ可較好地提取蛋白樣品，且重復(fù)性好，比較適合后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。本研究結(jié)果對于今后通過蛋白質(zhì)組學(xué)手段研究中華絨螯蟹卵巢發(fā)育成熟機制具有重要的理論意義。

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Comparative extraction of total proteins in ovary of Chinesem itten handed crab Eriocheir sinensis by differentm ethods

LIANG Xiao，ZHANG Xian，YAN Ying-peng，LIU Zhi-qiang，QIU Gao-feng
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

Abstract：The extraction effects of two lysis buffermethods and trichloroacetic acid/acetone precipitation method on total proteins in ovary of China mitten crab handed Eriocheir sinensis were comparatively studied for the proteomics by RC DC protein assay in order to search for the optimal extractionmethod to detect the protein level，and the protein composition was analyzed by SDS-PAGE.The results showed that the protein concentration was 15.59 mg/mL and 13.05 mg/mL by lysis buffermethods and 0.65 mg/mL，by trichloroacetic acid/acetone precipitation method，indicating better by lysis buffer methods than by trichloroacetic acid/acetone precipitation.The SDSPAGE maps analysis revealed that the sample extracted by lysis buffer methodⅡshowed more protein bands，and had high reproducibility.The findings indicate that lysis buffermethodⅡis the bettermethod for the proteomics of ovary proteins in Chinamitten handed crab，providing a reference for proteomics of Chinamitten handed crab.

Key words：Eriocheir sinensis；ovary；protein；extraction method；SDS-PAGE

中圖分類號：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.013

文章編號：2095-1388（2016）02-0190-04

收稿日期：2015-05-19

基金項目：上海海洋大學(xué)博士啟動基金資助項目；國家自然科學(xué)基金資助項目 （41476130）；上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項目

作者簡介：梁簫 （1983—），女，博士，講師。E-mail：x-liang@shou.edu.cn

通信作者：邱高峰 （1965—），男，教授。E-mail：gfqiu@shou.edu.cn